張翔宇 , 宋菁晨, 劉坤娜 , 毛帆 肖述 向志明 張揚(yáng) 喻子牛

1. 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 廣東 廣州 510301;

2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院, 廣東 廣州 510642;

3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

先天免疫反應(yīng)是脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的第一道宿主防御系統(tǒng)。先天免疫反應(yīng)的第一步是通過模式識別受體(Pattern Recognition Receptors, PRRs)來感知病原體相關(guān)的模式識別分子(Pathogen- Associated Molecular Pattern, PAMPs), 從而啟動(dòng)特定的信號通路, 抵御病原體的入侵(Medzhitov, 2007)。目前已知的先天性免疫反應(yīng)的模式識別受體結(jié)構(gòu)域包括: 富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine rich repeat, LRR)結(jié)構(gòu)域、C1q 結(jié)構(gòu)域、碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognition domain, CRD)、胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域等(P?lsson-McDermott et al, 2007)。其中, LRR 結(jié)構(gòu)域是先天免疫識別過程中最常見的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之一, 在植物、無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中廣泛分布, 且進(jìn)化保守(Huang et al, 2008)。LRR 結(jié)構(gòu)域由LRR 基序組成, 每個(gè)LRR 基序通常具有20～29 個(gè)殘基, 其共同特征是都包括一個(gè)保守的由 11 個(gè)氨基酸殘基組成的片段(序列為LxxLxLxxN/CxL, x 可以是任何氨基酸, L 位也可以是纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸), 負(fù)責(zé)同配體識別, 發(fā)生蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Kobe et al, 2001)。在結(jié)構(gòu)上, LRR 結(jié)構(gòu)域呈弧形或馬蹄形, 其凹面由平行的β 鏈組成, 而凸面則是包括α 螺旋在內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)的可變區(qū)域。包含LRR 結(jié)構(gòu)域的蛋白, 可以與蛋白質(zhì)、激素、核酸、脂質(zhì)和脂多糖等多種配體直接結(jié)合(Matsushima et al, 2019)。典型的含有LRR 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)包括Toll 樣受體(Toll-like receptors, TLRs)、RIG-I 樣受體(RIG-I like receptors, RLRs)和NOD 樣受體(Nucleotide binding oligomerization domain like receptors, NLRs)等, 它們在識別細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲的PAMPs 中發(fā)揮著重要的作用(Jin et al, 2008; Buchmann, 2014)。例如, 在植物中核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)-LRR 蛋白可以與PAMPs 識別, 并誘導(dǎo)一系列宿主防御反應(yīng), 如呼吸氧爆發(fā), 鈣和離子通量的激活等(Kunkel et al, 2002; Delledonne et al, 2003; Peart et al, 2005)。在哺乳動(dòng)物中, Toll 樣受體利用LRR 域識別入侵的細(xì)菌、真菌和病毒等病原的PAMPs 分子, 從而激活下游的免疫反應(yīng)(Ng et al, 2011a)。在無脊椎動(dòng)物中, LRR 結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)了大量擴(kuò)張, 增加了對病原體識別的多樣性(Huang et al, 2008; Wang et al, 2016a, 2016b)。在對蝦中, 富含LRR 基序的凝集素作為模式識別受體可以結(jié)合細(xì)菌的鞭毛蛋白, 從而阻止細(xì)菌的粘附和定植(Wang et al, 2017b)。另外, 長牡蠣中富含 LRR 基序的CgLRFN 可以有效地結(jié)合副溶血弧菌, 并且調(diào)理血淋巴的吞噬作用(Huang et al, 2018)。此外, 已有相關(guān)研究報(bào)道顯示, 感染可以有效誘導(dǎo)包含LRR 結(jié)構(gòu)域的基因的表達(dá)。例如, 扇貝LRR mRNA 在受4 種PAMPs (PGN、LPS、GLU 和poly I: C)刺激后, 轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(Wang et al, 2016a, b); 對蝦的LRR 結(jié)構(gòu)域包含蛋白在白斑綜合癥病毒(WSSV)的刺激下, 表達(dá)量也顯著上升(Sriphaijit et al, 2007)。

