孫世浩潘姣姣高佳敏李蓮瑞

(1．塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300)

核糖體RNA是生物體蛋白質(zhì)翻譯的重要組成部分。原核生物含有3種核糖體RNA(rRNA)分別是5S、16S、23S,5SrRNA的編碼基因(rDNA)最小，約為150bp，攜帶的遺傳信息較少；23SrRNA的編碼基因(rDNA)為3kb左右，數(shù)目過于龐大；16SrRNA基因長約1.5kb，而其中又分為可變區(qū)和穩(wěn)定區(qū)2種，其中，可變區(qū)具有種間特異性，恒定區(qū)則差異很小，相比于酶基因其序列保守性高，并且核糖體RNA具有特殊性、重要性等特點，結(jié)構(gòu)獨特并且相對保守，所以可以抵抗影響其結(jié)構(gòu)的突變[1]，針對細菌種屬間16SrRNA基因存在的差異特征，可以對基因序列進行比對分析確定其進化關(guān)系，可以用于鑒別細菌。隨著測序技術(shù)逐漸成熟，細菌基因數(shù)據(jù)庫逐漸更新與完善，利用16SrRNA基因?qū)赀M行測序的分析技術(shù)逐漸成為細菌鑒定的一種重要方法[2]。張玲玲[3]研究了16SrRNA序列的測定對醫(yī)學(xué)微生物的鑒定所起的作用；郭成[4]研究了通過16SrRNA基因測序的方法確定了奶牛瘤胃細菌菌群受到低聚異麥芽糖后發(fā)生的變化；芮萍[5]完成了豬源奇異變形桿菌利用16SrRNA基因測序技術(shù)對基因序列的分析。這種方法時間需求短、準確性高，在微生物鑒定中逐漸流行。

貝萊斯芽胞桿菌能夠利用葡萄糖、糖原、乳糖、麥芽糖、蔗糖等糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。貝萊斯芽胞桿菌能夠?qū)ρ?、淀粉、明膠和酪蛋白進行水解，在沒有酵母提取物的培養(yǎng)基上貝萊斯芽胞桿菌也能夠生長。V-P試驗顯示該菌是發(fā)酵型[6]。利用16SrRNA鑒定菌株，通過數(shù)據(jù)庫比對確定其種屬，確定其是否會對生物制品品質(zhì)產(chǎn)生影響，為進一步研究該細菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

原料乳，由南疆某乳制品企業(yè)提供保存?zhèn)溆?，用于分離芽胞桿菌。

1.1.2 試劑

基因組提取試劑盒，凝膠回收試劑盒，PMD-19T，16SrRNA通用引物，溶菌酶，Tap DNA聚合酶。

1.2 試驗方法

1.2.1 異常原料奶中芽胞桿菌的篩選、分離、純化

在無菌操作臺上無菌操作將乳樣分裝到無菌的250mL錐形瓶中100mL。將取出的乳樣80℃水浴20min，水浴后的乳樣用無菌蒸餾水倍比稀釋5個梯度，然后用涂布法分別接種于錳鹽營養(yǎng)瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂和嗜冷菌計數(shù)瓊脂，倒置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對培養(yǎng)出來的菌進行細菌菌落形態(tài)觀察，選取菌落形態(tài)不同的菌落，在對應(yīng)的瓊脂上劃線，純化培養(yǎng)。純化后的細菌進行制片然后染色鏡檢，觀察菌體特征和芽胞染色情況，并記錄。選取有芽胞的，接種到無菌的液體培養(yǎng)基中，180rpm，37℃培養(yǎng)過夜，增加菌體濃度，用于DNA提取。

1.2.2 提取菌株的DNA

取1mL過夜培養(yǎng)后的細菌菌液加到無菌的離心管中，12000g離心1min，將上清部分去除，重復(fù)1次，收集適量細菌。

按照北京全式金生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒(M10208)的說明書提取細菌的DNA。

1.2.3 菌株的16SrRNA擴增

利用通用的引物擴增芽胞桿菌16SrRNA的全長序列。

所用的引物序列為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R:5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR擴增的反應(yīng)體系為1μL的DNA模板；1μL的上游引物和1μL的下游引物；25μL的EasyTaq Super Mix，加入ddH2O補至50μL。

PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))反應(yīng)條件為預(yù)變性：94℃，5min；變性：94℃，30S；退火：55℃，30S，延伸：72℃，90S；35個循環(huán)，72℃反應(yīng)10min進行再次延伸。配置1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.4 菌株16SrRNA的克隆鑒定

對PCR產(chǎn)物切膠回收，然后分為2組，第1組按照16SrRNA片段0.5μL，pMD-19T Vector 3.5μL，Solution I 6μL的反應(yīng)體系，連接16SrRNA與pMD-19T。第2組為pMD-19T載體自連，將16SrRNA片段換為ddH2O即可。將2組連接物分別加入10～100μL感受態(tài)克隆細胞DH5α中，放于冰水中混合30min，42℃熱沖擊90s，再置冰水中混合1min，加入800μL含有Amp加(50μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基，于37℃的環(huán)境中，200rpm振蕩培養(yǎng)1h，取轉(zhuǎn)化菌100μL分別涂布于含有Amp加(50μg·mL-1)的瓊脂平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12h，長出單菌落后，挑取單獨的菌落，放到含有Amp加(50μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將2組分別提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進行電泳鑒定，然后以芽胞桿菌的16S rDNA克隆質(zhì)粒為模板用通用引物進行PCR擴增，后經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，鑒定克隆質(zhì)粒。

