孫會(huì)剛，俞曉丹，陳志軒，張傳麗，湯 薇，李同祥*

（徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇徐州 221018）

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是自然環(huán)境中很常見的一類氧化還原酶，是存在于各種動(dòng)植物及微生物體內(nèi)參與其代謝反應(yīng)的一類金屬蛋白酶[1-3]，它能針對(duì)性地催化多酚類化合物氧化形成與之相對(duì)應(yīng)的醌類物質(zhì)。無論是在工業(yè)的生產(chǎn)過程中還是在微生物研究中，多酚氧化酶都有著極其特殊的地位，其在食品加工、茶葉加工[4-7]過程中具有重要的應(yīng)用，主要涉及到了啤酒釀造、果汁生產(chǎn)過程中的澄清過程以及食用菌的栽培等各個(gè)領(lǐng)域[8-9]。

多酚氧化酶在廣義上可以分為三種類型，即單酚氧化酶、雙酚氧化酶和漆酶[10-12]。而微生物中主要的多酚氧化酶是漆酶。漆酶因首次在日本紫膠漆樹中發(fā)現(xiàn)而得名。產(chǎn)漆酶的微生物主要集中在擔(dān)子菌亞門、子囊菌亞門及半知菌亞門等高等真菌，其中被研究最多的是擔(dān)子菌亞門的白腐真菌[13]。另外，也有發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌如芽孢桿菌產(chǎn)較高活性漆酶的報(bào)道[14]。盡管產(chǎn)多酚氧化酶的真菌在自然界中較多，關(guān)于竹黃菌產(chǎn)多酚氧化酶的報(bào)道很少，目前國內(nèi)僅有江南大學(xué)胡艷報(bào)道篩選到一株產(chǎn)多酚氧化酶的竹黃菌，經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化后酶活達(dá)到120 U/mL[15-16]。但也有篩選到產(chǎn)漆酶酶活較高的其他屬菌株，如陳中維等[17]篩選要一株黃孢原毛平革菌，經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化后，酶活最高達(dá)到1 459.1 U/mL。國外報(bào)道產(chǎn)多酚氧化酶活性比較高的真菌也多集中于擔(dān)子菌類，如JASIM A[18]報(bào)道菇類含有豐富的多酚氧化酶，具有很高的藥用價(jià)值；DONG S J等[19]報(bào)道毛革蓋菌產(chǎn)生的多酚氧化酶具有很高降解木質(zhì)素的能力；WIKEE S等[20]報(bào)道了來源于海洋的真菌擬盤多毛孢菌產(chǎn)生的多酚氧化酶具有較強(qiáng)的脫色能力。雖然目前篩選到的產(chǎn)多酚氧化酶的菌種很多，但普遍存在酶活較低或者發(fā)酵周期長的缺點(diǎn)。

為了獲得產(chǎn)酶活性高、發(fā)酵周期短的優(yōu)良菌株，本研究采用變色圈法從土壤樣品中分離篩選產(chǎn)多酚氧化酶的菌株，進(jìn)一步對(duì)篩選菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)篩選菌株所產(chǎn)多酚氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為下一步多酚氧化酶的實(shí)際推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

土樣：采集于江蘇溧陽天目湖山水園景區(qū)繡球島茶樹下土壤（CY）、江蘇太倉弇山園內(nèi)竹林中腐葉下土壤（ZL）、江蘇徐州工程學(xué)院內(nèi)綠化帶內(nèi)土壤（XN）。

1.1.2 化學(xué)試劑

α-萘酚：上海展云化工有限公司；L-多巴、對(duì)苯二酚、間苯二酚、十二烷基硫酸鈉（sodium lauryl sulfate，SDS）：合肥博美生物科技有限公司；愈創(chuàng)木酚、焦性沒食子酸、D-山梨醇、硫酸鎂：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水檸檬酸：生工生物工程（上海）股份有限公司；亞硫酸氫鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸錳：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；無水硫酸銅：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；乙二胺四乙酸二鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠；L-抗壞血酸：西隴科學(xué)股份有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。DL2000 DNA Plus Marker：南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；真菌基因組提取試劑盒：南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）：上海博微生物科技有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：為上述PDB培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 g/L。121 ℃滅菌20 min。

