覃 引，龍鳳媛，張才貴，盧 麗，熊音如，邱樹毅*

（1.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

刺梨（Rosa roxburghiiTratt）屬薔薇科植物，廣泛種植于我國(guó)西南高原地區(qū)。刺梨果實(shí)中富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和功能性成分，如多糖、超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、維生素B（vitamin B，VB）、VC、黃酮、多酚和礦物質(zhì)等，常被用于開發(fā)成飲料、果酒、藥茶和果醬等產(chǎn)品[1]。將成熟的刺梨果實(shí)進(jìn)行壓榨，殘留的果渣量可達(dá)到50%[2]，而刺梨果渣富含膳食纖維（dietary fiber，DF）、維生素等物質(zhì)，且來(lái)源豐富，廉價(jià)易得。紅棗（jujube）屬鼠里科植物棗樹的果實(shí)，廣泛種植于熱帶或亞熱帶地區(qū)。紅棗果實(shí)中含有大量的生物活性物質(zhì)，除三萜酸、酚酸、氨基酸、皂苷、腦苷脂、黃酮類化合物、多糖和礦物質(zhì)等外，還富含膳食纖維[3-4]。紅棗在被加工為紅棗果汁、紅棗果酒等產(chǎn)品過(guò)程中常伴有大量棗渣產(chǎn)生，棗渣多作為廢棄物或直接用作飼料處理，但棗渣中除含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉、天然紅色素外，還含有3.1%的粗纖維[5]。

膳食纖維是一種不能被人體消化道酶分解的一種多糖類及木質(zhì)素，根據(jù)其在水里的溶解性分為水溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）與非水溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）[6]。增加膳食纖維攝入量可以降低某些慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如糖尿病、胃腸道疾病和心血管疾病[7]。此外，膳食纖維的強(qiáng)吸水性可在人體進(jìn)食后在小腸溶脹成膠狀物，增加飽腹感，從而有效控制肥胖[8]。膳食纖維生理功能與可溶性膳食纖維密切相關(guān)，通常天然纖維中SDF含量較低，無(wú)法達(dá)到膳食平衡，此時(shí)需從外界主動(dòng)補(bǔ)充SDF，以保證人體正常工作狀態(tài)。

本研究利用貴州黔寶食品有限公司提供的刺梨果渣和紅棗果渣為原料，采用混合菌種嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）∶保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricus）（1∶1）發(fā)酵制備水溶性膳食纖維，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察水溶性膳食纖維的品質(zhì)及特性，以期為刺梨果渣和紅棗果渣后續(xù)深加工和高效開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

刺梨果渣、紅棗果渣：貴州黔寶食品有限公司。

1.1.2 菌種

德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）（保藏編號(hào)CICC 6047）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）（保藏編號(hào)CICC 20673）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 試劑

MRS液體培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；大豆油（食品級(jí)）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

JS3-005電子分析天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；YB-400型高速多功能粉碎機(jī)：永康市速鋒工貿(mào)有限公司；HR/T16M高速離心機(jī)：湖南赫西儀器設(shè)備有限公司；DHG-9070B恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50L立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器：致微（廈門）有限公司；LRH-70生化恒溫培養(yǎng)箱：成都瑞昌儀器制造有限公司；JB-CJ-2FXS潔凈工作臺(tái)：無(wú)錫優(yōu)派科技有限公司；Nova Nano SEM 450熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡：美國(guó)FEI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵菌種的制備

取保加利亞乳酸桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置活化培養(yǎng)36 h；取嗜熱鏈球菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下靜置活化培養(yǎng)24 h；按菌種量1∶1取兩種菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下混合培養(yǎng)2～3d，采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整菌體濃度在107CFU/mL～108CFU/mL，備用。

1.3.2 可溶性膳食纖維的制備工藝

參考文獻(xiàn)[9-10]的方法稍作修改，取紅棗果渣10 g和刺梨果渣10 g，放入80 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，取烘干后的混合果渣過(guò)100目篩，按料液比1∶20加入適量蒸餾水，混合均勻后于120 ℃條件下滅菌25 min，待冷卻至室溫后，按10%的接種量接入40mL的發(fā)酵菌種，在40℃條件下發(fā)酵66h。