長牡蠣Crassostrea gigas 是我國沿海地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)品種, 同時(shí)在固碳削減、防止海水富營養(yǎng)化等方面也發(fā)揮著巨大的生態(tài)價(jià)值。然而, 病害的爆發(fā)經(jīng)常導(dǎo)致牡蠣的大規(guī)模死亡, 給貝類產(chǎn)業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失, 因此深入了解牡蠣的免疫防御機(jī)制有利于制定新的抗病策略。本文通過研究長牡蠣中LRR 結(jié)構(gòu)域包含的基因及其免疫學(xué)功能, 成功地克隆了一個(gè)LRR 基因(命名為CgLRRC69), 并對其在牡蠣免疫防御中的功能進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品、攻毒與組織收集

本實(shí)驗(yàn)所用長牡蠣(2 歲齡, 平均殼長100mm)均取自中國山東省青島市。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前, 先將牡蠣置于22～25℃的循環(huán)海水中培養(yǎng)兩周, 使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。隨后將200 只牡蠣隨機(jī)分為兩組, 分別為細(xì)菌攻毒組和對照組。向攻毒組牡蠣的肌肉中注射 50μL 副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus, 1×108CFU·mL–1), 對照組注射相同體積的PBS 緩沖液。在注射0h、3h、6h、12h、24h 后, 分別從圍心腔內(nèi)采集血淋巴液, 4℃離心(4000g, 10min)收集血淋巴細(xì)胞。每個(gè)采集樣品的時(shí)間點(diǎn), 細(xì)菌攻毒組和對照組都隨機(jī)抽取了5 個(gè)個(gè)體收集血淋巴細(xì)胞, 用于提取總RNA。此外, 從3 只健康的牡蠣中收集血淋巴細(xì)胞、鰓、外套膜、肌肉、消化腺、性腺和心臟等組織和細(xì)胞, 提取總RNA 進(jìn)行組織分布分析。

1.2 RNA 的提取

總RNA 的提取使用Trizol (Invitorgen)抽提法, 具體步驟如下: 取50mg 組織于液氮預(yù)冷的研缽中, 將組織研磨成粉末之后, 轉(zhuǎn)移到裝有1ml Trizol 的離心管中, 吹打、混勻后加入200μL 氯仿, 劇烈震蕩40s; 室溫放置5min 后, 4℃、12000g 離心10min, 吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的EP 管中, 在新的EP 管中加入0.5mL 的異丙醇, 混勻; –80℃沉淀過夜后, 4℃、12000g 離心10min, 棄上清; 75%乙醇清洗滌沉淀兩次, 棄上清, 加入100μL DEPC 水溶解RNA。采用A260nm紫外光吸收法測定RNA 濃度, 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

應(yīng)用Primer 6.0 根據(jù)NCBI GeneBank的基因序列, 設(shè)計(jì)涵蓋LRR 開放閱讀框(ORF)的引物, 引物兩端分別加入BamH-I 和Xho-I 兩個(gè)酶切位點(diǎn), 提取轉(zhuǎn)錄組RNA, 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 以此為模板使用這對引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 并利用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果。PCR 產(chǎn)物和pGEX-4T-1 載體分別使用BamH-I和Xho-I 進(jìn)行雙酶切, 酶切產(chǎn)物純化后回收, 回收的PCR 片段和pGEX-4T-1 載體于16℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞, 在含有50μg·mL–1氨芐霉素的LB 固體培養(yǎng)基上37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑選長勢較好的單菌落接種于LB 培養(yǎng)基(50μg·mL–1)中, 于37℃搖床上震蕩培養(yǎng), 抽提重組質(zhì)粒后, 提交至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序。

1.4 重組蛋白的原核表達(dá)和純化

將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-LRR 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞, 在含有50μg·mL–1氨芐霉素的LB 固體培養(yǎng)基上37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑選長勢較好的單菌落接種于含有50μg·mL–1氨芐霉素的LB 培養(yǎng)基中, 于37℃、180r·min–1搖床上震蕩培養(yǎng), 定時(shí)檢測細(xì)菌OD600。當(dāng)OD600等于0.6 左右時(shí), 加入終濃度為0.1mmol·L–1的IPTG, 在22℃、180 r·min–1的條件下誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)結(jié)束后, 4℃、12000g 離心10min, 并收集沉淀; 加入溶菌酶至終濃度為2mg·mL–1后超聲破碎細(xì)菌; 使用 Glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare)純化重組蛋白, 在12% 的SDS-PAGE 膠中分析純化產(chǎn)物。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)

將脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)、葡聚糖(Glucan)、昆布多糖(Laminarin)等多種PAMPs分別溶解在雙蒸水(40mg·mL–1)中; 分別吸取50μL 至96-孔板(Costar), 室溫放置, 直至蒸干; 蒸干后置于60℃烘干箱中30min, 固定PARMs; 加入200μL 含有牛血清蛋白(BSA)的Tris 緩沖液, 37℃孵育2h 進(jìn)行封閉包被; 吸去上清, Tris 緩沖液清洗4 次, 以去除多余的BSA; 加入純化好的LRR 重組蛋白, 室溫孵育3h進(jìn)行特異性結(jié)合; 棄上清, Tris 緩沖液清洗4 次, 以洗去未結(jié)合的LRR 重組蛋白; 加入鼠源anti-GST 抗體 (Abmat, 1: 5000), 孵育2h; 棄上清, Tris 緩沖液洗4次后加入HRP 偶聯(lián)的羊抗鼠IgG (Abmat, 1: 3000), 孵育2h; 加入HRP 底物TMB(Tiangen)進(jìn)行顯色, 用酶標(biāo)儀測量A450nm的吸收光結(jié)果。

1.6 吞噬效率測定

將溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)兩種牡蠣致病菌在LB 培養(yǎng)基中37°C 下培養(yǎng)生長至對數(shù)中期, 并用新的LB 培養(yǎng)基稀釋至109CFU·mL–1; 稀釋后, Tris 緩沖液洗3 次, 在菌液中加入重組CgLRRC69 蛋白(100ng·μL–1), 空白對照組中加入20μL的Tris緩沖液, 陰性對照組中加入20μL的GST (100ng·μL–1), 37℃下孵育3h; 離心, 棄上清, 每組分別加入100μL 血淋巴細(xì)胞并輕輕搖晃混勻, 孵育30min; 棄上清, Tris 緩沖液洗3 次, 加入含有150μL 1.5%EDTA 的PBS 懸浮細(xì)胞; 取100μL 細(xì)胞懸浮液鋪在LB瓊脂平板上, 37℃過夜后即可對菌落形成單位(CFU)進(jìn)行計(jì)數(shù), 以統(tǒng)計(jì)吞噬弧菌的數(shù)量。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR

通過實(shí)時(shí)定量PCR 分析CgLRRC69 mRNA 在各種組織以及攻毒過程中的表達(dá)水平, 以GAPDH 為參考基因, 實(shí)時(shí)PCR 分析的引物見表1。實(shí)時(shí)熒光定量分析采用Roche 公司的2×Master Mix 試劑盒, 反應(yīng)體系如下: Forward Primer (10μmol·L–1)1μL, Reverse Primer (10μmol·L–1)1μL, cDNA1μL, 補(bǔ)充無菌水至20μL。熒光定量PCR 的程序?yàn)? 將配制好的體系加到96 孔板上, 封板膜后, 短暫離心, 放置于熒光定量 PCR 儀中。然后按照如下反應(yīng)程序進(jìn)行操作: 94℃預(yù)變性1min; 95℃變性15s, 55℃復(fù)性15s, 72℃延伸15s, 進(jìn)行40 個(gè)循環(huán); 85 , 15s℃后終止反應(yīng)。數(shù)據(jù)以2–ΔΔct法計(jì)算目的基因的表達(dá)量。

