羅子陽，閆徐,2，易靈，王超，段翰英*

1(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)2(長春工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，吉林 長春，130051)

蜂蜜是蜜蜂從開花植物的花蜜、分泌物或蜜露中提取的天然產(chǎn)物，經(jīng)過充分釀造而貯藏在胃中的天然甜物質(zhì)[1]。蜂蜜又是一種藥食同源的天然食品，它不僅能夠促進(jìn)組織生成、提高免疫力、潤肺治哮喘，還具有保護(hù)胃黏膜、輔助治療燒燙傷和潤腸通便等功效[2]。中國作為養(yǎng)蜂大國，蜂蜜產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的30%，也是最大的蜂蜜生產(chǎn)國和出口國[3]。

為延長蜂蜜保質(zhì)期，降低黏度，延緩結(jié)晶，常對蜂蜜采用熱處理方式加工[2,4]。然而加熱易造成蜂蜜品質(zhì)降低(如褐變、異味、營養(yǎng)損失)[5]、生物酶活性下降[4]。蜂蜜中的生物酶主要包括淀粉酶和蔗糖轉(zhuǎn)化酶，這兩種酶活性已作為蜂蜜新鮮度、品質(zhì)重要指標(biāo)[6]。同時(shí)，蜂蜜加熱甚至產(chǎn)生有害物質(zhì)，如5-羥甲基糠醛[5,7](5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF)。根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)，淀粉酶值和蔗糖轉(zhuǎn)化酶值分別必須在8和10以上[8]，5-HMF含量必須小于15 mg/kg[9]。因此，淀粉酶和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活力、5-HMF含量是評估蜂蜜的品質(zhì)、過熱處理和新鮮度的重要指標(biāo)[10]。

近年來非熱加工技術(shù)因其低溫下可達(dá)到殺菌、延長食品保質(zhì)期目的而在食品加工上逐漸得到重視。超高靜壓(high hydrostatic pressure, HHP)是非熱加工技術(shù)中較熱門的一種，指在常溫或較低溫度下，用100 MPa以上的壓力(100～1 000 MPa)來處理食品，以達(dá)到殺菌、滅酶和改善食品功能特性的加工技術(shù)[11]。HHP對化合物的共價(jià)鍵無影響，可以更好地保持食品原有的風(fēng)味、色澤和營養(yǎng)價(jià)值[12]。經(jīng)HHP處理的麥盧卡蜂蜜[11]和墨西哥百花蜜[12]，能有效滅活蜂蜜微生物并保持其品質(zhì)。另外HHP也能防止或最小化5-HMF的產(chǎn)生[7]。有關(guān)HHP對蜂蜜中酶的影響研究結(jié)果表明，HHP處理并未顯著造成麥盧卡蜂蜜[11]和克魯特蜂蜜[13]的淀粉酶活性變化(P>0.05)。但HHP對蜂蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化酶的影響還未見報(bào)道。

蜂蜜中單糖含量在70%以上，主要是果糖和葡萄糖，蔗糖的成分相對較少，不超過5%[14]。單糖含量會(huì)影響二羰基化合物的產(chǎn)生。二羰基化合物是一類典型的美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物，具有高度的活性，可降解為許多影響食品色香味的副產(chǎn)品[15-18]。因此，以二碳基化合物含量作為指標(biāo)能更好評估蜂蜜品質(zhì)[17]，而有關(guān)HHP對其影響的研究還相當(dāng)缺乏。

因此，本論文采用HHP不同壓力(300、450、600 MPa)和時(shí)間(5、10、20 min)處理蜂蜜，探討HHP對蜂蜜中的單糖含量、關(guān)鍵酶活性、5-HMF和二羰基化合物的影響，為蜂蜜的非熱加工工藝提供指導(dǎo)，為拓展HHP在蜂蜜加工中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝蜂蜜，廣州從化溫泉國強(qiáng)峰嘜養(yǎng)蜂場。

