徐新娟 王士洲 黃忻濤 閆青云 王 策

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原 030000；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，山西太原 030000

顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）是指因各種外來因素直接或間接作用于頭部,如交通事故、高處墜落、跌倒等，從而引起的一系列癥狀，包括腦震蕩、腦出血、腦挫裂傷甚至腦疝形成。TBI 不僅在創(chuàng)傷外科中很常見，而且具有起病急，致殘率、致死率高和預(yù)后不良等特點。格拉斯哥昏迷評分（Glasgow coma scale，GCS）、臨床癥狀及影像學(xué)表現(xiàn)和格拉斯哥預(yù)后評分（Glasgow outcome scale，GOS）是TBI 患者損傷嚴(yán)重程度和預(yù)后的評估指標(biāo)。雖部分輕度TBI 患者在沒有任何醫(yī)療干預(yù)的情況下可以在損傷后的幾周至幾個月內(nèi)康復(fù)，但仍有30%～53%個體會受到創(chuàng)傷的影響，甚至可能在損傷后至少1 年仍出現(xiàn)情緒、精神等癥狀[1]，目前這種現(xiàn)象被稱之為“腦震蕩后綜合征”。因輕度TBI 患者的臨床表現(xiàn)及影像學(xué)表現(xiàn)不典型，易出現(xiàn)誤診、漏診等現(xiàn)象，雖是非致命性的，但會出現(xiàn)認(rèn)知行為的改變進(jìn)而影響患者日常生活及工作[2]。

美國路易斯安那州立大學(xué)DiGiorgio 等[3]在回顧性研究中，指出酒精和藥物會干擾對于TBI 患者的GCS 評分結(jié)果，從而影響臨床決策、療效評估及預(yù)后分析。為提高對TBI 患者的即時診斷、精準(zhǔn)預(yù)測預(yù)后、改善疾病轉(zhuǎn)歸，近年來出現(xiàn)了新的研究思路，即通過測定血清中外泌體（exosome，EXO）微小RNA（miRNA）的含量，來診斷評估疾病的嚴(yán)重程度、預(yù)測轉(zhuǎn)歸、監(jiān)測疾病進(jìn)展。

1 TBI 的流行病學(xué)特點及目前現(xiàn)狀

TBI 是全球性的公共衛(wèi)生問題，是死亡率和殘疾率高的主要原因之一。Prins 等[4]調(diào)查研究顯示，在美國TBI 的發(fā)病率為（200～558）/10 萬。TBI 資料庫的統(tǒng)計結(jié)果顯示，47 所醫(yī)院中約有13 000 多例TBI 住院患者，其中重度TBI 患者死亡率＞20%、嚴(yán)重致殘率＞50%[5]。

TBI 治療的關(guān)鍵是防治繼發(fā)性的級聯(lián)損傷，以重度與極重度TBI 患者為主。在腦疝發(fā)生以前行有效的手術(shù)治療，可有效降低病死率、緩減致殘率[6]。近年來，隨著各項科研成果的臨床應(yīng)用及相關(guān)共識、指南等頒布實施，診治療效逐步提高，但是對于重型TBI 患者的及時診斷仍存在差異，尋找明確的生物標(biāo)志物定量預(yù)測腦組織的損傷程度及監(jiān)測病情，已成為神經(jīng)外科醫(yī)師進(jìn)一步研究的方向。

2 TBI 后的病理生理變化

TBI 患者早期以急性損傷為主，后期表現(xiàn)為慢性退行性癥狀，如認(rèn)知功能、運動功能障礙，伴隨抑郁、焦慮等情緒變化。腦損傷后局部腦組織和神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)歷缺血缺氧、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和組織壞死等多種病理變化過程，這些因素及其潛在的分子機制形成了一個復(fù)雜而有序的網(wǎng)絡(luò)，貫穿于TBI的整個過程。炎癥反應(yīng)和血管新生是造成TBI 患者繼發(fā)性級聯(lián)損傷的關(guān)鍵，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷的核心細(xì)胞[2]。神經(jīng)炎癥反應(yīng)包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的啟動，外周免疫細(xì)胞的募集和炎癥介質(zhì)的釋放，這些反應(yīng)不僅誘發(fā)繼發(fā)性腦損傷，而且影響組織修復(fù)。