1.8 RNA 干擾(RNAi)

通過合成并注射dsRNA, 從而敲降CgLRRC69在牡蠣體內(nèi)的表達(dá)水平。表1 所示是用于合成dsRNA的引物。設(shè)計(jì)帶有T7 啟動(dòng)子的CgLRRC69 引物和GFP 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 產(chǎn)物用于dsRNA 的合成; 體外轉(zhuǎn)錄合成RNA (Promega, RiboMAX? Express RNAi System), 體系如下: T7 2×緩沖液 10μL, DNA模板1～8μL (約1μg), 酶混合物2μL, RNase dH2O 補(bǔ)充至20μL。PCR 程序?yàn)? 37℃孵育30min, 70℃反應(yīng)10min, 然后用降落PCR 從70℃降至20 , ℃ 每個(gè)循環(huán)降 0.5 , 12s℃為一個(gè)循環(huán), 合成dsRNA。純化dsRNA: 每 20μL 的體系加入 1μL 稀釋(1: 200)的 RNase solution 和1μL RQ1 Rnase-free DNase, 37℃反應(yīng)30min; 加入2μL 3mol·L–1sodium Acetate (pH5.2)和20μL 異丙醇混合均勻; 冰上反應(yīng)5min 后, 以最大轉(zhuǎn)速離心10min, 去除上清; 用70%的冰乙醇小心清洗白色沉淀, 去除乙醇, 空中晾干15min; 用2～5 倍體積無核酸酶水溶解RNA, 保存于-20℃或-80℃下, 用于后續(xù)注射。將10 只牡蠣隨機(jī)均分為2 組并置于2個(gè)水箱中, 分別標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組和對照組。每只牡蠣注射50μg dsRNA, 3d 后收集樣品并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RNAi 效率通過RT-qPCR 進(jìn)行確定。

表格1 使用的寡核苷酸引物序列 Tab. 1 Sequences of oligonucleotide primers used

1.9 弧菌清除效率測定

將溶藻弧菌和副溶血弧菌兩種牡蠣致病菌在LB 培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)生長至對數(shù)中期, 并用新的LB 培養(yǎng)基稀釋至109CFU·mL–1; 稀釋后, Tris 緩沖液洗3 次備用。在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)牡蠣血淋巴細(xì)胞, 每孔細(xì)胞數(shù)約2.5×105個(gè), 培養(yǎng)0.5h 后加入50μL 菌懸液, 輕輕搖晃混勻孵育20min, 使血淋巴吞噬弧菌; 棄上清, Tris 緩沖液洗3 次, 去掉沒有被吞噬的弧菌; 緩沖液孵育1h, 使血淋巴細(xì)胞盡量殺死內(nèi)化的細(xì)菌; 棄上清, 加入含有 150μL 1.5%EDTA 的PBS 懸浮細(xì)胞; 取100μL 細(xì)胞懸浮液鋪在LB 瓊脂平板上, 37℃過夜后即可計(jì)數(shù)CFU。

1.10 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism (版本8.0.1)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析, 所有統(tǒng)計(jì)值均表示為平均值±SEM。使用SPSS 18.0 軟件對所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 其中兩組之間的顯著性由Student-t 檢驗(yàn)確定, 兩個(gè)以上組通過ANOVA 單因素方差分析和Tukey HSD 多重比較。當(dāng)P<0.05 時(shí), 認(rèn)為差異顯著, 用*表示; 當(dāng)P<0.01 時(shí), 認(rèn)為差異極顯著, 用**表示。

2 結(jié)果

2.1 CgLRRC69 基因開放閱讀框(ORF)的克隆與鑒定

從長牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫中獲得CgLRRC69 基因序列, 并以此克隆了長牡蠣CgLRRC69 的開放閱讀框(ORF)。獲得的CgLRRC69 的開放閱讀框序列長度為1059bp, 編碼457 個(gè)氨基酸, 預(yù)測等電點(diǎn)約為8.21, 核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列如圖1 所示。

圖1 CgLRRC69 完整的ORF 和推導(dǎo)的氨基酸序列 黑色字體為長牡蠣CgLRRC69 的開放閱讀框(ORF), 藍(lán)色字體為翻譯的氨基酸序列, 粗體表示起始密碼子和終止密碼子; *代表終止密碼子, 負(fù)責(zé)終止肽鏈合成; 灰色陰影部分表示LRR-亮氨酸重復(fù)序列 Fig.1 The complete ORF and deduced amino acid sequence of CgLRRC69. The black font is the open reading frame (ORF) of Oyster CgLRRC69, the blue font is the translated amino acid sequence, and the bold font indicates the start codon and the stop codon. * represents the stop codon, which does not encode any amino acid and is responsible for terminating the peptide chain synthesis. Shading indicates the LRR-leucine repeat sequence