1.3.3 可溶性膳食纖維得率的計(jì)算

發(fā)酵結(jié)束后，轉(zhuǎn)移至50mL離心管，并在25 ℃、8000r/min的條件下離心20 min，離心后取上清液于20 ℃下靜置24 h，加入體積分?jǐn)?shù)95%的無(wú)水乙醇200 mL轉(zhuǎn)入錐形瓶中進(jìn)行醇析，醇析1 h后再次以相同條件離心，棄上清，收集沉淀，放入105 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，即得SDF，計(jì)算SDF得率，其計(jì)算公式如下：

1.3.4 可溶性膳食纖維制備工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以可溶性膳食纖維得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素輪換法依次考察料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）、接種量（6%、8%、10%、12%和14%）、發(fā)酵溫度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）、培養(yǎng)時(shí)間（48 h、54 h、60 h、66 h、72 h）、原料粒度（0.27 mm、0.25 mm、0.18 mm、0.15 mm、0.125 mm）對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響。

1.3.5 可溶性膳食纖維制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以SDF得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取5因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 可溶性膳食纖維制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for soluble dietary fiber preparation process optimization

1.3.6 可溶性膳食纖維理化性質(zhì)的分析

持水力：參考LIU X等[11]的方法稍作修改。取可溶性膳食纖維1.00 g（m1），20 ℃條件下在蒸餾水中浸泡1 h，采用濾紙過(guò)濾，稱質(zhì)量（m2），計(jì)算持水力（water holding capacity，WHC），其計(jì)算公式為：WHC=（m2-m1）/m1。

溶脹性：參考MA R等[12]的方法稍作修改。精確稱取烘干后所得的可溶性膳食纖維0.200 g（m），置于20 mL量筒中，測(cè)其體積V1。20 ℃下精確移取10 mL蒸餾水加入膳食纖維中輕微振蕩，使其保持均勻狀態(tài)，24 h后讀取液體中可溶性膳食纖維的體積V2，計(jì)算溶脹性（swelling ability，SW），其計(jì)算公式為：SW=（V2-V1）/m。

持油力：參考HUANG H等[13]的方法稍作修改。稱取膳食纖維樣品1.00 g（W1），室溫下置于離心管中，加入適量豆油，1 h后過(guò)濾，收集過(guò)濾后的沉淀，稱取沉淀濕質(zhì)量（W2），計(jì)算持油力，其計(jì)算公式為：持油力=（W2-W1）/W1。

1.3.7 可溶性膳食纖維的掃描電鏡分析

取干燥后的發(fā)酵前后的可溶性膳食纖維樣品，研磨后，壓實(shí)，采用掃描電子顯微鏡觀察其顯微結(jié)構(gòu)。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，每組試驗(yàn)重復(fù)3次；用OriginPro9.0軟件繪圖；SPSS25.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性膳食纖維制備工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響

由圖1可知，隨著料液比的減小，可溶性膳食纖維得率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1∶20（g∶mL），可溶性膳食纖維的得率達(dá)到最大，為11.12%。此時(shí)發(fā)酵瓶中的發(fā)酵條件充分滿足菌種的要求。隨著料液比的逐漸減小，紅棗刺梨果渣可溶性膳食纖維的得率開始慢慢降低，分析原因可能是由于菌種和果渣接觸面積不充分，導(dǎo)致發(fā)酵不徹底[14-15]，因此確定最佳料液比為1∶20（g∶mL）。

圖1 料液比對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響Fig. 1 Effect of solid-liquid ratio on soluble dietary fiber yield

2.1.2 接種量對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響

由圖2可知，隨著菌種接種量的增加，可溶性膳食纖維的得率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為10%時(shí)，可溶性膳食纖維的得率達(dá)到最高，為11.30%。分析原因可能是當(dāng)接種量＞10%以后，由于接種量過(guò)高，碳源及氧氣供不應(yīng)求，導(dǎo)致發(fā)酵條件不足，最后可溶性膳食纖維產(chǎn)量降低。同時(shí)菌種的增加，導(dǎo)致大量代謝物慢慢積聚在一起，抑制了菌種的生長(zhǎng)以及產(chǎn)物的生成[16-18]。因此，確定最優(yōu)的接種量為10%。