局部腦組織損傷后，不僅釋放大量炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致血管通透性增加，破壞血腦屏障，還引起彌漫性腦損傷，腦水腫，神經(jīng)元凋亡、壞死，導(dǎo)致神經(jīng)功能減退[7]。

3 EXO 的生理學(xué)特點及其形成

EXO 是由肥大細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、B 細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌釋放的直徑為30～150 nm 的納米級磷脂雙層膜包裹的囊泡[8]。外泌體通過在原細(xì)胞和靶細(xì)胞之間傳遞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和基因組分子（如DNA、miRNA、siRNA 等）來介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊，在不同細(xì)胞之間的通訊中起著至關(guān)重要的作用。脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)保護(hù)其內(nèi)容物免于降解，可存儲于幾乎所有體液中[9]，包括血液、尿液、唾液、腦脊液等，具有反映親代細(xì)胞微環(huán)境的重要信息，作為非侵入性早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，引起研究者越來越多的關(guān)注。

EXO 潛在的臨床價值歸因于其低免疫原性、半衰期長和可穿透血腦屏障。外泌體的發(fā)現(xiàn)最早可追溯于20 世紀(jì)80 年代，由Pan 等[10]將網(wǎng)織紅細(xì)胞用轉(zhuǎn)鐵蛋白受體標(biāo)記并培養(yǎng)以觀察轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的作用，發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記受體被原細(xì)胞吞飲，然后以囊泡形式所釋放。這些囊泡最初被認(rèn)為是細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。后來，Pan 等[10]稱其為“外泌體”。

EXO 的形成過程：原細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷吞噬自身細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)（mRNA、miRNA、DNA、蛋白等）形成早期膜內(nèi)體，早期膜內(nèi)體成熟后形成晚期膜內(nèi)體，并通過微粒體膜內(nèi)陷脫落形成多囊泡體（multivesicular bodies，MVB），MVB 與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合并將其釋放到細(xì)胞外，從而形成EXO。EXO 攜帶有原細(xì)胞的遺傳物質(zhì)和調(diào)節(jié)蛋白，靶向作用于受體細(xì)胞，可改變受體細(xì)胞的表征[11]。

過去，人們一致認(rèn)為EXO 是細(xì)胞碎片，細(xì)胞代謝物的處理場所。后來，有研究者發(fā)現(xiàn)，EXO 具備免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥反應(yīng)的功能。自此，研究者們開始提出大量有關(guān)EXO 及其內(nèi)容物的課題想法，并且發(fā)現(xiàn)EXO 不僅在正常生理過程中，如免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)、細(xì)胞增殖及神經(jīng)元的功能中發(fā)揮著不可替代的作用，而且在疾病病理變化的不同階段，如神經(jīng)退行性疾病和腫瘤相關(guān)疾病中行使其作用。EXO 是由不同細(xì)胞所產(chǎn)生的，在臨床中，是極其重要的確診和治療方式。目前，研究者們已開發(fā)出多種方法來分離、提純EXO 亞基，并且多項研究已顯示EXO 中不同亞基組合可在同種細(xì)胞中執(zhí)行不同的任務(wù)[8,12]。

4 TBI 患者體內(nèi)EXO miRNA 的變化

EXO 中包含有多種RNA，其中mRNA、miRNA 是最豐富的物種，存在于EXO 的內(nèi)部。外泌體釋放的miRNA 不僅反應(yīng)原細(xì)胞生物學(xué)功能，而且作用于下游靶基因，調(diào)控受體細(xì)胞的病理生理學(xué)功能。

miRNA 是由20～25 個核苷酸組成的小的非編碼單鏈核酸分子，稱為microRNA，通過與靶基因的mRNA 3’端的非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)域相結(jié)合而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與調(diào)控幾乎所有生物學(xué)過程。