BLAST 分析表明 CgLRRC69 與哺乳動(dòng)物的LRRC69 同源性最高。多序列比對顯示LRRC69 在進(jìn)化中高度保守(圖2)。

SMART 預(yù)測分析(圖3)顯示, CgLRRC69 包含6個(gè)LRR 結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)LRR_TYP 結(jié)構(gòu)域, 而同為軟體動(dòng)物的蝦夷扇貝LRRC69 有4 個(gè)LRR 結(jié)構(gòu)域和2個(gè)LRR_TYP 結(jié)構(gòu)域。人、家鼠和斑馬魚LRRC69具有7～8 個(gè)LRR 結(jié)構(gòu)域。

圖2 長牡蠣LRRC69 氨基酸序列與人(Homo sapiens)、家鼠(Mus musculus)、斑馬魚(Danio rerio)、蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)和美洲牡蠣(Crassostrea virginica)的對比 圖中*、:和.分別表示相同的、高度保守的和不太保守的氨基酸殘基; 黑底白字表示在選取的6 個(gè)物種中, 在不太保守的氨基酸殘基中仍有 3 個(gè)以上相同氨基酸重復(fù); 灰底黑字表示在不太保守的氨基酸殘基中存在性質(zhì)相似的氨基酸; GenBank 登錄號如下: 人(NP_001123362.1)、家鼠(XP_006538358.1)、斑馬魚(XP_005159720.1)、蝦夷扇貝(XP_021346950.1)和美洲牡蠣(XP_022338017.1) Fig.2 The amino acid sequence of Pacific oyster LRRC69, compared with Homo sapiens, Mus musculus, Danio rerio, Mizuhopecten yessoensis, and Crassostrea virginica. Identical, highly conserved and less conserved amino acid residues are indicated by *, : and . . White letters on black background indicate that in the six selected species, there are still more than three identical amino acid residues in the less conservative amino acid residues. Black letters on gray background indicate that there are amino acids with similar properties in the less conservative amino acid residues. The GenBank accession numbers are listed: Homo sapiens (NP_001123362.1), Mus musculus (XP_006538358.1), Danio rerio (XP_005159720.1), Mizuhopecten yessoensis (XP_021346950.1) and Crassostrea virginica (XP_022338017.1)

采用 MEGA4.0 軟件的鄰接算法生成無根系的CgLRRC69 系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4), 結(jié)果顯示長牡蠣的 CgLRRC69 與美洲牡蠣(Crassostrea virginica)的LRRC69 親緣關(guān)系最近, 并與其他無脊 椎 動(dòng)物 如 蝦夷 扇 貝(Mizuhopecten yessoensis)、棘冠海星 (Acanthaster plancl)等的LRRC69 同源蛋白聚為一支, 這與傳統(tǒng)分類的結(jié)果相符。

圖3 LRRC69 在不同物種中的結(jié)構(gòu)圖解 P 表示 Pfam: LRR, T 表示 LRR-TYP, 空白表示普通 LRR; GenBank 登錄號如下: 人(NP_001123362.1) 、 家鼠(XP_006538358.1) 、 斑馬魚(XP_005159720.1) 、 蝦夷扇貝(XP_021346950.1)、美洲牡蠣(XP_022338017.1) Fig.3 Schematic of LRRC69 structures in different species. P means Pfam: LRR; T means LRR-TYP; blank means ordinary LRR. The GenBank accession numbers are listed: Homo sapiens (NP_001123362.1), Mus musculus (XP_006538358.1), Danio rerio (XP_005159720.1), Mizuhopecten yessoensis (XP_021346950.1) and Crassostrea virginica (XP_022338017.1)

2.2 CgLRRC69 基因的表達(dá)模式

CgLRRC69 基因的組織分布表明, 其mRNA在所有檢測到的組織中都有表達(dá), 包括血淋巴細(xì)胞、鰓、外套膜、肌肉、心臟、消化腺和性腺 (圖5a)。其中, 在鰓和血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)水平最高, 其次是消化腺和性腺, 在其余組織中的表達(dá)水平相對較低。此外, 我們還分析了副溶血弧菌感染下CgLRRC69 mRNA 在血淋巴的表達(dá)模式。結(jié)果顯示, 在副溶血弧菌感染 3h 后, CgLRRC69 基因表達(dá)上調(diào)了4.04 倍(P<0.01); 在6h 后達(dá)到峰值, 達(dá)到了15.15 倍(P<0.01)。隨著時(shí)間的推移, CgLRRC69 mRNA 水平在感染后12h 開始下降, 并在24h 恢復(fù)到初始水平(圖5b)。這些結(jié)果表明, CgLRRC69 可能在長牡蠣免疫防御中起著重要的作用。

