★ 翟興英 涂珺 李佳 姜麗 張啟云 徐國良 黃超東 李冰濤（江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心/江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點實驗室 南昌 330004）

葛根為豆科植物野葛的干燥根，習(xí)稱野葛。2020年版《中國藥典》記載葛根具有解肌退熱、生津止渴的功效。胰島素抵抗使胰島素敏感性降低，其導(dǎo)致血糖升高、脂肪及蛋白質(zhì)分解作用增強，滲透壓升高，使患者出現(xiàn)“三多一少”的典型糖尿病臨床癥狀?；诜肿訉蛹夹g(shù)發(fā)現(xiàn)葛根多種化學(xué)成分與胰島素抵抗靶點具有較好的結(jié)合作用［1］。葛根總黃酮能有效降低鏈脲佐菌素復(fù)制的糖尿病小鼠的血糖水平，恢復(fù)胰島素水平，改善實驗小鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)［2］。葛根生津止渴功效與其改善胰島素抵抗作用相關(guān)，但是其生物機制還未知。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，能夠從整體上分析藥材的潛在作用機制，為中藥多成分多靶點作用生物機制研究提供新的研究思路和研究方法。本研究以葛根胰島素抵抗為研究對象，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探索葛根“生津止渴”的生物機制，為葛根實驗研究及產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 葛根化學(xué)成分及活性成分［3］基于化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫檢索葛根活性成分［4］。刪除來源于莖、葉的化學(xué)成分，保留來源于地下根的化學(xué)成分，依據(jù)Linpinski五規(guī)則對化學(xué)成分進行活性篩選［5］。

1.2 活性成分作用靶點 Swiss Target Prediction是一款在線分析工具［6］，能夠依據(jù)化學(xué)成分預(yù)測其潛在作用靶點。本研究使用Swiss Target Prediction 預(yù)測活性成分作用靶點。

1.3 胰島素抵抗疾病靶點及葛根作用靶點收集GenCLiP 3是一款在線文本挖掘工具［7］，能夠通過輸入疾病關(guān)鍵詞查找、分析疾病相關(guān)的人類基因。為了提高獲取靶點的可靠性，本研究將雜志影響因子選擇為3～50，發(fā)表年限為1990年—2020年。

將葛根活性成分作用靶點與胰島素抵抗疾病靶點進行交叉分析，考慮靶點在胰島素抵抗的三大組織（肝、骨骼肌、脂肪）分布，提高作用靶點的可靠性，以藥材及疾病共有靶點且在三大組織有蛋白表達的靶點為葛根改善胰島素抵抗作用靶點。

1.4 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò) 以活性成分及葛根改善胰島素抵抗作用靶點的對應(yīng)關(guān)系，構(gòu)建活性成分及作用靶點網(wǎng)絡(luò)。用網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的度值評價活性成分重要性。

1.5 作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò) STRING數(shù)據(jù)庫旨在提供多物種蛋白質(zhì)交互作用的數(shù)據(jù)，本研究將葛根改善胰島素抵抗的作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫［8］，構(gòu)建靶點的交互作用網(wǎng)絡(luò)，基于節(jié)點在交互作用網(wǎng)絡(luò)中度中心型評價靶點重要性。

1.6 生物功能富集 生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）是常用的通路富集數(shù)據(jù)庫［9］。本研究將葛根改善胰島素抵抗的作用靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，對靶點進行KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 葛根化學(xué)成分及活性成分 本研究基于化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫檢索葛根化學(xué)成分119個， 94個成分符合Linpinski 5規(guī)則 ，可能是葛根的活性成分。

2.2 葛根改善胰島素抵抗的作用靶點 本研究預(yù)測葛根活性成分作用靶點188個，發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗疾病靶點706個，葛根活性成分及胰島素抵抗疾病共有靶點40個，其中24個共有靶點在胰島素抵抗主要組織肝臟、骨骼肌及脂肪有蛋白表達，可能是葛根改善胰島素抵抗的作用靶點。見表1。

表1 葛根改善胰島素抵抗作用靶點

2.3 葛根活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用cytoscape 3.3.0軟件，依據(jù)預(yù)測的成分及靶點對應(yīng)關(guān)系，構(gòu)建葛根改善胰島素抵抗的活性成分-靶點作用網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共有67個節(jié)點，103條邊。67個節(jié)點中24個為靶點，其與43個節(jié)點為葛根活性成分。對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的中心性分析，發(fā)現(xiàn)葛根活性成分中M35（sayanedine），M40（genistein），M33（3'-methoxydaidzein），M39（glycitein），M42（formononetin）的度值排序靠前，具有較多的作用靶點?？赡苁歉鸶纳埔葝u素抵抗的主要活性成分。