TBI 后損傷組織會經(jīng)歷一系列的病理生理變化，且在許多病理條件（如缺血缺氧、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等）下，血清中EXO miRNA 具有特征性改變，并被用作特定疾病的診斷標(biāo)志物[13]。不僅特異性用于癌癥的診斷、復(fù)發(fā)、監(jiān)測疾病進(jìn)展，而且是腦組織損傷時，是最具特異性、敏感性的標(biāo)志物[14]，同時又具非侵入性診斷的新型生物標(biāo)志物的潛力。以下主要從腦組織損傷后缺血缺氧性改變、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及可塑性作進(jìn)一步的闡述。

4.1 TBI 后局部的腦組織低灌注缺氧對于EXO miRNA 的影響

在TBI 后腦組織損傷過程中，多種EXO miRNA類型發(fā)生變化。通過調(diào)節(jié)其下游靶基因，參與缺血缺氧、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)元可塑性等過程，或減輕炎癥反應(yīng)，或加速級聯(lián)反應(yīng)，改善或加速神經(jīng)功能障礙。

miRNA-210、miRNA-21 是細(xì)胞對組織局部缺血缺氧反應(yīng)的主要參與者，具有促進(jìn)血管生成的作用，在TBI 后神經(jīng)功能恢復(fù)過程中起重要作用。Huang 等[15]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-210 的啟動子序列中含有低氧反應(yīng)元件。生理條件下miRNA-210 的過表達(dá)，會促使血管結(jié)構(gòu)的形成和血管內(nèi)皮生長因子（ascular endothelial growth factor，VEGF）誘導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)生遷移。研究顯示[16]，miRNA-21 可通過上調(diào)下游靶基因VEGF、血管生成素（Angiopoietin-1，Ang-1）和血管生成素受體（receptor of Ang-1）的表達(dá)促進(jìn)TBI 缺血病灶內(nèi)血管的生成。相反，miRNA 亦可加速缺氧性損傷，對于缺血小鼠腦組織的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155 可作用于靶基因促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，進(jìn)而導(dǎo)致腦缺血缺氧性損傷[17]。亦有研究顯示miR-497 可抑制靶基因bcl-2 和bcl-w 的表達(dá)，從而加劇缺血性病灶局部神經(jīng)元的死亡[18]。

4.2 EXO miRNA 在TBI 后細(xì)胞凋亡和神經(jīng)可塑性中的作用

EXO miRNA 不僅參與炎癥反應(yīng)、低灌注缺氧，而且在細(xì)胞凋亡和神經(jīng)可塑性的過程中起關(guān)鍵性作用。Ge 及其同事[16]分析了TBI 后miRNA-21 對于腦神經(jīng)功能的影響，結(jié)果顯示TBI 導(dǎo)致腦皮質(zhì)和同側(cè)海馬區(qū)中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡；而miRNA-21 在腦中的表達(dá)量的上調(diào)可以減輕神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。該團隊通過對培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMVEC）進(jìn)行刮擦建立損傷模型，從細(xì)胞層面觀察到BMVEC 中的miRNA-21 的表達(dá)水平增加，可有效減輕細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)[19]。

4.3 EXO miRNA 與TBI 炎癥的關(guān)系

miRNA 在細(xì)胞的興奮毒性、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥、細(xì)胞凋亡、腦水腫等多種病理生理變化過程起調(diào)控作用，提示其不僅可作為缺血性腦卒中的生物學(xué)標(biāo)志物[20]，而且可協(xié)助早期診斷、預(yù)測預(yù)后及成為新藥物的治療靶點。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致TBI 患者繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵因素，也是影響TBI 患者預(yù)后的主要原因[7]。血管內(nèi)皮細(xì)胞活化是炎癥反應(yīng)的主要部分，白細(xì)胞至內(nèi)皮細(xì)胞信號傳導(dǎo)對血管內(nèi)皮細(xì)胞活化具有重要作用。EXO miRNA 由受體細(xì)胞分泌，與靶細(xì)胞的受體配體結(jié)合并作用于靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的功能。