圖2 接種量對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響Fig. 2 Effect of inoculum on soluble dietary fiber yield

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，可溶性膳食纖維的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度在40 ℃時(shí)，可溶性膳食纖維的得率最大，為11.39%。說(shuō)明此時(shí)溫度增加到適宜菌種生長(zhǎng)的溫度之后，菌種開始生長(zhǎng)和代謝。當(dāng)發(fā)酵溫度低于40 ℃之前，環(huán)境溫度達(dá)不到兩種菌種的生長(zhǎng)溫度，發(fā)酵速度較慢，菌種不生長(zhǎng)代謝，此時(shí)的膳食纖維只能由原料本身代謝，SDF得率較低；當(dāng)發(fā)酵溫度高于40 ℃之后，可溶性膳食纖維得率下降，這可能是由于溫度升高，超過(guò)菌種的適宜環(huán)境，高溫在一定程度上抑制菌種的生長(zhǎng)以及產(chǎn)物的活性，所以膳食纖維的得率降低[19-21]。因此確定最佳發(fā)酵溫度為40 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on soluble dietary fiber yield

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，可溶性膳食纖維得率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為66 h時(shí)，可溶性膳食纖維的得率最高，為11.41%。分析原因可能是當(dāng)發(fā)酵時(shí)間較短時(shí)，可溶性膳食纖維中的原果膠不能充分溶解；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物堆積，導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境pH值減小，進(jìn)而影響菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的產(chǎn)量[22]，同時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷增加，菌種慢慢增長(zhǎng)致使發(fā)酵產(chǎn)物不斷的積累，然后導(dǎo)致體系原料粒度不斷下降，抑制菌體的自身生長(zhǎng)或產(chǎn)生菌體自溶，使菌體產(chǎn)酶效果下降從而導(dǎo)致發(fā)酵能力的下降[23]。因此，確定最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間為66 h。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on soluble dietary fiber yield

2.1.5 原料粒度對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響

由圖5可知，隨著原料粒度的增加，可溶性膳食纖維的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)原料粒度為0.15 mm時(shí)，可溶性膳食纖維得率達(dá)到最高，達(dá)到11.43%。當(dāng)原料粒度＞0.15 mm之后，可溶性膳食纖維得率迅速下降。粒度決定比表面積，在合適的范圍內(nèi)粒度變小，可溶性膳食纖維的比表面積較大，易于溶出；反之難于溶出。但如果粒度＜0.15 mm，破壞了膳食纖維的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，同樣導(dǎo)致難于溶出[24-25]。因此，確定最佳粒度為0.15 mm。

圖5 原料粒度對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響Fig. 5 Effect of raw material granularity on SDF yield

2.2 可溶性膳食纖維制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

可溶性膳食纖維制備工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-behnken tests

續(xù)表

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of response surface tests

續(xù)表

采用Design Expert 11軟件，選用Box-Behnken模型，對(duì)表2中的結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，得到回歸方程Y=11.33+0.063A+0.34B+0.43C+0.069D+0.2E+0.13AB+0.032AC+0.12AD+0.12AE+0.037BC-0.049BD+0.19BE+0.044CD-0.14CE+0.053DE-0.83A2-0.83B2-0.79C2-0.69D2-0.67E2。

由表3可知，模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明該模型的擬合程度較好。模型的決定系數(shù)R2=0.942 7，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.962 2，說(shuō)明該模型試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值間相關(guān)性較高。由表3亦可知，一次項(xiàng)B、C、E及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2、E2均對(duì)SDF得率的影響極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)D及交互項(xiàng)AB、BE、CE對(duì)SDF得率的影響顯著（P＜0.05），其余項(xiàng)對(duì)SDF得率的影響不顯著（P＞0.05），說(shuō)明試驗(yàn)因素對(duì)SDF得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系[26]。