圖4 無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的LRRC69 系統(tǒng)發(fā)育分析 五角星表示目的物種 Fig.4 Phylogenetic analysis of invertebrate and vertebrate LRRC69 homologs. Five-pointed star indicates the target species

圖5 CgLRRC69 基因的相對表達(dá)量 a. 長牡蠣組織中CgLRRC69 的分布, 包括血淋巴細(xì)胞、鰓、外套膜、肌肉、心臟、消化腺和性腺; b. CgLRRC69 在細(xì)菌刺激下的表達(dá)變化, 數(shù)值以Mean ± SEM 表示(N=3), **表示p<0.01, 即差異極顯著 Fig.5 CgLRRC69 gene expression in tissues and under bacterial challenge. (a) Tissue distribution of CgLRRC69 in oyster, including hemocytes, gill, muscle, mantle, heart, digestive gland, and gonads. (b) Variation in expression of CgLRRC69 in response to bacterial challenge. Data are expressed as Mean ± SEM (N=3). ** means p<0.01, namely, the difference is extremely significant

2.3 CgLRRC69 蛋白的模式識別

通過原核表達(dá)的方法, 我們獲得了CgLRRC69的重組蛋白, 純化后的 CgLRRC69 融合蛋白大約為66.56kDa (圖6a)。通過對重組CgLRRC69 蛋白與多種PAMPs 分子(包括LPS、PGN、LTA、GLucan、Laminarin 和poly I: C)進(jìn)行ELISA 實(shí)驗(yàn), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)CgLRRC69 對LPS 具有特異的結(jié)合能力, 顯著高于其對其他PAMPs 的親和力 (圖6b)。進(jìn)一步分析顯示, 相比于對照組, ELISA 實(shí)驗(yàn)證明CgLRRC69 和LPS 在蛋白濃度為1μg·mL–1時(shí)已經(jīng)顯著結(jié)合 (圖6c), 表明了CgLRRC69 對LPS 具有高度的親和力。

圖6 CgLRRC69 蛋白的體外表達(dá)及對LPS 的親和力特異性分析 a. 經(jīng)SDS-PAGE 分析純化后的CgLRRC69 蛋白, 用考馬斯亮藍(lán)染色顯示; M 為分子量標(biāo)記; 數(shù)字1 表示泳道1, 為總細(xì)菌蛋白; 數(shù)字2 表示泳道2, 為純化的蛋白質(zhì)。b. 測定病原菌相關(guān)的模式識別分子與CgLRRC69 蛋白的結(jié)合親力, **表示p<0.01, 即差異極顯著。c. 酶聯(lián)免疫吸附法測定LRR 結(jié)構(gòu)域蛋白與固定化LPS 的結(jié)合, 數(shù)值以Mean ± SEM 表示(N=3); *表示p<0.05, 即差異顯著; **表示p<0.01, 即差異極顯著 Fig.6 CgLRRC69 protein with affinity specificity for LPS. (a) The purified CgLRRC69 recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE and visualized with Coomassie brilliant blue staining. M: Molecular weight marker; Lane 1: total bacterial protein; Lane 2: purified protein. (b) PAMPs binding affinity with CgLRRC69. ** means p<0.01, namely, the difference is extremely significant. (c) The binding of LRR domain protein to immobilized LPS as determined by Enzyme-linked immunosorbent assay. Data are expressed as Mean ± SEM (N=3). * means p<0.05, namely, the difference is significant; ** means p<0.01, namely, the difference is extremely significant

