瑪依拉·吐爾地別克
(伊犁師范大學(xué),新疆 伊寧 835000)
植物內(nèi)生細(xì)菌是指能夠在健康植物組織內(nèi)繁殖,且與宿主植物建立共生關(guān)系狀態(tài)的一類微生物,具有生物防治、植物促生長和內(nèi)共生固氮等作用[1]。通常由于內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物存在長期的共生關(guān)系,從而造成這類細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能不同于其土壤細(xì)菌和植物根際細(xì)菌,其中,可與宿主植物產(chǎn)生相同或相似的次生代謝產(chǎn)物為這部分內(nèi)生菌的特點[2]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),目前大部分藥用植物生長周期長,提取有效成分步驟繁瑣,生物藥學(xué)資源量較少,對于和植物產(chǎn)生共生關(guān)系的內(nèi)生微生物的生長周期短,最重要的內(nèi)生菌可產(chǎn)生與宿主植物相似的一些次級代謝產(chǎn)物,可以有效利用微生物來產(chǎn)生具有藥用價值的次級代謝產(chǎn)物,也可豐富生物資源[3]。作為中藥的烏頭類植物,具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎、抗休克、擴(kuò)張外周血管、抗氧化等作用。目前對于烏頭的研究報道常見于其藥效、有效藥用成分的提取、毒性、種植、田間管理和病蟲害的防治等[4]。綜上述研究可知,許多植物中的天然化合物與其內(nèi)生菌具有密切聯(lián)系,甚至是內(nèi)生細(xì)菌的次級代謝產(chǎn)物,這也就造成國內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)加強對植物內(nèi)生菌的研究,由此發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生抗癌物質(zhì),為解決抗癌藥物的供應(yīng)問題開辟一條新道路。從上述研究結(jié)果可知,烏頭的許多化學(xué)成分均具有抗腫瘤、抗菌和鎮(zhèn)痛等生物學(xué)活性,且表現(xiàn)廣泛,具有良好的開發(fā)潛力。
試驗所用供試菌株YACX-1、YACX-2、YACX-3的3株菌株為具有抑菌活性內(nèi)生細(xì)菌,指示菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)CGMCC1.1103株,枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.769,均由伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院微生物實驗室保存。主要培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基。
1.2.1 菌種的活化
將實驗室所保藏的已分離、純化保存的3株內(nèi)生細(xì)菌種接于NB固體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)活化3代,并儲存于4℃冰箱備用。同時將作為指示菌的大腸桿菌、枯草芽胞桿菌的單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基上,于37℃下培養(yǎng),并儲放于4℃冰箱,備用于抑菌試驗。
1.2.2 具有抑菌活性內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的制備
將活化好的3種菌株接種于NB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,8000r·min-1,20min,取上清液,置于4℃的冰箱中保存并使用。
1.2.3 不同發(fā)酵條件對抑菌活性物質(zhì)的影響
在NB培養(yǎng)基上接種活化好的3種菌株,分別將溫度為28℃、37℃、42℃和pH設(shè)置為6.0、7.0、8.0,其中培養(yǎng)時間可分別設(shè)置成16h、24h,再離心收集上清液,用0.22μm過濾器過濾除菌,將100mL發(fā)酵液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1mL后觀察抑菌圈大小。
1.2.4 不同熱處理和不同pH對菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響
吸取100μL供試菌菌懸液加入平板表面,用涂布器將菌液涂布均勻。在溫度和pH的處理中將具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌的3種菌株發(fā)酵液分別置于溫度45℃、60℃、80℃、100℃下熱處理10min,設(shè)置pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,過夜培養(yǎng)。之后即可采用紙片法對不同菌株設(shè)置2個重復(fù),將紙片放入含有指示菌的待測培養(yǎng)皿中,放置于37℃下,過夜培養(yǎng),并用游標(biāo)卡尺測抑菌圈直徑并記錄。
在3種菌株分別對2種指示菌的抑菌活性的檢測中由圖1至圖3中可知,YACX-1、YACX-2、YACX-3等3株菌株的發(fā)酵液在pH值為7,時間為16h時抑菌效果最佳。在最適pH和時間為基礎(chǔ)的情況下,可將溫度分別調(diào)節(jié)設(shè)為28℃、37℃、42℃時,可得出菌株的最適生長溫度為37℃。由此可表明,具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌最適生長條件為37℃,pH值為7,時間為16h。
圖1 28℃下3株具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性
圖2 37℃下3株具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性
圖3 42℃下3株具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性
具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)過不同的溫度處理時,其抑菌大小(mm)效果的變化如圖4可知,YACX-1、YACX-2、YACX-3所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在45℃抑菌效果最好,抑菌圈分別可達(dá)到8mm、10mm、9mm,在60℃、80℃和100℃,10min處理后有所降低。綜上所述,YACX-2菌株抑菌性耐高溫,故而在后期的內(nèi)生細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物中可有效利用并進(jìn)行研究。
圖4 不同溫度下具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌抑菌活性穩(wěn)定性檢測
具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌對不同pH的穩(wěn)定性如圖5所示,在pH值為4時,YACX-1、YACX-2和YACX-3均無生長;對大腸桿菌的抑菌效果從強到弱為,在pH值為5時,YACX-2>YACX-3>YACX-1;在pH值為6時,YACX-2、YACX-1>YACX-3;在pH值為7時,YACX-2>YACX-3>YACX-1;在pH值為8時,YACX-3>YACX-2>YACX-1。對枯草芽孢桿菌的抑菌效果從強到弱為,在pH值為5時,YACX-3>YACX-2>YACX-1;在pH值為6時,YACX-1、YACX-2>YACX-3;在pH值為7時,YACX-2>YACX-1>YACX-3;在pH值為8時,YACX-2>YACX-3>YACX-1。綜上述可知,具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌在酸性條件下不易生長,卻較為耐堿,這可為內(nèi)生細(xì)菌的活性物質(zhì)的研究打下基礎(chǔ)。
圖5 具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌對不同pH抑菌性的檢測
在本試驗中,對具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌抑菌活性的最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化包括對溫度、pH、時間的研究。分別將培養(yǎng)溫度設(shè)為28℃、37℃、42℃,pH為6、7、8,培養(yǎng)時間為16h、24h的條件下采用紙片法測定抑菌圈的大小。結(jié)果可知,菌株的最適培養(yǎng)條件為37℃、pH值為7、時間為16h。在對于具有抑菌活性烏頭內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)特性研究中,其YACX-1菌株具有良好的熱穩(wěn)定性,耐高溫,抑菌活性也較為穩(wěn)定,而烏頭內(nèi)生細(xì)菌在堿性條件下抑菌活性由強到弱依次為YACX-2>YACX-1>YACX-3。由此可知,烏頭內(nèi)生菌耐堿、耐高溫,故而可在后期研究中有效利用烏頭內(nèi)生細(xì)菌次級代謝產(chǎn)物,并用于藥用植物烏頭活性成分的分離提取與純化,這也恰恰表明了烏頭許多有效成分表現(xiàn)廣泛,具有較好的開發(fā)潛力,可為抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和抗菌性等打下良好的基礎(chǔ),且表明了烏頭內(nèi)生細(xì)菌具有重要的開發(fā)價值,為尋找具有抗菌、耐高溫的活性次生代謝產(chǎn)物可有效利用提供參考依據(jù)。