安 菁，劉歡語(yǔ)，鄭 艷，程 俊，宋 春*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究所，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，累積農(nóng)膜使用量已超過(guò)250萬(wàn)t[1]。大塊的農(nóng)膜經(jīng)破碎、風(fēng)化等一系列作用逐漸變?yōu)榱捷^小的塑料碎片，最終以微塑料的形式滯留在土壤中[2]。由于含微塑料有機(jī)廢物的循環(huán)利用以及塑料地膜的大量使用，農(nóng)業(yè)土壤中積累的微塑料積累量實(shí)際上比水域生態(tài)系統(tǒng)更多[3-4]。Zhang G.S.等[5]于2016年調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國(guó)西南地區(qū)土壤團(tuán)聚體中微塑料的平均豐度為18 760個(gè)/kg土壤，其中粒徑＜1 mm的微塑料豐度最高，且塑料顆粒在耕地土壤中的積累日益增長(zhǎng)。

研究表明，微塑料具有高疏水性和較大的比表面積，其在環(huán)境中通常難以降解，對(duì)環(huán)境的危害主要表現(xiàn)為以下兩方面：一是通過(guò)生態(tài)循環(huán)進(jìn)入生物體引起細(xì)胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、氧化應(yīng)激及損傷和行為異常等生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致生物死亡；二是吸附周圍環(huán)境污染物和病原體，通過(guò)食物鏈傳遞、富集，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成威脅[6]。土壤環(huán)境中微塑料的殘留會(huì)通過(guò)一系列物理和化學(xué)作用抑制土壤微生物的活性，進(jìn)而對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育造成一定影響[7-8]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)微塑料生理毒性的研究多集中于水體動(dòng)物，對(duì)陸地植物的影響研究剛剛起步[9]，關(guān)于土壤微塑料殘留對(duì)高等植物生長(zhǎng)脅迫及植物對(duì)此作出的抗性反應(yīng)鮮見報(bào)道。本研究通過(guò)向土壤中添加聚氯乙烯微塑料顆粒，分析土壤微塑料不同殘留量下大豆苗期生長(zhǎng)發(fā)育及生理生化特征，旨在探討農(nóng)田土壤微塑料殘留對(duì)農(nóng)作物的生態(tài)毒理效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2019年5月—6月在日光型人工氣候室（白天溫度25℃，夜晚溫度20℃，相對(duì)濕度60%）內(nèi)進(jìn)行。供試土壤采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)基地，土壤基本理化性狀如表1所示。供試大豆品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N南豆12，由四川省南充市農(nóng)科院提供。微塑料材質(zhì)為粒徑＜15 μm的PVC顆粒，以下簡(jiǎn)稱mPVC，購(gòu)自東莞市靜天塑料原料有限公司。盆栽試驗(yàn)栽培盆子尺寸為40 cm×22 cm×11 cm，每盆裝風(fēng)干土10 kg。

表1 供試土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil tested

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理，即對(duì)照（CK），以田間農(nóng)膜殘留量151 kg/hm2[5]為依據(jù)，換算為盆栽微塑料添加量為 0.054 g/kg，CK 的 10倍（T1）、30倍（T2）和 50 倍（T3），微塑料添加量分別為 0.54、1.62和2.70 g/kg土壤。每個(gè)處理重復(fù)3次。每盆播種大豆12粒（定植9株），出苗后每日觀察苗情長(zhǎng)勢(shì)及土壤水分，用噴壺灌溉補(bǔ)充水分，保證土壤水分充足。

1.3 樣品采集與測(cè)定

1.3.1 株高、葉面積、根鮮重的測(cè)定

分別于大豆出苗后第7、14和21天測(cè)定株高，并進(jìn)行破壞性取樣，每次每盆取3株植物樣。將大豆植株分為地上部和地下部。采取主莖或主枝頂部新長(zhǎng)成的健壯葉或功能葉采用數(shù)格子法[10]測(cè)定葉面積。將根系用自來(lái)水清洗干凈，用吸水紙吸出多余水分，測(cè)定根鮮重。

1.3.2 根系活力的測(cè)定

采用-萘胺法[11]測(cè)定植物根系活力。

1.3.3 葉綠素含量

采用分光光度法[12]，用乙醇提取植物葉片中的葉綠素，根據(jù)Lambert-Beer定律在645、663 nm波長(zhǎng)下測(cè)得植物葉片葉綠素a、葉綠素b含量。