愈創(chuàng)木酚、α-萘酚PDA培養(yǎng)基：分別在滅菌PDA培養(yǎng)基中加入經(jīng)過無菌針式過濾器（孔徑0.22 μm）過濾的愈創(chuàng)木酚、α-萘酚乙醇溶液，使培養(yǎng)基中愈創(chuàng)木酚、α-萘酚的最終含量為0.04%。

液體種子培養(yǎng)基：PDB培養(yǎng)基25.0 g，酵母浸粉5.0 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。120 ℃下滅菌20 min。

液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，氯化銨2.5 g，K2HPO43.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CuSO4·5H2O 0.006 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。120 ℃下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

5417R低溫臺(tái)式離心機(jī)：德國艾本德股份公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Synergy H1多功能酶標(biāo)儀：美國BioTek公司；IS-RDD3臺(tái)式恒溫振蕩器：美國晶鉆儀器公司；303-1電熱恒溫培養(yǎng)箱：紹興市銀河機(jī)械儀器有限公司；FlexCycler2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國耶拿分析儀器股份公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的初篩

初篩：取10-4、10-5、10-6三個(gè)梯度的土壤稀釋液各100 μL涂布于愈創(chuàng)木酚PDA平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)6～8 d，每個(gè)梯度3個(gè)平行，仔細(xì)觀察菌落周圍有無紫紅色的變色圈產(chǎn)生，有紫色變色圈產(chǎn)生說明該菌株可能產(chǎn)生多酚氧化酶，多酚氧化酶將其底物愈創(chuàng)木酚氧化成紫紅色的物質(zhì)。變色圈直徑（D）和菌落直徑（d）之比（D/d）越大說明多酚氧化酶酶活越高，挑選出（D/d）值較大且變色圈顏色較深的菌株進(jìn)行劃線分離直至獲得純菌株；將分離得到的純菌株點(diǎn)接到α-萘酚PDA培養(yǎng)基平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)6～8 d，觀察菌落周圍有無紫色的變色圈產(chǎn)生，每個(gè)菌株3個(gè)平行，將有紫色變色圈的菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)6～8 d，4 ℃保存?zhèn)溆肹21]。

1.3.2 菌株的復(fù)篩

（1）粗酶液的制備[22]

將復(fù)篩得到的產(chǎn)多酚氧化酶菌株接種于裝液量為100 mL/250 mL液體種子培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，保存?zhèn)溆谩⒎N子培養(yǎng)液以1%（V/V）的接種量接種至裝液量為100 mL/250 mL液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6～8 d，經(jīng)10 000 r/min、4 ℃離心10～20 min，去除沉淀，上清液即為粗酶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）多酚氧化酶酶活測(cè)定方法[23-24]

在反應(yīng)體系中加入0.1 mol/L，pH 6.0的磷酸鹽緩沖液3mL，后加入1 mL濃度為0.1 mol/L鄰苯二酚溶液以及0.1 mL粗酶液，混合均勻后于波長600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm值）。每隔30 s記錄一次吸光度值變化，連續(xù)測(cè)定10 min。以pH 6.0磷酸鹽緩沖液3 mL和0.1 mol/L鄰苯二酚溶液1 mL作為對(duì)照。多酚氧化酶酶活計(jì)算公式如下：

多酚氧化酶酶活定義[25]：1 mL粗酶液在1 min內(nèi)使得吸光度值變化0.001定義為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.3 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：直接肉眼觀察菌株ZL-2在愈創(chuàng)木酚、α-萘酚PDA培養(yǎng)基上的菌落及其表面菌絲的顏色、形狀，用接種環(huán)挑起菌落觀察其疏松或緊密情況。

