郝方嘉，彭媛媛，趙琳靜

（上海工程技術(shù)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,上海 201620）

潰瘍性結(jié)腸炎 (Ulcerative Colitis，UC) 是一種由多種因素引起的炎癥性腸病，臨床主要表現(xiàn)為持續(xù)性或反復(fù)性發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便等[1]，病況反復(fù)遷延，且有癌變風(fēng)險(xiǎn)[2].目前，關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，通常認(rèn)為與遺傳和環(huán)境因素引起的腸道微生物組成變化和腸黏膜屏障損傷有關(guān).現(xiàn)有的治療藥物主要包括柳氮磺吡啶水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑[3].這些藥物可以暫時(shí)緩解癥狀，但是容易引起消化道出血、皮疹、代謝紊亂、白內(nèi)障、青光眼等多種副作用，此外還可能引發(fā)一系列感染.

潰瘍性結(jié)腸炎屬中醫(yī)學(xué)“痢疾”范疇.中醫(yī)藥療法在促進(jìn)腸黏膜恢復(fù)、緩解臨床癥狀、減少?gòu)?fù)發(fā)方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì).據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在我國(guó)有超過(guò)20%的潰瘍性結(jié)腸炎患者采用純中藥治療，59%患者采用中西醫(yī)結(jié)合治療[4].Zhao 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)氣養(yǎng)陰類民間經(jīng)方黃芪?枸杞子藥對(duì)可顯著改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體重、腹瀉及結(jié)腸黏膜損傷，有效促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖.但由于化學(xué)成分復(fù)雜，關(guān)于黃芪?枸杞子配伍治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué) (network pharmacology)[6]是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過(guò)對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，從整體觀角度認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)的新學(xué)科.相比以往“一個(gè)藥物、一種基因、一種疾病”的新藥研發(fā)模式，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)為多成分、多靶點(diǎn)、多通路互作的復(fù)雜藥物的作用和機(jī)制研究提供了強(qiáng)有力的手段[7].本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)挖掘黃芪?枸杞子藥對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路，探討可能的作用機(jī)制，為兩藥配伍抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的循證研究提供參考數(shù)據(jù).

1 數(shù)據(jù)來(lái)源與方法

1.1 中藥化學(xué)成分及候選靶點(diǎn)

通過(guò)整合藥理學(xué)平臺(tái)(Integrative Pharmacologybased Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP)(http://www.tcmip.cn/)[8?9]的“中藥材數(shù)據(jù)庫(kù)”“中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)”“中藥靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)”“疾病相關(guān)分子庫(kù)”等數(shù)據(jù)庫(kù)資源，檢索中藥黃芪和枸杞子所有化學(xué)成分及相關(guān)靶點(diǎn)，并收集潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)基因和蛋白靶點(diǎn)，對(duì)中藥成分及相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行功能分析.以兩倍“節(jié)點(diǎn)連接度”中位數(shù)為卡值，選取中藥成分靶標(biāo)和疾病基因互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)，根據(jù)“節(jié)點(diǎn)連接度”“節(jié)點(diǎn)緊密度”“節(jié)點(diǎn)介度”3 個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值，篩選黃芪?枸杞子藥對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵作用靶標(biāo).

1.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò) Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.uniprot.org/)對(duì)收集的基因信息和蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行校正，物種設(shè)置為 Human，獲得各靶點(diǎn)的Uniprot ID.將上述靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白互作 (Protein-Protein Interactive,PPI) 關(guān)系數(shù)據(jù)，進(jìn)一步利用 Cytoscape 3.7.1 軟件(https://cytoscape.org/) 構(gòu)建PPI 可視化網(wǎng)絡(luò).

1.3 基因功能和信號(hào)通路富集分析

將黃芪?枸杞子配伍調(diào)控潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù) (https://david.ncifcrf.gov/)，設(shè)置物種及背景為Homo sapiens (Human)，進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO) 功能富集和京都基因與基因組百科全書(shū) (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) 信號(hào)通路富集分析，獲得黃芪?枸杞子藥對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)的基因功能及參與的信號(hào)通路.

GO 富集分析主要包括生物過(guò)程 (Biological Process，BP)、細(xì)胞組成 (Cellular Component，CC)和分子功能 (Molecular Function，MF) 3 個(gè)部分，分別按照p值篩選排名前30 位的條目進(jìn)行分析.KEGG 富集分析按照p值選取排名前 30 位的條目進(jìn)行分析，并將富集分析結(jié)果可視化.

1.4 “中藥?核心成分?關(guān)鍵靶點(diǎn)?主要通路”多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用 TCMIP 平臺(tái)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)計(jì)算模塊，構(gòu)建“中藥?核心成分?關(guān)鍵靶點(diǎn)?主要通路”多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘黃芪?枸杞子配伍抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)和主要信號(hào)通路.

2 結(jié)果

2.1 黃芪?枸杞子藥對(duì)的化學(xué)成分及候選靶標(biāo)篩選

本研究收集黃芪和枸杞子化學(xué)成分共計(jì)89 個(gè).黃芪中29 種化學(xué)成分對(duì)應(yīng)基因和蛋白靶點(diǎn)77 個(gè)，枸杞子中60 種化學(xué)成分對(duì)應(yīng)蛋白靶點(diǎn)229 個(gè)，其中，23 種蛋白靶點(diǎn)為兩藥共有靶點(diǎn).對(duì)中藥成分潛在靶標(biāo)的基因功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及氧化還原過(guò)程、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、L?抗壞血酸結(jié)合、鐵離子結(jié)合、胞外甘氨酸門控氯通道活性、磷脂及磷脂酰膽堿生物合成等.