1.3.4 葉片SOD、POD和CAT活性、MDA和可溶性蛋白含量的測(cè)定

采用四氮唑藍(lán)（NBT）法[13]測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈創(chuàng)木酚顯色法[13]測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性，紫外分光光度法[13]測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性；在酸性高溫條件下采用硫代巴比妥酸（TBA）法[14]測(cè)定中丙二醛（MDA）含量；用常規(guī)的考馬斯亮藍(lán)（G-250）法[15]測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析法（ANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析。采用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微塑料對(duì)大豆植株形態(tài)的影響

不同微塑料殘留量土壤中大豆的葉面積、株高和根鮮重如圖1所示。大豆出苗后第7天，與CK相比，處理 T1、T2和 T3的葉面積均顯著降低（P＜0.05），分別降低了6.2%、12.7%和9.9%；處理T2和T3的株高分別降低了6.4%和16.5%（P＜0.05）；處理T3的根鮮重降低了21.5%（P＜0.05）。大豆出苗后第14天，與CK相比，處理T2和T3的葉面積分別降低了17.6%和 25.4%（P＜0.05）；處理 T1、T2和 T3的株高分別降低了 17.1%、14.3% 和 21.8%（P＜0.05）；處理 T2和 T3的根鮮重分別降低了18.3%和25.4%（P＜0.05）。出苗后第21天，處理T1、T2和T3的大豆葉面積、株高和根鮮重與CK相比，均無(wú)顯著差異。

圖1 微塑料對(duì)大豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響Figure 1 Effects of microplastics on growth and development of soybean seedlings

2.2 微塑料對(duì)大豆苗期根系活力的影響

根系是植物活躍的吸收器官和合成器官。根的生長(zhǎng)情況和代謝水平即根系活力直接影響大豆地上部分的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)狀況，是植物生長(zhǎng)的重要生理指標(biāo)之一。微塑料添加量的增加對(duì)大豆根系活力均表現(xiàn)出一定的抑制作用（圖2），其中，在大豆出苗后第7天和第21天，T3處理根系活力顯著低于CK，分別降低了2.7%、2.2%；大豆出苗后第14天，與CK相比，處理T1、T2和T3的根系活力分別降低了1.8%、1.7%和 1.3%（P＜0.05）。

圖2 微塑料對(duì)大豆幼苗根系活力的影響Figure 2 Effect of microplastics on root vitality of soybean seedlings

2.3 微塑料對(duì)大豆葉綠素的影響

由圖3可以看出，大豆出苗后第7天，處理T1、T2和T3的葉綠素a/b值與CK相比，均無(wú)顯著差異（圖3A）；處理T1、T2和T3的葉綠素含量（葉綠素a與葉綠素b之和）顯著高于CK（P＜0.05），分別增加了5.2%、4.6%和5.6%（圖3B）。出苗后第14天，處理 T1、T2和 T3的葉綠素含量顯著低于 CK（P＜0.05），分別降低了3.2%、8.5%和2.5%（圖3B）。出苗后第21天，處理T1和T3的葉綠素a/b值顯著低于CK（P＜0.05），分別降低了 13.3%和 12.7%（圖 3A）；處理T1的葉綠素含量與CK相比，降低了13.5%（P＜0.05）（圖 3B）。

圖3 微塑料對(duì)大豆幼苗葉綠素a/b（A）和葉綠素含量（B）的影響Figure 3 Effect of microplastics on chlorophyll a/b(A)and chlorophyll content(B)in soybean seedlings

2.4 微塑料對(duì)大豆抗氧化能力的影響

植物抗氧化能力的強(qiáng)弱體現(xiàn)了其受外界逆境影響的程度。不同mPVC含量對(duì)大豆葉片抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性以及膜質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛（MDA）和細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白）含量均造成了一定程度的影響（圖4、圖5）。大豆出苗后第7天，處理T1、T2和T3的大豆葉片SOD活性顯著提升（圖4A），較CK分別升高了52.4%、67.0%和91.1%（P＜0.05）。大豆出苗后第 14天，處理 T2和T3的SOD活性較第7天降低了近1/2，但仍顯著高于CK（P＜0.05）。大豆出苗后第21天，所有處理大豆SOD活性進(jìn)一步降低，但處理T1、T2和T3的SOD活性仍然顯著高于CK，較CK分別升高了14.8%、18.6%和24.6%（P＜0.05）。POD活性隨著生育時(shí)期的延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)（圖4B）。出苗后第7天和第21天，處理T1、T2和T3的大豆葉片POD活性顯著高于CK，且隨土壤微塑料含量增加而增加。CAT活性在3個(gè)采樣時(shí)期呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)（圖4C），同一取樣時(shí)期，處理間表現(xiàn)出隨土壤微塑料含量增加先升高后降低的趨勢(shì)，T2處理大豆葉片CAT活性最高。