采用真菌基因組提取試劑盒提取真菌ZL-2基因組，采用引物ITS1（5'-TCCGTTGGTGAACCTGCGG-3'），ITS4（5'-TCCGTTGGTGAACCTGCGG-3'）擴(kuò)增其ITS序列，PCR體系及擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[26]。

1.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株ZL-2多酚氧化酶活性的影響

參考文獻(xiàn)[13]中的方法并加以修改。將保藏的篩選菌種以1%（V/V）的接種量接種至裝液量為100 mL/250 mL液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)15 d，每天定時(shí)取樣測(cè)定多酚氧化酶酶活。

1.3.5 多酚氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)[27-30]

（1）多酚氧化酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

將磷酸鹽緩沖液、底物和多酚氧化酶粗酶液分別置于4 ℃、9 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃中水浴加熱10 min后測(cè)定酶活，以所測(cè)最大酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，確定多酚氧化酶的最適溫度。

在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃溫度條件下，將粗酶液分別處理1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后測(cè)定酶活，考察多酚氧化酶的熱穩(wěn)定性。

（2）多酚氧化酶的最適pH及酸堿穩(wěn)定性

分別配制pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的11個(gè)不同pH的磷酸鹽緩沖溶液，按照前述方法測(cè)定多酚氧化酶活性，以最大酶活記為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，確定多酚氧化酶的最適pH。

將粗酶液放入pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖液中，密封過夜后，按照前述方法測(cè)定酶活，考察多酚氧化酶pH穩(wěn)定性。

（3）多酚氧化酶最適底物

分別配制0.10 mol/L的鄰苯二酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、間苯二酚、對(duì)苯二酚、L-多巴溶液為底物，測(cè)定多酚氧化酶酶活。以最大酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，確定多酚氧化酶的最適底物。

（4）金屬離子對(duì)酶活性的影響

分別配制6 mmol/L 的MgCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2、CuSO4、Al（NO3）3·9H2O、FeCl3·6H2O溶液，分別取上述溶液0.5 mL，其他條件不變，測(cè)定酶活。以不添加金屬離子的體系所得的酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，考察金屬離子對(duì)酶活性的影響。

（5）抑制劑對(duì)酶活性的影響

分別配制10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L的SDS、檸檬酸、D-山梨醇和L-抗壞血酸溶液，分別取上述溶液0.5 mL，其他條件不變，按照上述酶活測(cè)定方法測(cè)定酶活。以不添加抑制劑的體系所測(cè)得的酶活記為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，考察抑制劑對(duì)酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)多酚氧化酶菌株的初篩和復(fù)篩

從采集的樣品中篩選到三株菌落周圍形成紫紅色變色圈的菌株，分別命名為CY-2、ZL-1、ZL-2，其變色圈直徑（D）和菌落直徑（d）之比（D/d）、顏色強(qiáng)度及變色圈分別見表1和圖1。由表1可知，菌株CY-2、ZL-1、ZL-2的D/d值分別為0.84、1.59、2.38，說明ZL-2菌株產(chǎn)生的多酚氧化酶活性可能較高。由圖1可知，菌絲為白色，菌落質(zhì)地疏松呈絨狀。采用分光光度法測(cè)定三株菌多酚氧化酶的酶活，結(jié)果見表2。由表2可知，其中菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶活最高，可達(dá)393 U/mL。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15]，菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶酶活較高。因此，選擇菌株ZL-2進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

表1 3株產(chǎn)多酚氧化酶菌株變色圈大小和顏色強(qiáng)度Table 1 Color-changing circle size and intensity of 3 strains producing polyphenol oxidase

圖1 多酚氧化酶產(chǎn)生菌株初篩結(jié)果Fig. 1 Preliminary screening results of strains producing polyphenol oxidase