碘、碘化鉀、氯化鈉、醋酸鈉、冰醋酸、可溶性淀粉、氫氧化鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸氫鈉、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、甲酸、鄰苯二胺、二亞乙基三胺五乙酸、碳酸鈉、乙酸鋅、石油醚(沸程30～60 ℃)、甲醇、Carrez試劑 Ⅰ 三水合亞鐵氰化鉀、Carrez試劑 Ⅱ ZnSO4·7H2O、磷酸鈉均為分析純；果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖純度均為99%；乙腈(色譜純)；5-HMF、3-脫氧葡萄糖醛酮(3-deoxyglucosone，3-DG)標(biāo)品純度為99.99%，以上均購于廣州東巨實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇宏華儀器廠；AR2140 電子分析天平，美國奧豪斯公司；CQC-2L-600 MPa HHP設(shè)備，北京速原中天科技股份有限公司；EL104型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；SB-5200D75超聲儀，寧波新芝超聲設(shè)備有限公司；JB-2恒溫磁力攪拌器，上海雷茲新經(jīng)儀器公司；Sorvall ST 16R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾有限公司；LC-20AD高效液相色譜儀(配置四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、PDA檢測器)、UV-1750紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；Waters Xevo TQD/PDA ACQUITY UPLC 液質(zhì)聯(lián)用儀，配置電噴霧離子化源(ESI 源)、Waters溶劑管理系統(tǒng)、Waters四元高壓混合泵及前置真空泵、MasslynxV4.1數(shù)據(jù)系統(tǒng)，Waters公司。

1.3 蜂蜜HHP處理

取適量蜂蜜置于軟性塑料熱封袋內(nèi)，采用真空封口機(jī)對其進(jìn)行抽真空和封裝處理后，分別置于高壓300、450、600 MPa保壓處理5、10、20 min，樣品卸壓后，從高壓槽中取出，立即放于冰水浴中冷卻后置于4 ℃條件下直到檢測。以未處理的蜂蜜作為對照。

1.4 蜂蜜中果糖、葡萄糖和蔗糖的測定

采用高效液相色譜-示差折光檢測法(HPLC-refractive index detector，HPLC-RID)對蜂蜜中的果糖、葡萄糖含量進(jìn)行測定[19]。樣品用水溶解，乙腈定容后，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，液相色譜-示差折光檢測器測定，外標(biāo)法定量。

流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=7∶3組成；流動(dòng)相流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL；示差折光檢測器條件：溫度40 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器條件：飄移管溫度80～90 ℃；氮?dú)鈮毫?50 kPa；撞擊器：關(guān)。分別制備1 000、500、400、200、100、40 μg/mL的果糖、葡萄糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)測定，標(biāo)準(zhǔn)果糖、葡萄糖和蔗糖的出峰時(shí)間分別為6.80、7.74、11.12 min(圖1)。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣品中單糖含量進(jìn)行測定。

圖1 果糖、葡萄糖和蔗糖的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射色譜圖Fig.1 HPLC-RID results of standard fructose, glucose and sucrose

1.5 蜂蜜中關(guān)鍵酶活性的測定

1.5.1 淀粉酶活力的測定

根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18932.16—2003采用分光光度法測定[20]。將蜂蜜稀釋液置于(40±0.2) ℃水浴中, 15 min后加入1%(質(zhì)量濃度)淀粉溶液使其在淀粉酶的作用下水解, 并開始計(jì)時(shí), 每隔5 min取一定量此溶液, 加入碘溶液使剩余的淀粉顯色。用分光光度計(jì)測量光密度值，待光密度值降低到0.235所需時(shí)間來計(jì)算淀粉酶值。

蜂蜜的淀粉酶酶值是指1 g蜂蜜所含淀粉酶在一定條件下可轉(zhuǎn)化1%淀粉溶液的體積，單位為mL/(g·h)。

1.5.2 蔗糖轉(zhuǎn)化酶活力的測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法[21]，將蜂蜜蔗糖混合液于45 ℃水浴鍋中水浴1 h進(jìn)行轉(zhuǎn)化，分別取轉(zhuǎn)化前和轉(zhuǎn)化后的蜂蜜蔗糖混合溶液各1 mL移入25 mL容量瓶中，加入3，5-二硝基水楊酸溶液2 mL，沸水浴3 min顯色，冷卻后定容。用分光光度儀在520 nm處測定。