圖4 微塑料對(duì)大豆幼苗超氧化物歧化酶（A）、過(guò)氧化物酶（B）和過(guò)氧化氫酶（C）活性的影響Figure 4 Effects of microplastics on the activity of SOD(A)，POD(B)and CAT(C)in soybean seedlings

除出苗后第14天時(shí)T3處理的MDA含量與CK無(wú)顯著差異外（圖5A），處理T1、T2和T3在大豆出苗后第7、14和21天的MDA含量均顯著低于CK（P＜0.05）。值得關(guān)注的是，在出苗后第7天，隨著微塑料添加量的增加，大豆葉片的MDA含量呈梯度下降趨勢(shì)，處理T1、T2和T3較對(duì)照CK分別降低了23.5%、34.1%和37.9%。

由圖5B可知，大豆出苗后第7天，處理T1、T2和T3的可溶性蛋白含量與CK均無(wú)顯著差異。大豆出苗后第14天，處理T1的可溶性蛋白含量顯著低于CK（P＜0.05）。在出苗后第21天，處理T2大豆葉片的可溶性蛋白含量顯著高于CK和T1（P＜0.05），高濃度處理T3大豆葉片可溶性蛋白含量顯著低于CK、T1和 T2處理（P＜0.05）。

圖5 微塑料對(duì)大豆幼苗丙二醛（A）和可溶性蛋白（B）含量的影響Figure 4 Effects of microplastics on the contents of malondialdehyde(A)and soluble protein(B)in soybean seedlings

3 討論與結(jié)論

微塑料是一種全球性的污染物，它們小到可以被多種生物吸收，甚至可以跨越一些生物屏障。在水生系統(tǒng)中，微塑料已經(jīng)成為藻類、苔蘚蟲、甲藻、等足類、海洋蠕蟲和微生物的浮動(dòng)棲息地[16]，并通過(guò)食物鏈傳遞對(duì)水生生物造成毒害。然而，目前有關(guān)微塑料對(duì)土壤-植物系統(tǒng)毒性的研究報(bào)道較少，其對(duì)陸地植物的作用機(jī)理也尚不清楚[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨土壤中微塑料含量的增加，大豆苗期的表觀生長(zhǎng)呈現(xiàn)出脅迫現(xiàn)象，這與Qi Y.L.等[18]發(fā)現(xiàn)塑料殘留物對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)造成不良影響的結(jié)果一致。徐榮樂等[19]研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)膜殘留明顯阻礙了植物根系對(duì)必需營(yíng)養(yǎng)元素和水分的吸收，導(dǎo)致植物新陳代謝的需求得不到滿足。本研究中，高梯度微塑料添加量處理下，大豆根系活力明顯受到抑制；盡管中低濃度處理下不良影響效應(yīng)減小，但仍低于空白對(duì)照。G.Kalˇíková 等[20]發(fā)現(xiàn) 30～600 μm 的 PE 微珠可以通過(guò)機(jī)械阻斷對(duì)浮萍的根系生長(zhǎng)造成顯著影響。環(huán)境中的微塑料顆粒形狀各異、邊緣粗糙，可能會(huì)對(duì)根尖造成如細(xì)胞壁破損等機(jī)械損傷，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性從而導(dǎo)致根細(xì)胞活性降低，且這種機(jī)械損傷隨著微塑料濃度的增加會(huì)越來(lái)越嚴(yán)重[20]。由此推測(cè)本研究中15 μm mPVC可能是因?yàn)橥ㄟ^(guò)吸附在大豆根系細(xì)胞壁孔洞，擾亂根系對(duì)水分和養(yǎng)分的正常運(yùn)輸或吸收，從而導(dǎo)致大豆生長(zhǎng)受抑。

葉綠素是植物光合過(guò)程的主要參與者，高等植物葉綠素主要包括葉綠素a和葉綠素b兩種，它們?cè)谥参锏纳L(zhǎng)代謝中不斷合成和分解。在不利條件下，葉綠素a/b值的變化可以理解為植物為抵御不良環(huán)境進(jìn)行的一種自我保護(hù)[21]。由圖3A可知，大豆出苗后第7天，各處理的葉綠素a/b值與對(duì)照CK無(wú)顯著差異，表明微塑料在短期內(nèi)對(duì)大豆幼苗光合效率影響不大，這與M.C.Alicia等[22]對(duì)浮萍的七天暴露試驗(yàn)研究結(jié)果一致。然而，通過(guò)對(duì)大豆出苗后第21天葉綠素含量的研究發(fā)現(xiàn)，各處理的葉綠素含量呈低抑制中高恢復(fù)的趨勢(shì)（圖3B），其原因可能是大豆對(duì)微塑料的吸附與吸收主要取決于微塑料顆粒本身的性質(zhì)[23]。在中高濃度下，微塑料不斷團(tuán)聚，團(tuán)聚后的微塑料顆粒粒徑逐漸增大、成為吸附的主要阻礙因素[24]，降低了大豆與微塑料的接觸性，從而減輕了其光合脅迫。

