楊利艷，楊小蘭，朱滿喜，張玉榮，楊雅舒，王創(chuàng)云

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，中國 臨汾 041000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，中國 太谷 030800)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld)為一年生雙子葉植物，莧科藜亞科藜屬，是一種起源于南美洲安第斯區(qū)的古老物種[1]。藜麥種子富含無谷蛋白以及人體無法合成的8種必需氨基酸，且鐵、鈣、磷含量豐富，具有良好的營養(yǎng)健康效益[2，3]。藜麥不僅有極高的營養(yǎng)價值，還具有很強的抗逆性，因此受到世界的關(guān)注并被廣泛引種，是未來最具潛力的農(nóng)作物之一[4]。

氮元素(N)是細胞結(jié)構(gòu)不可或缺的一部分，擔負著植物的生長發(fā)育及機體調(diào)控的重要責(zé)任[5]。氮素約占植物干重的0.3%～5%，缺氮或低氮是導(dǎo)致農(nóng)作物生長不良、減產(chǎn)的重要原因[6]。氮脅迫條件下，植物會通過根的伸長來增強氮的吸收[7]，在甘藍型油菜[8]、小麥[9]、水稻[10]中皆有報道。然而目前對藜麥低氮響應(yīng)的研究鮮有報道。

可變剪接(alternative splicing，AS)是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制。該機制可使蛋白的最終產(chǎn)物表現(xiàn)出不同的功能和結(jié)構(gòu)特性，或者在相同的細胞中可能由于表達水平的不同而導(dǎo)致表型發(fā)生變化，因此對增強機體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組的可塑性、基因的表達以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性起重要作用[11,12]。目前，利用RNA-seq 技術(shù)對可變剪接的分析有不少報道，可變剪接基因(alternatively spliced genes，ASG)在一些生物中占較高比例，如人(95%)、線蟲(71%)[13,14]，在禽類[15]、甲殼類動物[16]中也發(fā)現(xiàn)了新的剪接變體。作為模式植物，擬南芥AS事件的發(fā)生比例也較高，為61%[17]，約有42%的內(nèi)含子參與擬南芥的生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)[18,19]。KHOKHAR等[20]發(fā)現(xiàn)在不同生態(tài)類型的擬南芥中，許多反式剪接數(shù)量性狀位點(sqtl)在晝夜節(jié)律鐘、開花和應(yīng)激反應(yīng)基因中富集，表明差異可變剪接在調(diào)節(jié)這些重要過程中發(fā)揮了作用。KANNO等[21]在擬南芥中通過對一個prp4ka突變體的定量磷酸化蛋白組學(xué)分析，檢測到幾個富含絲氨酸/精氨酸的蛋白的磷酸化變化，這些蛋白調(diào)節(jié)組成型和選擇性剪接以及其他剪接相關(guān)的因素。因此，研究可變剪接有利于對基因的深入了解。本研究對不同氮處理的藜麥葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，統(tǒng)計并分析可變剪接基因，旨在挖掘響應(yīng)低氮脅迫的ASG，從而探究AS對植物低氮響應(yīng)基因的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

藜麥ZK7種子來自于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。將種子浸泡在10% NaClO溶液中消毒15 min，用蒸餾水沖洗3～5次，置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在25 ℃下培養(yǎng)發(fā)芽。待芽長約0.5 cm時，將其移入干凈的砂子中置于光照培養(yǎng)箱育苗，光暗周期16 h/8 h，溫度18～22 ℃。待藜麥幼苗生長至2葉，采用霍格蘭全營養(yǎng)液培養(yǎng)，每3天澆一次，長至6葉期進行以下處理。

1.2 實驗設(shè)置

選取長勢相同的幼苗進行兩組處理，即對照(CK)：全營養(yǎng)液培養(yǎng)(N濃度為7.1 mmol·L-1)；低氮培養(yǎng)(LN)：氮元素濃度為全營養(yǎng)液的20% (N濃度1.42 mmol·L-1)。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，處理5天后取相同葉位材料，液氮速凍后保存。提取總RNA，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)委托生物公司測定。

1.3 總RNA的提取與質(zhì)量檢測

采用試劑盒RNAprep Pure Plant Kit(TIANGEN)的方法，分別提取藜麥葉片的總RNA。用Nanodrop ND-1000檢測RNA的濃度，Caliper LabChip GX精確檢測RNA的純度和完整性(RIN)。