蔗糖轉(zhuǎn)化酶酶值是指在1 g蜂蜜的作用下，在 1 h內(nèi)能使蔗糖轉(zhuǎn)化為單糖的質(zhì)量，單位為mg/(g·h)。

1.6 蜂蜜中5-HMF的測定

5-HMF的測定采用高效液相色譜-二極管矩陣檢測器方法測定[22]。HPLC條件：流動(dòng)相：(A)水相0.1%甲酸水溶液和(B)有機(jī)相乙腈溶液，以V(A)∶V(B)=30∶70實(shí)行等度洗脫。流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測器PDA；檢測波長250 nm；色譜柱Waters XTerra RP-18(250×4.6 mm, 5 μm)。

制備質(zhì)量濃度為120、100、23、10、4.8和0.96 mg/mL的5-HMF標(biāo)準(zhǔn)溶液，以5-HMF濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=71 426x+604.29,R2=0.998 5)，進(jìn)行樣品中5-HMF含量的測定。

1.7 蜂蜜中二羰基化合物的測定

首先對蜂蜜樣品中的二羰基化合物采用超高壓液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行分析和鑒定[23]。樣品提取液經(jīng)11 mmol/L二亞乙基三胺五乙酸水溶液(含20%鄰苯二胺溶液)衍生后，采用高效液相色譜法顯示只含有一種二羰基化合物(圖2)，經(jīng)ESI一級(jí)全掃描質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+顯示分子量為235的物質(zhì)(圖3)，確定該二羰基化合物為3-DG。最后配制5、2.5、1.25、0.62和0.31 mg/mL的3-DG標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)衍生后充分混勻靜置2 h，過濾后進(jìn)行HPLC的定量，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到3-DG標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=106x+681 268,R2=0.997 7)，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品中3-DG含量。

圖2 蜂蜜中二碳基化合物衍生物高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the dicarbonyl derivatives of honey

圖3 二羰基化合物衍生物質(zhì)譜圖Fig.3 The MS result of dicarbonyl compound

UPLC-TOF-MS質(zhì)譜條件：流動(dòng)相使用1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液(A)和1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸的甲醇溶液(B)的梯度混合物；流動(dòng)相流速：1.0 mL/min；梯度混合物從30%B開始并在10 min內(nèi)增加至60%B，然后在2 min內(nèi)降至30%B，并且30%B保持3 min，色譜運(yùn)行在15 min內(nèi)完成；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測器二極管陣列檢測器；檢測波長254 nm；色譜柱Waters XTerra RP-18；電噴霧離子源(ESI源)，正離子模式，毛細(xì)管噴霧電壓為3.5 kV，脫溶劑氣溫度為550 ℃。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，用Minitab 17.0軟件進(jìn)行Turkey多重差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，采用Excel軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HHP對蜂蜜中果糖和葡萄糖含量的影響

本文荔枝蜂蜜的果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為(50.5±0.8)%(圖4)，高于棗花蜜、椴樹蜜[24]和墨西哥的百花蜜[17]報(bào)道的21%～46%，但葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為(37.1±0.9)%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致34%～46%[17,24]。蜂蜜中糖含量與蜂蜜來源和產(chǎn)地高度相關(guān)，還受天氣、加工以及貯藏等因素影響，因此造成不同蜂蜜中糖含量的差異[25]。

蜂蜜經(jīng)HHP處理后果糖、葡萄糖的含量見圖4。HHP并未對蜂蜜中果糖和葡萄糖含量產(chǎn)生影響，證實(shí)了LEYVA-DANIEL等[12]的結(jié)果，600 MPa (2～15 min)處理未影響墨西哥百花蜜中單糖含量。果糖的含量是影響蜂蜜甜度與結(jié)晶的原因之一，生產(chǎn)上常用果糖與葡萄糖的比率(F/G)評價(jià)蜂蜜易結(jié)晶的程度，當(dāng)F/G<1.11時(shí)結(jié)晶速率加快，>1.33時(shí)則結(jié)晶較緩慢[26]。本文所有樣品的F/G在1.35～1.39，說明該蜂蜜結(jié)晶程度緩慢且HHP并未改變其結(jié)晶趨勢。

圖4 HHP對蜂蜜中果糖和葡萄糖含量的影響Fig.4 The effect of HHP on the content of fructose and glucose in honey注：圖中橫坐標(biāo)0～9分別表示對照、300 MPa-5 min、300 MPa-10 min、300 MPa-20 min、450 MPa-5 min、450 MPa-10 min、450 MPa-20 min、600 MPa-10 min、600 MPa-10 min、600 MPa-20 min(下同)