在所有EXO miRNA 中，miRNA-21、miR-124 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)較豐富的類型，在生理和病理條件下都具有調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞功能的潛力[21]。

TBI 后miRNA-21 的表達(dá)明顯上調(diào)，參與TBI 后組織損傷的多種病理過程?？勺鳛門BI 患者診斷及預(yù)后指標(biāo)的新型生物標(biāo)志物[22]。Fabbri 等[23]研究顯示，EXO miRNA-21 可以與巨噬細(xì)胞中的Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）8 結(jié)合，誘導(dǎo)TLR8 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，釋放炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α 和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）。

EXO miRNA-124 作為為腦組織特異性miRNA，不僅調(diào)節(jié)輔助T 細(xì)胞的分化，而且對于被活化的T 細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子也有調(diào)節(jié)作用，是TBI 患者免疫失衡的重要調(diào)節(jié)位點。重度TBI 患者血漿中miRNA-124 的表達(dá)較對照組明顯上調(diào)，與Treg 表達(dá)和IL-10呈正相關(guān)，調(diào)控炎癥反應(yīng)，可評估嚴(yán)重程度，具有成為預(yù)測TBI 預(yù)后的新型生物標(biāo)志物的潛力[24]。

Yang 等[25]通過觀察TBI 患者血清中miRNA 表達(dá)水平，評價miRNA 與患者病情的嚴(yán)重程度和臨床結(jié)果的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TBI 患者（即重度、中度和輕度TBI 患者）血清中miRNA-93、miRNA-191 和miRNA-499 也是TBI 診斷、評估嚴(yán)重程度和預(yù)測預(yù)后的具有潛在價值的指標(biāo)。Griffiths-Jones 等[26]研究發(fā)現(xiàn)血漿中不同miRNA 水平的變化可用來幫助確定TBI 的嚴(yán)重程度。研究顯示，TBI 可能與miRNA 表達(dá)譜的改變有關(guān)。因此，需要更多的臨床數(shù)據(jù)來證明EXOmiRNA 在TBI 中的生物學(xué)作用[27]。

細(xì)胞EXO 膜上包含的生物標(biāo)志物（miRNA、DNA 等）可以追蹤其原始細(xì)胞并確定與之相互作用的細(xì)胞[28-29]。加之具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，易于通過血腦屏障，具有相對的生物穩(wěn)定性，并能防止被血液和腦脊液內(nèi)容物所降解[30]。這些特征使其作為TBI 和與TBI 相關(guān)的動態(tài)病理生理過程的候選生物標(biāo)志物，以及作為輸送治療性分子的媒介具有一定優(yōu)勢。那么對于TBI 患者的準(zhǔn)確診斷和預(yù)測預(yù)后是否單一聯(lián)合較聯(lián)合多基因的特異性、敏感性更佳或聯(lián)合基因較單一基因的特異性、敏感性更佳呢？目前仍需要更多的研究來進(jìn)一步明確。

5 小結(jié)

TBI 患者腦組織局部損傷后會發(fā)生一系列的病理生理變化，與此同時，伴隨著多種生物分子學(xué)變化的過程。在TBI 的不同階段中，有不同的miRNA 參與不同的病理、分子機制。對于同一疾病同一機制中是否伴隨著多種miRNA 的變化，仍有待進(jìn)一步研究闡明。

EXO 作為一個新興的研究領(lǐng)域，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是腦組織損傷的生物學(xué)作用尤其重要，加之其在體內(nèi)存在的普遍性和易獲取的特性，已作為疾病診斷治療的新型有效方式。近年來，越來越多的研究證明EXO 是細(xì)胞間通訊、疾病診斷和預(yù)后循環(huán)生物標(biāo)志物的重要載體。目前國內(nèi)外相關(guān)研究仍局限于基礎(chǔ)階段，其在臨床實踐中的應(yīng)用由于缺乏大量的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證，引起廣大學(xué)者的關(guān)注，同時為TBI 研究者提供了新的研究思路。