表2 產(chǎn)多酚氧化酶菌株復(fù)篩結(jié)果Table 2 Rescreening results of strains producing polyphenol oxidase

2.2 菌株ZL-2分子生物學(xué)鑒定

以真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4為引物，菌株ZL-2基因組脫氧核糖核酸（DNA）為模板擴(kuò)增ITS序列，電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2。由圖2可知，以真菌PCR基因組DNA為模板擴(kuò)增ITS序列，通過真菌的特異性PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)生了單一DNA片段條帶，與DNA Marker對(duì)比顯示，PCR擴(kuò)增的DNA片段長度約為600 bp，與設(shè)計(jì)的擴(kuò)增序列長度一致。

圖2 菌株ZL-2基于ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of PCR amplification products of strain ZL-2 based on ITS sequence

擴(kuò)增產(chǎn)物送南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將所得序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站上進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析，并用MEGA-X軟件以鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。由圖3可知，菌株ZL-2與竹黃菌屬（Shiraiasp.）進(jìn)化親緣關(guān)系最近（達(dá)到99%）。根據(jù)該菌株的菌落及菌絲特征，鑒定菌株ZL-2為竹黃菌屬（Shiraiasp.）。

圖3 菌株ZL-2基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain ZL-2 based on ITS sequence

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活性的影響

由圖4可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間在0～15 d范圍內(nèi)的增加，多酚氧化酶活性呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)。在培養(yǎng)的第4天產(chǎn)生胞外的多酚氧化酶，才能測(cè)出多酚氧化酶活性，第8天達(dá)到酶活最大值521 U/mL，之后酶活開始逐漸下降，發(fā)酵第15天時(shí)酶活為226 U/mL，僅為最高酶活的43.37%。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間為8 d。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶活性的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on activity of polyphenol oxidase produced by strain ZL-2

2.4 多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 多酚氧化酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性

對(duì)菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶在反應(yīng)溫度4～80 ℃范圍內(nèi)酶活變化進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在反應(yīng)溫度4～30 ℃范圍內(nèi)，酶活隨反應(yīng)溫度升高逐步增加，并在30 ℃時(shí)達(dá)到最高。反應(yīng)溫度＞30 ℃之后，酶活開始降低。因此，該酶的最適反應(yīng)溫度為30 ℃。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶活性的影響Fig. 5 Effect of reaction temperature on activity of polyphenol oxidase produced by strain ZL-2

進(jìn)一步研究菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖6。由圖6可知，在反應(yīng)溫度20 ℃、30 ℃及40 ℃的條件下，3 h內(nèi)酶活較為穩(wěn)定，均可保持初始酶活80%左右，5 h內(nèi)仍然能保持初始酶活的60%以上；反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)，多酚氧化酶熱穩(wěn)定性出現(xiàn)降低，2 h內(nèi)剩余酶活為初始酶活的42.31%，4 h后降為初始酶活的14.26%，其半衰期約為1.5 h；反應(yīng)溫度在60 ℃時(shí)，該酶不穩(wěn)定，約0.5 h即達(dá)到該多酚氧化酶的半衰期，5 h后剩余酶活僅為初始酶活2.15%。結(jié)果表明，該酶在反應(yīng)溫度20～40 ℃時(shí)具有較好的熱穩(wěn)定性，適合應(yīng)用于食品等相關(guān)行業(yè)。

圖6 菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶的溫度穩(wěn)定性Fig. 6 Temperature stability of polyphenol oxidase produced by strain ZL-2

2.4.2 多酚氧化酶的最適pH和酸堿穩(wěn)定性

pH值對(duì)菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶催化活性的影響結(jié)果見圖7。由圖7可知，pH值為3～6時(shí)，酶活逐漸增高，在pH值為6時(shí)達(dá)到最高，為最適pH值，pH值＞6之后，酶活開始逐步下降。結(jié)果表明，該酶的最適pH值為6。