2.2 HHP對蜂蜜中淀粉酶和蔗糖轉(zhuǎn)化酶酶活的影響

HHP不同壓力、時(shí)間下對蜂蜜淀粉酶活性的影響見圖5。結(jié)果表明，HHP處理造成了淀粉酶活性不同程度的下降。當(dāng)壓力300 MPa，保壓時(shí)間5、10和20 min時(shí)，淀粉酶活性分別損失了11.6%、20.7%和25.3%。當(dāng)時(shí)間為5 min，壓力在300、450和600 MPa時(shí)，活性分別損失了11.6%、25.2%和30.5%。最高酶活損失(40.4%)出現(xiàn)在600 MPa-20 min，為17.1，仍遠(yuǎn)高于8，符合國標(biāo)要求。

進(jìn)一步對圖5數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，在顯著性水平α=0.05下，發(fā)現(xiàn)壓力和時(shí)間對淀粉酶活性都具有顯著性影響(P=0.000)。目前有關(guān)HHP對蜂蜜淀粉酶活性的影響還存在爭議。墨西哥百花蜜經(jīng)600 MPa處理，發(fā)現(xiàn)2～12 min內(nèi)淀粉酶活性顯著下降，然而當(dāng)時(shí)間延長到15 min，其活力與對照未見顯著差異[12]。麥盧卡蜂蜜經(jīng)100～800 MPa處理15～120 min未見對其淀粉酶活性產(chǎn)生顯著差異(P>0.05)[11]?？唆斕胤涿劢?jīng)200和600 MPa 處理后，發(fā)現(xiàn)600 MPa能提高淀粉酶活力，且壓力和保壓時(shí)間對酶活性影響均不顯著(P>0.05)[13]。多項(xiàng)研究表明，食品中酶活受到HHP壓力、時(shí)間以及食品種類影響，可能會(huì)使其增強(qiáng)或鈍化[27]，因此，有關(guān)HHP對蜂蜜中淀粉酶活的影響有待于開展更多的研究。

A-淀粉酶活力；B-蔗糖轉(zhuǎn)化酶活力圖5 HHP處理對蜂蜜中淀粉酶和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活的影響Fig.5 Effect of HHP on diastase and sucrose invertase activity in honey注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

HHP對蜂蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的影響見圖5。隨著壓力的增加和作用時(shí)間的延長，蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活力呈較緩和的下降趨勢。在300 MPa，經(jīng)5，10 和20 min處理，蜂蜜中的蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性分別損失了17.2%、16.7%和22.5%，處理時(shí)間未造成顯著性差異；在450 MPa，經(jīng)5、10和20 min 處理，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性分別損失了26.1%、32.4%和40.1%。最大的蔗糖轉(zhuǎn)化酶活力損失(56.3%)出現(xiàn)在600 MPa-20 min。進(jìn)一步對蜂蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性隨HHP壓力和處理時(shí)間的變化進(jìn)行方差分析，在顯著性水平α=0.05下，2個(gè)因素(壓力和時(shí)間)對蔗糖轉(zhuǎn)化酶活都具有顯著性影響(P=0.000)。

雖然目前有關(guān)HHP對蜂蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性影響未見報(bào)道，但有研究指出，蔗糖轉(zhuǎn)化酶的活性受到糖的種類和含量以及食品介質(zhì)成分的影響。純化的芒果蔗糖轉(zhuǎn)化酶在120 g/L蔗糖溶液中經(jīng)600 MPa(30 min, 50 ℃)處理后其活性僅保留26%，在6、60 g/L蔗糖溶液和6～120 g/L的海藻糖溶液中則完全失活。不同酯化度和濃度的果膠溶液對芒果蔗糖轉(zhuǎn)化酶酶活性的影響也會(huì)產(chǎn)生差異[28]。另外酸性環(huán)境(pH 3～4)和牛血清白蛋白對純化芒果蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性有保護(hù)作用[28]。因此，HHP對蜂蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化酶的影響也可能會(huì)受到蜂蜜品種、成分等影響，有待于進(jìn)一步深入研究。