1.4 RNA-seq文庫構(gòu)建和測序

RNA-seq文庫構(gòu)建和測序由北京百邁客生物科技公司完成，將對照組(CK)和低氮脅迫組(LN)兩個樣品檢測合格后構(gòu)建文庫，之后進行Illumina HiseqTM測序。測序去除含有接頭和低質(zhì)量的Reads，獲得高質(zhì)量Clean數(shù)據(jù)。本研究通過分析已獲得的Clean數(shù)據(jù)鑒定在低氮脅迫條件下發(fā)生AS事件的差異表達基因，從中找尋CK和LN中ASG的共性和差異性，進而理解AS對低氮脅迫的調(diào)控作用。

1.5 可變剪接事件的鑒定

采用StringTie[22]對Hisat2的比對結(jié)果進行拼接，通過ASprofile[23]軟件分析可變剪接類型，細分為12類，并獲取CK和LN中相應(yīng)的可變剪接類型及表達量[24]。

1.6 低氮脅迫相關(guān)基因GO分類及KEGG功能富集分析

為篩選響應(yīng)低氮脅迫的ASG，對LN中特有ASG進行差異分析[25]。并以Fold Change(表達量差異倍數(shù))≥2，F(xiàn)DR(錯誤發(fā)現(xiàn)率)<0.01且q<0.05(q為校正后的P值)為篩選標準，由于不同處理組基因存在差異，根據(jù)CK和LN組中基因的表達量值繪制各樣本中的基因表達量熱圖，采用Heatmap軟件作圖。GO分類根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology Consortium)獲得分子功能( molecular function )、生物學(xué)過程(biological process )和細胞組成(cellular component)的GO編號，功能富集采用cluster Profiler分析(q<0.05)。KEGG通路分析以Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，統(tǒng)計并分析其與整個基因組背景相比顯著富集的Pathway。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取與檢測

將提取的RNA(RIN值≥7.0)采用Caliper Lab Chip GX檢測，28S/18S均在2.0～2.1，A260/A280均在2.1～2.2(圖1)。

圖1 CK與LN總RNA的GX結(jié)果Fig. 1 The GX results of total RNA in CK and LN

2.2 可變剪接事件的鑒定

對CK和LN兩個樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)CK中26 094個基因發(fā)生了AS，共發(fā)生68 764個，LN中25 562個基因發(fā)生AS，共發(fā)生66 611個。

在各種AS類型中，CK組以TSS和TTS兩種類型為主，分別占所有可變剪接事件的40.95%和40.87%；此外AE，IR及SKIP三種類型分別占所有剪接事件的7.06%，3.97%及3.98%；剩下7種類型共占3.17%。低氮處理組中，LN組的可變剪接事件仍以TSS和TTS兩種類型為主，但較CK組有所增加，分別占41.45%和41.11%；AE，IR及SKIP三種類型分別占6.18%，4.58%及3.68%，其中IR剪接類型較CK組增加15.4%；剩下7種類型共占3.05%(表1)。

表1 CK和LN基因組中鑒定的可變剪接事件類型及數(shù)量

圖2 CK和LN中可變剪接重合及特有的基因數(shù)量 Fig. 2 Number of overlapped and specific alternative splicing genes in CK and LN

對CK與LN中發(fā)生的ASG進行整理對比后發(fā)現(xiàn)，有24 520個AS發(fā)生重合。然而，有1 573個新基因僅在CK中發(fā)生AS。同時，LN組中有1 041個新基因發(fā)生AS，在CK中卻沒有發(fā)生(圖2)。

2.3 LN特有可變剪接基因差異表達分析

對LN中1 041個ASG進行分析，差異表達顯著的有147個基因，對其聚類分析見圖3。這147個基因中AS類型以TSS和TTS為主，其中，上調(diào)基因有72個，下調(diào)基因有74個，還有一個基因(NW_018743732.1)在TSS事件中下調(diào)，在TTS事件中上調(diào)。表明藜麥在低氮條件下的基因表達與這兩種可變剪接事件密切相關(guān)。同時，這147個可變剪接基因的功能主要有無機離子運輸和傳遞，次生代謝物的合成(NW_018742204.1及NW_018742461.1)、DNA解旋酶及修復(fù)蛋白(NW_018742412.1)、翻譯后修飾(NW_018742673.1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(NW_018743014.1)、細胞骨架的形成(NW_018742814.1)及細胞周期調(diào)控(NW_018742966.1)。

圖3 LN差異可變剪接基因表達聚類熱圖 Fig. 3 Cluster thermography of differentially expressed genes

2.4 LN中差異可變剪接基因GO注釋及功能分析

對LN基因組中147個可變剪接基因進行GO注釋和功能分析，發(fā)現(xiàn)39個GO注釋的基因(圖4) 。其中，顯著富集(q<0. 05)的GO項在生物學(xué)過程中有81個，在細胞構(gòu)成中有26個，分子功能中有60個。在生物學(xué)過程中，發(fā)生可變剪接的差異基因主要集中于代謝過程(GO:0008152)和刺激反應(yīng)(GO:0050896)；在細胞構(gòu)成中，發(fā)生可變剪接的差異基因主要集中于核(GO:0005634)、細胞質(zhì)(GO:0005737)、細胞壁(GO:0005618)以及質(zhì)外體(GO:0048046)上；在分子功能中，發(fā)生可變剪接的差異基因主要富集于轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0016740)和水解酶活性(GO:0016787)相關(guān)GO項。