SOD、POD、CAT、MDA 和可溶性蛋白等生理生化參數(shù)可以作為反映植物對(duì)微塑料脅迫下毒理學(xué)反應(yīng)的良好指標(biāo)[25]。通常，如果生物體的活性氧（ROS）水平超過(guò)它的抗氧化活性，就會(huì)引起生物細(xì)胞脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂雙分子層塌陷、細(xì)胞扭曲變形，使細(xì)胞的物質(zhì)能量交換等生長(zhǎng)代謝活動(dòng)受到影響[26]。Sun X.等[9]研究表明＜200 nm 的聚苯乙烯納米級(jí)塑料顆?？杀粩M南芥根系吸收，導(dǎo)致根細(xì)胞中H2O2和O2-含量增加，對(duì)根系及地上部植株生長(zhǎng)造成不良影響。為對(duì)抗ROS的不良影響，植物會(huì)產(chǎn)生一系列用于消除ROS的抗氧化酶和抗氧化劑[27]，其中超氧化物歧化酶（SOD）可催化超氧化物自由基，將其歧化為 H2O2和O2，是清除ROS的第一道防線，CAT和 POD能將H2O2歧化為 H2O和O2，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)。本研究中，微塑料濃度的升高在大豆出苗初期顯著提高了大豆體內(nèi)抗氧化酶SOD的活性（圖 4A），POD 和 CAT活性（圖 4B、4C）也隨土壤微塑料殘留量增加表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，因此促進(jìn)了大豆抗氧化系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)，從而減少了活性氧ROS的積累，降低外界的脅迫與毒害效應(yīng)。這與水體中無(wú)脊椎動(dòng)物在受到微塑料脅迫時(shí)激發(fā)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，從而減少氧化損傷的研究結(jié)果一致[28]。同時(shí)，大豆幼苗葉片中的MDA含量在出苗初期隨土壤微塑料濃度升高顯著下降（圖5A），說(shuō)明上述大豆對(duì)土壤微塑料殘留脅迫表現(xiàn)出的氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕了其細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化程度。目前微塑料對(duì)高等植物的研究較少，但與微塑料類似，納米級(jí)金屬顆粒也存在對(duì)植物的潛在生理毒性，研究表明在菠菜葉面噴施納米TiO2顯著提高了植株SOD、POD等抗氧化酶含量，降低了氧化自由基和MDA含量[29]，與本研究表現(xiàn)出的趨勢(shì)相同。在大豆出苗中后期，葉片中SOD活性逐漸降低，CAT活性先升高后降低，這極有可能是因?yàn)殡S著幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，大豆的生命力不斷增強(qiáng)、合成蛋白質(zhì)的速率逐漸加快（圖5B），產(chǎn)生了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和酶來(lái)調(diào)節(jié)大豆的正常生理活動(dòng)[30]，致使土壤中微塑料顆粒對(duì)其脅迫作用減弱。盡管大豆自身的抗氧化系統(tǒng)能在一定程度上緩解土壤微塑料殘留帶來(lái)的生理毒性脅迫，但在高殘留濃度下，隨生育時(shí)期延長(zhǎng)，大豆的根系活力與對(duì)照相比依舊顯著降低。

綜上所述，本研究結(jié)果表明中高濃度（1.62～2.70 g/kg）微塑料（15 μm mPVC）殘留土壤顯著抑制大豆幼苗的葉面積、株高和根鮮重（大豆出苗后第7天和第14天），隨著植株生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)（出苗后第21天），微塑料對(duì)大豆的生長(zhǎng)影響逐漸減弱。高濃度（2.70 g/kg）mPVC顯著抑制大豆的根系活力。隨著mPVC添加量的升高，大豆幼苗體內(nèi)抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性升高，表明大豆可通過(guò)自身抗氧化酶體系的調(diào)解減輕微塑料造成的脅迫。但在實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)農(nóng)田中農(nóng)膜的回收，以減少土壤微塑料殘留量，降低其對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。