2.3 HHP對5-HMF的影響

將蜂蜜采用HHP處理后其5-HMF含量見圖6。對照和HHP處理的蜂蜜5-HMF值在1.2 mg/kg左右，遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的15 mg/kg，符合要求。經(jīng)HHP處理后除450 MPa-20 min和600 MPa-5 min未造成顯著變化，其余均有降低。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的一致。在采用600 MPa (2～15 min)處理墨西哥百花蜜后，5-HMF 含量有一定下降，介于6.9～7.2 mg/kg[12]。用100～800 MPa處理麥盧卡蜂蜜15～120 min后5-HMF含量未顯著變化[11]。雖然也有研究發(fā)現(xiàn)HHP使土耳其蜂蜜中5-HMF含量分別增加12%和11%，但對比傳統(tǒng)加熱方式其增加幅度變小[7]。說明HHP不會(huì)促使5-HMF生成甚至有抑制的作用，這可能與HHP對美拉德反應(yīng)有抑制作用相關(guān)[29-30]。

圖6 HHP對5-HMF含量的影響Fig.6 The effect of HHP on 5-HMF content

2.4 HHP對二羰基化合物的影響

蜂蜜中二羰基化合物主要包括乙二醛(glyoxal，GO)、甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)、3-DG等幾種[15,31]。經(jīng)測定，本文蜂蜜對照樣品中的二羰基化合物主要是3-DG，含量為251.2 mg/kg，這與文獻(xiàn)結(jié)果一致[31-32]。3-DG是葡萄糖降解的初級(jí)產(chǎn)物，也是產(chǎn)生5-HMF的主要前體物質(zhì)[33]，其含量受到蜂蜜品種、產(chǎn)地、溫度、貯藏時(shí)間等影響[34]。3-DG之后可繼續(xù)分解為MGO和GO[31]，GO和3-DG產(chǎn)生的“羰基脅迫”可能是藥用蜂蜜的主要?dú)⒕蜃覽35]，MGO含量與麥盧卡蜂蜜的抗炎活性呈現(xiàn)很強(qiáng)的相關(guān)性[36]。因此，3-DG的含量與蜂蜜品質(zhì)及其功能性密切相關(guān)。

經(jīng)HHP處理后3-DG含量變化見圖7，可見HHP顯著增加了3-DG的濃度，增加幅度為22.3%～31.2%，其中450 MPa-20 min時(shí)最高(329.72 mg/kg)。雖然有關(guān)HHP對二羰基化合物的影響還未見報(bào)道，但有研究指出在100～800 MPa(15 min)，隨著壓力增加，MGO含量呈線性增加，推測HHP可造成二羰基化合物的積累[11]。那么相對于傳統(tǒng)加熱方式易造成3-DG損失，HHP更有效地保證了蜂蜜的品質(zhì)。

圖7 HHP對蜂蜜中3-DG含量的影響Fig.7 The effect of HHP on the content of 3-DG

3 結(jié)論

本文探討了HHP對蜂蜜中關(guān)鍵品質(zhì)指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，蜂蜜中果糖和葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(50.5±0.8)%和(37.1±0.9)%，HHP未對其含量產(chǎn)生影響，F(xiàn)/G在1.35～1.39，說明該蜂蜜結(jié)晶程度緩慢且HHP并未改變其結(jié)晶趨勢。HHP處理造成了蜂蜜中淀粉酶和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的下降，分別損失了17.1%～40.4%和17.2%～56.3%，壓力和時(shí)間對2種酶活都具有顯著性影響(P>0.05)。在最大的加壓處理?xiàng)l件下(600 MPa，20 min)，關(guān)鍵酶活性指標(biāo)仍符合國際標(biāo)準(zhǔn)甚至處于較高水平。蜂蜜中5-HMF含量在(1.12±0.04)mg/kg，遠(yuǎn)低于國際標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的15 mg/kg，經(jīng)HHP處理后除450 MPa-20 min和600 MPa-5 min未造成顯著變化，其余均有降低。3-DG是本文蜂蜜中主要的二羰基化合物，HHP可顯著增加其濃度，幅度為22.3%～31.2%。根據(jù)已報(bào)道的HHP對麥卡盧蜂蜜的滅菌結(jié)果，500 MPa(20 min)的處理對金黃色葡萄球菌的滅活作用顯著，且滅活作用隨壓力、時(shí)間增加而增加[11]。綜上所述，HHP以非熱的形式加工處理在保存蜂蜜品質(zhì)和新鮮度方面具有較大優(yōu)勢，且能有效滅菌，值得進(jìn)一步研究和應(yīng)用。