(濰坊海關(guān),濰坊 261041)

果蔬脆片是以蔬菜、水果為主要原料,經(jīng)過(guò)真空油炸生產(chǎn)制作的食品,其制作工藝最大程序地保存了果蔬的原味和營(yíng)養(yǎng)成分,被認(rèn)為是一種綠色食品,深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。由于經(jīng)過(guò)了植物油油炸過(guò)程,果蔬脆片中的含油量一般在20%以上。油脂在高溫重復(fù)使用時(shí)會(huì)產(chǎn)生苯并芘,如果使用這類(lèi)植物油炸制果蔬脆片,其中的苯并芘會(huì)隨著油炸過(guò)程遷移到果蔬脆片中。苯并(a)芘是常見(jiàn)的苯并芘,由5個(gè)苯環(huán)組成,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定難以降解,屬于高致癌物和突變?cè)?。?dòng)物試驗(yàn)證明,苯并(a)芘具有致癌、致畸和致突變性,其在食品、油脂、水體和土壤中廣泛存在[1]。文獻(xiàn)[2]對(duì)市售的50 種不同植物油進(jìn)行檢測(cè),在18個(gè)樣品中檢出苯并(a)芘,檢出率高達(dá)36%,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.69～31.72μg·kg－1。2019年7 月和8月,韓國(guó)食品藥品安全處分別因苯并(a)芘超標(biāo)問(wèn)題[韓國(guó)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定苯并(a)芘限量為10μg·kg－1],命令日本HATANO SUISAN 公司停止銷(xiāo)售并召回鰹魚(yú)粉產(chǎn)品,韓國(guó)世林糙米(株)公司停止銷(xiāo)售并召回其銷(xiāo)售的“樂(lè)溫糙米油”產(chǎn)品。因此,非常有必要建立油脂產(chǎn)品中殘留苯并(a)芘的測(cè)定方法,用于指導(dǎo)我國(guó)相關(guān)進(jìn)出口企業(yè)原料產(chǎn)品檢驗(yàn),從而保護(hù)消費(fèi)者的身體健康。

目前,測(cè)定苯并(a)芘的方法主要有高效液相色譜法[3-6]和液相色譜-質(zhì)譜法[7-8]。高效液相色譜法是檢測(cè)苯并(a)芘的通用方法,附帶的熒光檢測(cè)器具有高靈敏度的特點(diǎn),可以滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品中苯并(a)芘殘留的限量要求。液相色譜-質(zhì)譜法在測(cè)定苯并(a)芘時(shí)有一定的局限性,如文獻(xiàn)[2]采用大氣壓光致電離源作質(zhì)譜離子源,其檢測(cè)靈敏度不如高效液相色譜法高,且這種離子源在常規(guī)質(zhì)譜測(cè)定中使用較少,經(jīng)濟(jì)性、應(yīng)用性和推廣性均不足。但采用食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.27－2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯并(a)芘的測(cè)定》中的液相色譜法測(cè)定苯并(a)芘時(shí),由于果蔬脆片含油量高且成分復(fù)雜,苯并(a)芘的基質(zhì)加標(biāo)回收率低、結(jié)果重現(xiàn)性差,因此需要建立一種高效地提取凈化苯并(a)芘的方法來(lái)滿足對(duì)復(fù)雜油脂產(chǎn)品中苯并(a)芘殘留量進(jìn)行測(cè)定的需求。苯并芘分子印跡柱是一種親和柱,其中特殊的分子結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)可以選擇性的吸附富集苯并芘,進(jìn)而達(dá)到提取凈化的目的[9],據(jù)此,本工作建立了一種適用性強(qiáng)的苯并(a)芘提取凈化方法,以期為食品生產(chǎn)企業(yè)及相關(guān)監(jiān)管部門(mén)對(duì)苯并(a)芘含量的監(jiān)控提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜,配熒光檢測(cè)器;5810R 型冷凍離心機(jī);LB-W-48 型水浴氮吹儀;Milli-Q Reference型超純水系統(tǒng);GM 300 型樣品研磨儀;Visiprep TM DL 型固相萃取裝置;XS 205DU 型電子天平;苯并(a)芘分子印跡柱(500 mg/6 mL)。

苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100.0 mg·L－1,稱(chēng)取苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g,用乙腈溶解并定容至100.0 mL,于－20℃環(huán)境下保存,有效期6個(gè)月。

苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.0 mg·L－1,移取苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL,用乙腈定容至100.0 mL,于4 ℃保存,有效期3個(gè)月。

苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列:用樣品溶液將苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.4,5,10,50,80,100μg·L－1,現(xiàn)用現(xiàn)配。

苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于99.7%;正己烷、二氯甲烷、乙腈和甲酸均為色譜純;試驗(yàn)用水為一級(jí)水。

1.2 儀器工作條件

Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5.0μm),柱溫40℃;熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)384 nm,發(fā)射波長(zhǎng)406 nm;流動(dòng)相體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈溶液,等度洗脫;流量1.0 mL·min－1;進(jìn)樣體積10μL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱(chēng)取粉碎均勻的果蔬脆片樣品5.00 g,轉(zhuǎn)移至50 mL具塞離心管中,加入20 mL正己烷渦旋振蕩1 min,靜置5 min 后再渦旋振蕩1 min,以10 000 r·min－1轉(zhuǎn)速于4 ℃冷凍離心10 min,移取上清液16.0 mL至20 mL玻璃試管中,待用。

1.3.2 苯并(a)芘分子印跡柱的活化

在苯并(a)芘分子印跡柱中加入二氯甲烷5 mL,靜置1 min后加入正己烷5 mL,完成對(duì)凈化柱的活化。

1.3.3 樣品的測(cè)定

將玻璃試管中溶液加入活化好的凈化柱中,用正己烷3 mL 淋洗柱子,用二氯甲烷6 mL 洗脫,洗脫液收集到10 mL試管中,于35 ℃氮吹至近干,加入乙腈1 mL溶解殘?jiān)?渦旋振蕩1 min,過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜,濾液供高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了Eclipse Plus C18色譜柱規(guī)格分別為(100 mm×4.6 mm,3.0 μm)、(150 mm×4.6 mm,5.0μm)和(250 mm×4.6 mm,5.0μm)時(shí)對(duì)測(cè)定的影響。結(jié)果顯示:在使用第一種色譜柱時(shí),柱壓較高,分析物的保留時(shí)間較短,且分析物的色譜峰和雜質(zhì)峰不易分離;在使用第三種色譜柱時(shí),柱壓也較高,雖然分析物的色譜峰和雜質(zhì)峰能有效分離,但保留時(shí)間為16 min,不利于樣品的批量快速測(cè)定;在使用第二種色譜柱時(shí),不僅分析物能得到有效分離,且保留時(shí)間較短(8 min 左右),故試驗(yàn)選擇Eclipse Plus C18色譜柱的規(guī)格為(150 mm×4.6 mm,5.0μm)。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了流動(dòng)相中的有機(jī)相分別為甲醇和乙腈時(shí)對(duì)分析物的保留時(shí)間和分離效果的影響。結(jié)果顯示:以甲醇作為有機(jī)相時(shí),分析物保留時(shí)間較長(zhǎng),且其峰高比乙腈作有機(jī)相時(shí)的低15%。這是由于乙腈極性較甲醇的略小,其洗脫能力更強(qiáng),可縮短測(cè)定時(shí)間;同時(shí),在同等條件下,苯并(a)芘在乙腈中受紫外照射時(shí)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比在甲醇中的更高,故其響應(yīng)值更高。因此試驗(yàn)采用乙腈作流動(dòng)相中的有機(jī)相。

試驗(yàn)在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,還考察了流動(dòng)相乙腈和水的體積比分別為70∶30[4]、80∶20[5]、88∶12[9]、90∶10 和92∶8 時(shí)對(duì)測(cè)定的影響。結(jié)果顯示:隨著有機(jī)相所占比例的增加,分離效果變好;但當(dāng)有機(jī)相的體積分?jǐn)?shù)大于90%時(shí),目標(biāo)物的保留時(shí)間延長(zhǎng)、雜峰增多,分析物峰出現(xiàn)拖尾,且響應(yīng)值降低。綜合考慮,試驗(yàn)選擇體積分?jǐn)?shù)為90%的乙腈溶液作流動(dòng)相。

按照1.2節(jié)優(yōu)化的色譜條件對(duì)0.4μg·L－1苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,得到的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 提取條件的選擇

圖1 苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of benzo(a)pyrene standard solution