2.5 差異可變剪接基因KEGG通路分析

對LN中147個差異可變剪接基因進行KEGG通路分析(表2)，發(fā)現(xiàn)顯著富集到DNA復(fù)制、異源末端鏈接、抗壞血酸和醛酸代謝、錯配修復(fù)系統(tǒng)等通路上。DNA復(fù)制、異源末端鏈接參與新細胞的合成；抗壞血酸和醛酸代謝參與植物逆境響應(yīng)、細胞生長；錯配修復(fù)系統(tǒng)參與DNA雙鏈上錯配堿基對的矯正，泛素介導(dǎo)的蛋白水解調(diào)控細胞周期，囊泡運輸?shù)南嗷プ饔脜⑴c分子的轉(zhuǎn)運，谷胱甘肽代謝參與抗氧化和解毒作用。

注:數(shù)字代表在該功能下注釋的基因數(shù)；A：生物學(xué)過程；B：細胞構(gòu)成；C：分子功能。圖4 LN中特有可變剪接差異基因的GO注釋Fig. 4 GO annotations for specific differential expressed alternative splicing genes in LN

3 討論

選擇性剪接在廣大真核生物產(chǎn)生潛在的基因組信息方面發(fā)揮著重要作用，它是一個重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制，可以增加蛋白質(zhì)多樣性，影響mRNA的穩(wěn)定性[26]。然而，關(guān)于AS如何參與藜麥對低氮脅迫的響應(yīng)，人們知之甚少。在本實驗中，筆者在LN組中共識別到66 611個AS事件，包括TSS，TTS，AE，IR，SKIP等12種。其中TSS及TTS事件最為豐富，其次是AE，IR和SKIP。與CK組相比，鑒別出低氮處理組(LN)基因組中有1 041個新基因發(fā)生AS，這些基因的生物學(xué)過程富集在代謝過程和刺激反應(yīng)等過程中。LEVIATAN等[27]發(fā)現(xiàn)擬南芥在低溫脅迫下，其表達水平保持相對不變，但其剪接方式在異構(gòu)體的相對豐度上有明顯變化。大多數(shù)低溫調(diào)控的選擇性剪接將提前終止密碼子(PTC)引入到轉(zhuǎn)錄本中，通過mRNA衰變(NMD)過程產(chǎn)生潛在的降解目標，這可能導(dǎo)致新蛋白質(zhì)功能改變或產(chǎn)生負面影響。FANG等[28]發(fā)現(xiàn)水稻中11個OsAAT選擇性剪接基因，其中1個基因剪接變異的表達受氮(N)的調(diào)控，5個基因在各種形態(tài)氮濃度較高時表達上調(diào)，9個基因在硝酸鹽濃度較高時表達上調(diào)。剪接變異體的mRNA水平在水稻葉和穗發(fā)育過程中也受到調(diào)控，結(jié)果表明水稻OsAAT家族的可變剪接變異體在不同氮素條件下的表達率均有變化。本實驗發(fā)現(xiàn)，藜麥響應(yīng)低氮的差異可變剪接基因富集于與轉(zhuǎn)移酶活性和水解酶活性相關(guān)的通路。GIARETTA等[29]研究表明由GGT1和GGT2編碼的Apoplastic-谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶活性對植物營養(yǎng)和生殖發(fā)育具有重要意義，因此筆者推測轉(zhuǎn)移酶對藜麥緩解低氮脅迫起一定作用。對LN中差異可變剪接基因進行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)顯著富集到DNA復(fù)制、異源末端鏈接、抗壞血酸和醛酸代謝、錯配修復(fù)系統(tǒng)等通路上，這些信號通路與藜麥氮吸收密切相關(guān)，表明在藜麥生長過程中可能通過差異可變剪接基因調(diào)節(jié)氮吸收來響應(yīng)低氮脅迫。

4 結(jié)論

本試驗利用轉(zhuǎn)錄組樣品的高通量測序數(shù)據(jù)鑒定了藜麥響應(yīng)低氮的特異可變剪接的差異表達基因，藜麥葉片主要通過TSS和TTS兩種剪接方式形成差異基因，其中NW_018742556.1,NW_018742616.1,NW_018744348.1,NW_018742616.1,NW_018742733.1等基因通過DNA復(fù)制和異源末端鏈接等通路來響應(yīng)低氮。