2.4 CgLRRC69 的促吞噬作用

為了確定CgLRRC69 蛋白是否會影響血淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用, 我們對牡蠣的血淋巴細(xì)胞進(jìn)行了吞噬實(shí)驗(yàn)和殺菌實(shí)驗(yàn)。吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 血淋巴細(xì)胞對CgLRRC69 重組蛋白孵育過的溶藻弧菌和副溶血弧菌的吞噬指數(shù)分別增加了1.87 倍和1.65 倍 (圖7a), 表明CgLRRC69 重組蛋白具有調(diào)理作用, 具體表現(xiàn)為可以促進(jìn)對弧菌病原體的吞噬。為進(jìn)一步驗(yàn)證CgLRRC69 在牡蠣體內(nèi)的功能, 通過RNAi實(shí)驗(yàn)敲降了CgLRRC69 的表達(dá)。定量PCR 的結(jié)果表 明, 相比于對照組的CgLRRC69 表達(dá)水平, 實(shí)驗(yàn)組的RNAi 效率超了60% (圖7b)。吞噬并清除入侵病原體是血淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫防御中重要的過程, 本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了CgLRRC69 在清除入侵病原菌中的作用。敲降CgLRRC69 以后, 血淋巴細(xì)胞對溶藻弧菌和副溶血弧菌的清除能力都有顯著下降 (圖7c)。上述結(jié)果均表明CgLRRC69 對于牡蠣血淋巴細(xì)胞吞噬防御的重要作用

圖7 CgLRRC69 在吞噬和殺菌中的作用 a. CgLRRC69 重組蛋白對血淋巴吞噬細(xì)菌的影響, **表示p<0.01, 即差異極顯著; b. RNAi 敲降效率, **表示p<0.05, 即差異極顯著; c. 對照組與dsCgLRRC69 敲降處理組殺菌能力的差異, 數(shù)值以Mean ± SEM 表示(N=3); *表示p<0.01, 即差異顯著 Fig.7 The role of CgLRRC69 in phagocytosis and sterilization. (a) The effects of CgLRRC6 recombinant protein coating on the phagocytic ability of hemocytes. ** means p<0.01, namely, the difference is extremely significant. (b) dsCgLRRC69 knockdown efficiency. Experimental group: dsLRRC69; control group: dsGFP. ** means p<0.01, namely, the difference is extremely significant. (c) Display of the difference in bactericidal ability between the control group and dsCgLRRC69 knockdown treatment group. Data are expressed as Mean ± SEM (N=3). * means p<0.05, namely, the difference is significant

3 討論

本研究從長牡蠣中鑒定出了CgLRRC69 基因, 其編碼的蛋白包含了由13～20 個(gè)富含亮氨酸的氨基酸殘基組成的7 個(gè)LRR 基序, 這也是LRR 結(jié)構(gòu)域的典型特征(Ng et al, 2011b)。LRR 家族的其他成員已經(jīng)被證實(shí)參與了包括識別抗原、啟動(dòng)免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)凋亡和自噬等過程, 這些研究也提示CgLRRC69可能在牡蠣的免疫防御方面具有重要作用(Liu et al, 2016)。為了驗(yàn)證這一假設(shè), 我們檢測了CgLRRC69在各組織中的表達(dá)模式。CgLRRC69 的轉(zhuǎn)錄本在多種組織中廣泛分布, 其中以鰓為最高, 可能在于鰓作為濾水性器官, 經(jīng)常接觸海水中的病原微生物有關(guān)(Li et al, 2017)。此外, 我們還觀察到CgLRRC69在生殖腺中也有較高的表達(dá), 推測可能其在卵細(xì)胞中積累, 以母性遺傳的方式保護(hù)下一代個(gè)體, 但是這個(gè)假說需要進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí), 副溶血弧菌感染可以顯著地誘導(dǎo)血淋巴細(xì)胞中CgLRRC69 的表達(dá), 其表達(dá)量在6h 達(dá)到峰值后緩慢回落并逐漸恢復(fù)到原始水平。Liu 等(2020)在中華絨螯蟹中也發(fā)現(xiàn)了類似的表達(dá)模式, EsVLRA 是由13 個(gè)LRR 結(jié)構(gòu)域組成的免疫基因, 同樣在副溶血弧菌感染6h 后, 其表達(dá)量達(dá)到峰值。這些結(jié)果暗示CgLRRC69 在早期急性感染中可能具有顯著的免疫相關(guān)的作用。然而, 長牡蠣另外一個(gè)含有 LRR 結(jié)構(gòu)域的基因(CgLRFN), 在副溶血弧菌感染后12h 達(dá)到峰值。不同表達(dá)模式的差異表明存在不同的調(diào)節(jié)機(jī)制, 這可能是由于CgLRRC69 和CgLRFN 在免疫防御中的功能有所不同造成的(Huang et al, 2018)。