目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道的苯并(a)芘的提取溶劑主要有乙腈[4]、正己烷[10-11]、乙酸乙酯-環(huán)己烷[2]、環(huán)己烷[12-13]、辛醇-四丁基溴化銨[14]和石油醚[15],故試驗(yàn)考察了上述溶劑對(duì)苯并(a)芘加標(biāo)量為10.0μg·kg－1的果蔬脆片進(jìn)行提取時(shí)對(duì)測(cè)定的影響。結(jié)果顯示:使用甲醇、乙腈或辛醇-四丁基溴化銨提取時(shí),苯并(a)芘的回收率低于60%;使用乙酸乙酯-環(huán)己烷和石油醚提取時(shí),苯并(a)芘的回收率達(dá)到了75%以上,但色譜圖上的干擾峰較多;使用正己烷和環(huán)己烷提取時(shí)的提取效果最好,回收率均達(dá)到85%以上,考慮到還需使用正己烷進(jìn)行下一步的凈化操作,故試驗(yàn)選用正己烷作為提取溶劑。

2.3 凈化方法的選擇

試驗(yàn)比較了Qu ECh ERS 粉[16]、中性氧化鋁柱和苯并(a)芘分子印跡柱的凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在使用苯并(a)芘分子印跡柱進(jìn)行凈化時(shí),分析物的分離效果和回收率均較好;而在使用QuEChERS粉、中性氧化鋁柱進(jìn)行凈化時(shí),分析物色譜圖上產(chǎn)生了較多雜峰,且回收率也較低。這是由于QuEChERS粉和中性氧化鋁均是通過(guò)吸附樣品提取液中的雜質(zhì)來(lái)達(dá)到凈化目的的,凈化后的樣品溶液中分析物含量較低,需要進(jìn)一步濃縮才能進(jìn)行測(cè)定;而分子印跡柱是通過(guò)吸附苯并(a)芘到固相柱上,再通過(guò)洗脫劑將苯并(a)芘置換出來(lái)而達(dá)到凈化目的的,因此選擇分子印跡柱作凈化柱,凈化過(guò)程更加直接高效,且準(zhǔn)確度更高。

試驗(yàn)還考察了洗脫劑分別為二氯甲烷、三氯甲烷、正丁醇和異丙醇時(shí)對(duì)測(cè)定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用正丁醇作洗脫劑時(shí),分析物的回收率偏低;采用二氯甲烷、三氯甲烷和異丙醇作為洗脫劑時(shí),苯并(a)芘的回收率都比較理想?？紤]到二氯甲烷毒性最小、沸點(diǎn)最低且容易獲取,故試驗(yàn)選擇用二氯甲烷作洗脫劑。

試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),若將提取液全部上柱凈化,提取液中的微小雜質(zhì)或顆粒容易堵塞凈化柱,造成凈化時(shí)間延長(zhǎng)或凈化過(guò)程失效等問(wèn)題,而僅定量移取上清液進(jìn)行凈化,凈化效率明顯提升。同時(shí),在分子印跡柱活化操作中增加靜置1 min這一步驟,可以顯著增強(qiáng)苯并(a)芘回收率的穩(wěn)定性和平行性。

2.4 工作曲線和測(cè)定下限

按照試驗(yàn)方法對(duì)苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以苯并(a)芘的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果顯示:工作曲線線性范圍為0.4～100μg·L－1,線性回歸方程為y＝1.810×10－2x－7.710×10－3,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

按照試驗(yàn)方法對(duì)6個(gè)加標(biāo)量為5.00μg·kg－1的空白果蔬脆片樣品進(jìn)行測(cè)定,以10倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的測(cè)定下限(10S/N),所得結(jié)果為0.40μg·kg－1。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

在空白果蔬脆片樣品中添加低、中、高等3個(gè)濃度水平的苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗(yàn)方法測(cè)定,每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行樣,連續(xù)測(cè)定6 天,計(jì)算日內(nèi)、日間回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of tests for precision and recovery

由表1結(jié)果可知:苯并(a)芘的日內(nèi)回收率為89.4%～93.7%,RSD 為4.3%～7.2%;日間回收率為87.6%～92.5%,RSD 為5.8%～8.4%。

2.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)20個(gè)果蔬脆片樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示,在7個(gè)樣品中檢出了苯并(a)芘,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.34～7.20μg·kg－1,符合GB 2762－2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》對(duì)油脂及其制品中苯并(a)芘限量(10μg·kg－1)的要求。

本工作建立了高效液相色譜法測(cè)定果蔬脆片中苯并(a)芘殘留量的方法,該方法靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng),具有簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用性好等優(yōu)點(diǎn),可以滿足相關(guān)食品企業(yè)及國(guó)內(nèi)外監(jiān)管部門(mén)的檢測(cè)需求,也可為GB 5009.27－2016提供有效的技術(shù)補(bǔ)充。