圖7 pH值對(duì)菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶活性的影響Fig. 7 Effect of pH on activity of polyphenol oxidase produced by strain ZL-2

菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶pH值穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見圖8。由圖8可知，菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶經(jīng)pH值為3～6的緩沖溶液處理過夜后，酶活性較穩(wěn)定，剩余酶活能達(dá)到初始酶活的80%以上；在pH值為7～8時(shí)，酶活下降明顯。結(jié)果表明，菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶的酶活性在pH酸性范圍內(nèi)（pH3～6）穩(wěn)定性較好。

圖8 菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶的pH穩(wěn)定性Fig. 8 pH stability of polyphenol oxidase produced by strain ZL-2

2.4.3 多酚氧化酶的最適底物

由圖9可知，多酚氧化酶對(duì)底物的催化能力由大到小分別為鄰苯二酚＞愈創(chuàng)木酚＞焦性沒食子酸＞沒食子酸＞對(duì)苯二酚＞間苯二酚＞L-多巴。因此，該菌株多酚氧化酶最適底物為鄰苯二酚，其次為愈創(chuàng)木酚，對(duì)焦性沒食子酸和沒食子酸有一定催化作用，對(duì)對(duì)苯二酚、間苯二酚和L-多巴而言幾乎沒有催化作用，說明該多酚氧化酶屬于漆酶。

圖9 不同底物對(duì)菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶活性的影響Fig. 9 Effects of different substrates on activity of polyphenol oxidase produced by strain ZL-2

2.4.4 金屬離子對(duì)多酚氧化酶活性的影響

由表3可知，Cu2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+對(duì)該酶都有促進(jìn)作用，其中Cu2+的促進(jìn)作用較明顯，相對(duì)酶活達(dá)到了150.76%，文獻(xiàn)報(bào)道漆酶是一種含銅的氧化酶，銅離子對(duì)其有激活作用[6]。而Ca2+、Al3+對(duì)該菌株酶活具有一定抑制作用。

表3 金屬離子對(duì)菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶酶活影響Table 3 Effects of metal ions on activity of polyphenol oxidase produced by strain ZL-2

2.4.5 抑制劑對(duì)酶活性的影響

由圖10可知，抑制劑SDS、EDTA-2Na、D-山梨醇、檸檬酸、L-抗壞血酸、亞硫酸氫鈉對(duì)多酚氧化酶都有抑制作用，其中抑制作用最強(qiáng)的分別為L-抗壞血酸和亞硫酸氫鈉。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的抑制劑對(duì)多酚氧化酶的抑制也基本一致[13]。

圖10 不同抑制劑對(duì)菌株ZL-2產(chǎn)多酚氧化酶活性的影響Fig. 10 Effects of different inhibitors on activity of polyphenol oxidase produced by strain ZL-2

3 結(jié)論

通過初篩和復(fù)篩，獲得一株產(chǎn)多酚氧化酶活性較高的竹黃菌屬真菌（Shiraiasp.），發(fā)酵8 d其酶活達(dá)到521 U/mL。多酚氧化酶最適底物為鄰苯二酚；最適pH值為6.00；最適溫度為30 ℃；酶活在溫度20～40 ℃及pH 3～6范圍穩(wěn)定。金屬離子Cu2+激活作用最強(qiáng)，Ca2+、Al3+對(duì)酶活有一定抑制作用；L-抗壞血酸和亞硫酸氫鈉對(duì)該酶抑制作用較強(qiáng)。菌株產(chǎn)ZL-2多酚氧化酶酶學(xué)性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道的漆酶的性質(zhì)基本一致，適合應(yīng)用于食品等相關(guān)行業(yè)；該竹黃菌含有優(yōu)良的多酚氧化酶基因，但其發(fā)酵周期較長，下一步可以通過克隆其基因，在原核中進(jìn)行表達(dá)，大大縮短其發(fā)酵周期，有望得到優(yōu)良的產(chǎn)多酚氧化酶基因工程菌。