病原菌侵入生物體后, 免疫反應(yīng)的啟動(dòng)通常是由免疫細(xì)胞的模式識別受體感知病原體相關(guān)的模式識別分子(PAMPs)后啟動(dòng)特定的信號通路引發(fā)下游反應(yīng)(Rothberg et al, 1990)。LRR 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)大多數(shù)模式識別受體的識別作用, 如植物中的NBS(核苷酸結(jié)合位點(diǎn))-LRR 結(jié)構(gòu)域識別病原體, 哺乳動(dòng)物中的Toll 樣受體(TLR)和NOD 樣受體(NLR)通過其LRR 結(jié)構(gòu)域識別病原菌的分子決定簇(Kobe et al, 2001; Chai et al, 2009)。作為無脊椎動(dòng)物, 長牡蠣中存在CgTLR 通過LRR 結(jié)構(gòu)域結(jié)合病原菌, 激活血淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制(Zhang et al, 2011, 2013)。在本文研究中, 長牡蠣CgLRRC69 也顯示出具有與病原菌模式分子LPS 特異性結(jié)合的能力。與此相似的是, 長牡蠣 TLR 家族的成員 CgLRRIG-1 和CgLRRIG-2 也具有LPS 識別能力, 且在LPS 刺激下mRNA 表達(dá)量顯著升高(Wang et al, 2017c)。LPS 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外壁的主要組成成分, 且LPS攜帶大量負(fù)電荷, 而LRR 結(jié)構(gòu)域則由大量的正電氨基酸組成, 推測這可能是介導(dǎo)其識別LPS 的原因。在結(jié)構(gòu)上, LRR 結(jié)構(gòu)域的凸面由包括α-螺旋在內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)組成, 這與大多數(shù)含有 α-螺旋的抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)結(jié)構(gòu)相似(Sitaram, 2006)。單一的α-螺旋肽已被證實(shí)存在與完整抗菌蛋白相似的抗菌活性, 推測LRR 結(jié)構(gòu)域可能是通過α-螺旋與LPS 結(jié)合來激活下一步的免疫反應(yīng)。

血淋巴細(xì)胞通過識別外來病原菌進(jìn)而吞噬殺死病原菌來完成整個(gè)吞噬作用。但體液中的細(xì)胞和細(xì)菌因帶負(fù)電荷而互斥, 調(diào)理素可以促進(jìn)病原體的吞噬清除。目前已明確的調(diào)理素(包括C3b、C4b、IgG、IgM、C-反應(yīng)蛋白和血清樣蛋白等)大多都是在脊椎動(dòng)物上進(jìn)行了多次研究, 關(guān)于無脊椎動(dòng)物調(diào)理素的資料卻很少(Van Lookeren Campagne et al, 2007; Li et al, 2008)。已有證據(jù)表明, LRR 結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合細(xì)菌表面分子以促進(jìn)吞噬作用(Kawai et al, 2010; Wang et al, 2019)。與此相似的是, 在岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)中, AgTep1 蛋白被激活后也通過兩個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)蛋白來調(diào)節(jié)和促進(jìn)對病原體的識別、吞噬和消滅(Shokal et al, 2017)。本研究測定了CgLRRC69 在長牡蠣血淋巴細(xì)胞吞噬作用中的調(diào)理作用, 以及CgLRRC69 對血淋巴細(xì)胞殺菌能力的影響, 結(jié)果表明CgLRRC69 可以作為調(diào)理素來刺激牡蠣血淋巴細(xì)胞的吞噬作用, 而且根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn), 體外重組的CgLRRC69 蛋白可能是通過與LPS 特異性結(jié)合來直接發(fā)揮調(diào)理作用的。同時(shí), 在殺菌能力方面, 通過RNAi 敲降CgLRRC69 的表達(dá)抑制了細(xì)菌在牡蠣體內(nèi)的清除能力, 這有力地證實(shí)了CgLRRC69 在牡蠣免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用。

綜上所述, 本文研究發(fā)現(xiàn)的CgLRRC69 可能是牡蠣中的一種新型模式識別受體, 能起介導(dǎo)LPS 識別和調(diào)理的雙重作用, 為深入研究低等生物的免疫防御和演化提供了新的線索。