1.2.5 測序

對鑒定后的陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA后，送測序。

1.2.6 序列分析

測序所得的序列在NCBI上進行核苷酸序列比對，鑒定該芽胞桿菌的種屬。

2 結(jié)果分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

由圖1可看出，該菌株屬于革蘭陽性菌，有芽胞產(chǎn)生，形狀為啞鈴狀，乳白色，邊緣較為粗糙。

圖1 菌株的形態(tài)特征

2.2 菌株的基因組、菌株的16SrRNA擴增、克隆、菌株及克隆質(zhì)粒PCR的電泳結(jié)果

圖2中左上為菌株基因組的電泳結(jié)果，為基因組提取完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳得到的結(jié)果，結(jié)果顯示，只有1條明亮的條帶，大小約為在1500bp，說明該菌基因組被成功提取，后續(xù)試驗可以正常進行。

圖2中右上為菌株的16SrRNA擴增后的電泳結(jié)果，該芽胞桿菌使用細菌16SrRNA通用引物序列擴增后，使用細菌16SrRNA通用引物序列擴增出了該芽孢桿菌的16SrRNA的基因條帶大小約為1500bp，與預(yù)期大小一致，說明PCR擴增得到了16SrRNA基因序列。

圖2中左下為質(zhì)粒PCR的鑒定結(jié)果(M∶DL-2000 Marker，1∶pMD-19T載體自連質(zhì)粒電泳結(jié)果，2∶芽胞桿菌的16SrDNA克隆的質(zhì)粒電泳結(jié)果)，pMD-19T質(zhì)粒小，泳動速度快，在2000bp以下，pMD-19T細菌的16SrDNA質(zhì)粒較大，泳動速度慢，在pMD-19T質(zhì)粒之后，與預(yù)期大小一致。

圖2 菌株電泳結(jié)果圖

圖2中右下為菌株16SrRNA克隆質(zhì)粒PCR結(jié)果，可看出克隆質(zhì)粒PCR擴增出的基因大小約為1500bp，與目的基因大小相同，證明該克隆為陽性克隆，可以送測序。

2.3 菌株的16SrRNA的序列信息和比對結(jié)果

用通用引物測序所得到的基因序列去掉相關(guān)載體序列后，得到了菌株全長16SrRNA的序列信息。菌株的16SrRNA為1499bp，并將其提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進行核酸比對，經(jīng)由NCBI/blast比對后，用mega6.0軟件，根據(jù) Neighbor-Joining法，并以Kimura2-parameter為模型，繪制基于菌株的16SrRNA全長序列的分子進化樹，進行1000次建樹自展。

由進化樹分析知，菌株與Bacillus velezensis strain Lac05D這種菌株親緣關(guān)系最近(如圖3所示)。

圖3 以NJ法繪制的菌株進化樹

3 討論

目前，微生物鑒定常用的方法有生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定。生化鑒定出現(xiàn)較早，因其操作簡單被普遍使用，但生化鑒定也有其缺點，如耗時長、耗費大，當不同的微生物的生理與生化性質(zhì)相似時不能夠進行準確分辨等；后來出現(xiàn)的全自動微生物鑒定系統(tǒng)的原理也是根據(jù)微生物的生化反應(yīng)結(jié)果進行判定，因此需要先培養(yǎng)純化所需要鑒定的微生物，然后根據(jù)各種生化反應(yīng)的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對給予相應(yīng)的判定結(jié)果，所花費的時間較長，而且目前該數(shù)據(jù)庫信息有限，無法將所有的微生物生化反應(yīng)信息進行記錄，也只能對一些常見的微生物進行鑒定；而分子生物學(xué)的方法則更加迅速、精準，只需對微生物部分特異性較強的基因序列進行擴增，就可確定其微生物的種屬，時間所需較少，準確率也較高，因此被廣泛應(yīng)用于各大領(lǐng)域。16SrRNA具有高度的保守性，使其可以被稱為細菌化石，通過對16SrRNA進行克隆，并測出基因序列，便可以對細菌的菌屬作出判斷。本次試驗通過對菌株的16SrRNA的PCR擴增，然后將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫進行比對，對其種屬進行鑒定。本研究所用的引物為通用引物，特異性較弱，另外PCR反應(yīng)過程中會出現(xiàn)假陽性，在擴增16SrRNA時很容易出現(xiàn)試驗誤差。因此，試驗過程中的各個步驟，如微生物的純化培養(yǎng)、挑取單克隆的操作、PCR反應(yīng)的體系及PCR反應(yīng)的條件，需進行嚴格控制以及反復(fù)摸索，為使16SrRNA能夠成功擴增，在試驗中設(shè)置了pMD-19T自連質(zhì)粒的空白對照，使得利用16SrRNA序列分析結(jié)果的準確性得到保證[8]。

由蔡高磊等[9]撰寫的關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌研究進展，具體描述了貝萊斯芽孢桿菌的菌落形態(tài)，本次試驗中菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果和菌落形態(tài)結(jié)果符合，并且通過16SrRNA的鑒定及進化樹的分析也證明，菌株與Bacillus velezensis strain Lac05D同源性最高，可以確定菌株為“Operational Group B.amyloliquefaciens”分類單元的B.velezensis[10]。