為考察交互項(xiàng)AB、BE、CE對(duì)SDF得率的影響，利用Design-Expert 11軟件做出兩因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，交互作用AB、BE、CE的響應(yīng)面呈凸面，等高線呈橢圓形，對(duì)可溶性膳食纖維得率的影響顯著，該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。采用Design-Expert 11軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行求解，得到發(fā)酵法制取紅棗刺梨果渣SDF的最佳工藝參數(shù)為料液比1∶22（g∶mL）、接種量10.39%、發(fā)酵溫度40.25 ℃、發(fā)酵時(shí)間65.28 h、原料粒度0.16 mm，在此條件下，SDF得率的理論值為11.44%。為便于實(shí)際操作，將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為料液比1∶22（g∶mL）、菌株接種量10%、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時(shí)間65 h、原料粒度0.16 mm。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到刺梨-紅棗果渣SDF的得率為（11.47±0.04）%，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，進(jìn)一步說(shuō)明了該模型適用于預(yù)測(cè)發(fā)酵法制備可溶性膳食纖維的研究。

圖6 各因素交互作用對(duì)可溶性膳食纖維得率影響的響應(yīng)面及等高線Fig. 6 Response surface plots and contour lines of the effect of interaction between various factors on soluble dietary fiber yield

2.3 可溶性膳食纖維特性分析

新鮮果渣與發(fā)酵后果渣中可溶性膳食纖維的特性分析結(jié)果見表4。

表4 發(fā)酵前后刺梨-紅棗果渣中可溶性膳食纖維特性分析結(jié)果Table 4 Analysis result characteristics of soluble dietary fiber from Rosa roxburghii-jujube pomace before and after fermentation

由表4可知，經(jīng)微生物發(fā)酵處理后刺梨-紅棗果渣中可溶性膳食纖維的持水力為18.22 g/g、膨脹力為14.13 mL/g、持油力為3.21 g/g，均顯著高于新鮮果渣可溶性膳食纖維。說(shuō)明利用發(fā)酵法制備的刺梨-紅棗果渣可溶性膳食纖維品質(zhì)有明顯的提升。

2.4 可溶性膳食纖維掃描電鏡分析

新鮮果渣與發(fā)酵后果渣中可溶性膳食纖維的掃描電鏡結(jié)果見圖7。

圖7 發(fā)酵前后刺梨-紅棗果渣中可溶性膳食纖維的掃描電鏡圖Fig. 7 Scanning electron microscopy of soluble dietary fiber from Rosa roxburghii-jujube pomace before and after fermentation

由圖7可知，刺梨-紅棗果渣經(jīng)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌（1∶1）發(fā)酵后可溶性膳食纖維表面較新鮮果渣中可溶性膳食纖維疏松，形成了較多孔隙，SDF的比表面積增大，并呈現(xiàn)出復(fù)雜的束狀多孔性空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，暴露出更多的親水親油基團(tuán)，這利于水分滲入，直接導(dǎo)致了持水性、持油性和吸附能力的顯著增加。這與李天等[27-28]的膳食纖維改性的結(jié)果相符。由圖7d亦可知，刺梨-紅棗果渣中可溶性膳食纖維的平均粒徑為100 μm。

3 結(jié)論

以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌（1∶1）為發(fā)酵菌種，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到刺梨-紅棗果渣膳食纖維的最優(yōu)發(fā)酵制備條件：料液比1∶22、接種量10%、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時(shí)間65 h、原料粒度0.16 mm，在此條件下，可溶性膳食纖維的得率為11.47%。本試驗(yàn)制備的可溶性膳食纖維持水力、膨脹力和持油力分別為18.22 g/g、13.14 mL/g、3.21 g/g，均顯著高于未發(fā)酵刺梨-紅棗果渣可溶性膳食纖維（P＜0.05）。經(jīng)掃描電鏡分析，SDF呈疏松、束狀多孔的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，較原有的SDF結(jié)構(gòu)更為疏松，滲水性更好，平均粒徑為100 μm。本試驗(yàn)為推動(dòng)刺梨-紅棗果渣資源的充分利用，開發(fā)新型膳食纖維產(chǎn)品提供基本思路，同時(shí)證明利用微生物發(fā)酵法可獲得高品質(zhì)膳食纖維提供理論依據(jù)。