2.2 黃芪?枸杞子藥對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎的候選靶標(biāo)相互作用分析

利用TCMIP 數(shù)據(jù)庫(kù)的網(wǎng)絡(luò)計(jì)算技術(shù)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣髦担Y選黃芪?枸杞子抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的候選靶標(biāo)，構(gòu)建候選靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示.此網(wǎng)絡(luò)中包含146 個(gè)節(jié)點(diǎn)和510 條邊，分別代表候選靶標(biāo)及其相互作用.節(jié)點(diǎn)大小代表連接度 (degree)大小.表1 顯示了連接度 >10 的23 個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鲄?shù).

表1 黃芪?枸杞子藥對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)鍵靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鲄?shù)Table 1 Network topological parameters of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

圖1 黃芪?枸杞子藥對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎的候選靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Candidate target interaction network of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

2.3 GO 功能富集分析

通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)2.2 中描述的關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行 GO 功能富集分析.以p<0.05、FDR <0.05 為篩選條件，共獲得BP 相關(guān)條目217 個(gè)，CC 相關(guān)條目20 個(gè)，以及MF 相關(guān)條目43 個(gè).各取排名前10 位的條目，結(jié)果如圖2 所示.BP 相關(guān)前10 位條目主要涉及凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路等；CC 相關(guān)前 10 位條目主要涉及質(zhì)膜、核質(zhì)等；MF 相關(guān)前10 位條目主要涉及ATP 結(jié)合、蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等.

圖2 黃芪?枸杞子治療潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)鍵靶標(biāo)的GO 功能富集分析圖Fig.2 GO network enrichment analysis of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

2.4 KEGG 通路富集分析

對(duì)黃芪?枸杞子抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行 KEGG 通路富集分析，以p<0.05、FDR <0.05 為篩選條件，共獲得相關(guān)信號(hào)通路125 個(gè).按照p值取前30 個(gè)重要通路，結(jié)果如圖3 所示.主要涉及趨化因子信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、JAK/STAT 信號(hào)通路、Toll 樣 受 體 (Toll-Like Receptors,TLRs) 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子 (TNF)信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子 (NF-κB) 信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等重要免疫和炎癥相關(guān)通路.此外，也與一些癌癥通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路、鞘脂類信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等有關(guān).

圖3 黃芪?枸杞子治療潰瘍性結(jié)腸炎關(guān)鍵靶標(biāo)的KEGG 通路富集分析圖Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Astragalus membranaceus and Lycium barbarum for UC

2.5 “中藥?核心成分?關(guān)鍵靶點(diǎn)?主要通路”多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

黃芪?枸杞子治療潰瘍性結(jié)腸炎的“中藥?核心成分?關(guān)鍵靶點(diǎn)?主要通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖4所示.此網(wǎng)絡(luò)中包含40 個(gè)節(jié)點(diǎn)和74 條邊，涉及9 個(gè)潛在活性成分、11 個(gè)作用靶點(diǎn)及18 個(gè)信號(hào)通路.結(jié)果表明，黃芪?枸杞子藥對(duì)活性成分可通過(guò)作用于磷脂酶D1/2 (PLD1/2)、前列腺素 G/H 合成酶 1/2 (PTGS1/2)、過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ(PPARG)、趨化因子CCL8、腺苷A3 受體 (ADORA3) 等關(guān)鍵靶點(diǎn)，參與NF-κB、TNF、趨化因子、T細(xì)胞受體 (TCR)、B 細(xì)胞受體 (BCR) 等免疫和炎癥相關(guān)重要信號(hào)通路，發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎作用.

圖4 “中藥?核心成分?關(guān)鍵靶點(diǎn)?主要通路”多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig.4 "Herb-composition-target-pathway" multidimensional network diagram

3 結(jié)語(yǔ)

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究黃芪?枸杞子藥對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎的活性成分和可能的作用機(jī)制，結(jié)果顯示兩藥配伍可能通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)免疫和炎癥相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮抗UC 作用.黃芪中活性成分毛蕊異黃酮 (Calycosin)、異鼠李素(Isorhamnetin) 等可作用于PTGS2 發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎作用[10]；PTGS2 (COX-2) 是一種可誘導(dǎo)酶，介導(dǎo)前列腺素的合成，在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用.實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，黃芪多糖也可減少調(diào)節(jié)核因子-κB (NF-κВ) DNA 磷酸化活性，并下調(diào)腫瘤壞死因子 (TNF-α) 和白介素 (IL-1β,IL-6,IL-17) 等多種炎癥因子表達(dá)[11].同時(shí)，研究表明枸杞子提取物可降低右旋糖酐硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的趨化因子 (C-X-C motif) 配體1 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1) 以及炎癥介質(zhì)白介素-6 (IL-6) 和環(huán)氧化酶-2 (COX-2) 表達(dá)[12].Sharma 等[13?14]報(bào)道了枸杞子提取物通過(guò)NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 等信號(hào)通路和激酶的表達(dá)，抑制腸道炎癥，促進(jìn)腸黏膜損傷修復(fù).這些研究從不同角度驗(yàn)證了本研究發(fā)現(xiàn).后續(xù)將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，對(duì)篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路繼續(xù)開(kāi)展細(xì)胞及動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，全面揭示黃芪?枸杞子配伍通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥與免疫治療潰瘍性結(jié)腸炎的分子機(jī)制，為中醫(yī)藥抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的基礎(chǔ)和臨床研究提供科學(xué)數(shù)據(jù).