圖1 葛根改善胰島素抵抗的活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 葛根改善胰島素抵抗作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò) 將葛根改善胰島素抵抗的作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，并設(shè)置蛋白交互作用可信度為中等，構(gòu)建靶點交互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出至cytoscape 軟件構(gòu)對網(wǎng)絡(luò)進行可視化及網(wǎng)絡(luò)分析。該網(wǎng)絡(luò)有23個節(jié)點（蛋白在此交互作用置信條件下與其他蛋白無交互作用），47條邊。節(jié)點中心性分析發(fā)現(xiàn)EGFR（12），ESR1（9），PTGS2（9）的中心性較大，可能是藥物作用的重要節(jié)點。見圖2。

圖2 葛根改善胰島素抵抗作用靶點的交互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 通路富集分析 本研究使用DAVID在線工具對葛根改善胰島素抵抗作用靶點進行KEGG通路分析。葛根改善胰島素抵抗靶點富集顯著性代謝通路10條，涉及鈣離子信號通路，膽汁酸分泌通路，缺氧誘導(dǎo)因子1通路等。見圖3。

圖3 葛根改善胰島素抵抗作用靶點通路富集

3 討論

葛根具有生津止渴的功效，主消渴，2型糖尿病屬消渴的范疇，臨床上，葛根常用于2型糖尿病的治療，胰島素抵抗是2型糖尿病的發(fā)病機制之一。為了探索葛根生津止渴功效的科學(xué)內(nèi)涵，本研究基于胰島素抵抗應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)構(gòu)建了葛根改善胰島素抵抗的成分靶點交互作用網(wǎng)絡(luò)，探索了葛根改善胰島素抵抗的作用靶點，并富集靶點的作用通路。

基于葛根活性成分-靶點交互作用網(wǎng)絡(luò)，研究初步發(fā)現(xiàn)葛根43個作用于胰島素抗疾病靶點的活性成分。其中M35（sayanedine），M40（genistein），M33（3'-methoxydaidzein ），M39（glycitein），M42（formononetin）可能是葛根改善胰島素抵抗的主要活性成分。染料木黃酮（Genistein）是葛根中異黃酮類成分，能夠調(diào)控大鼠胰島素分泌，影響肝臟和脂肪組織的脂代謝［10-12］。3'-甲氧基大豆苷元（3'-methoxydaidzein）是一種家甲氧基異黃酮類化合物，現(xiàn)代研究該類化合物具有改善胰島素抵抗、改善調(diào)節(jié)脂代謝紊亂等作用；此外研究結(jié)果顯示3’-甲氧基大豆苷元具有較強的α葡糖糖苷酶抑制作用，能夠抑制葡萄糖的吸收［13-14］，此外，染料木素（glycitein）和芒柄花素（formononetin）均具有改善胰島素抵抗的作用［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)葛根改善胰島素抵抗的24個潛在作用靶點，其中靶點EGFR、PTGS2、ESR1可能是重要靶點。EGFR是表皮生長因子受體，EGFR能夠通過PPARγ途徑,激活促進NFκB激活，抑制炎癥的發(fā)生［16］，炎癥學(xué)說是糖尿病發(fā)病學(xué)說之一。環(huán)氧合酶是花生四烯酸代謝通路中關(guān)鍵限速酶，環(huán)氧合酶-2（PTGS2）催化花生四烯酸生產(chǎn)前列腺素等一系列炎性介質(zhì)。肥胖誘發(fā)的炎癥是胰島素抵抗發(fā)展的重要因素［17］。研究表明，葛根中阿魏酸、芹菜素、異甘草素等化學(xué)成分能夠抑制細(xì)胞或?qū)嶒瀯游颬TGS2的表達［18-20］。2型糖尿病的患病率具有明顯的性別差異，絕經(jīng)前女性的發(fā)病率明顯較低。雌激素缺乏可能與代謝功能障礙之間存在較強的相關(guān)性，女性雌激素的減少可加速胰島素抵抗及2型糖尿病的發(fā)生。雌激素是通過激活雌激素受體信號來抑制肝臟葡萄糖產(chǎn)生的［21］。葛根中活性成分大豆苷元、芒柄花素、染料木素等多種異黃酮類成分具有植物雌激素樣作用，能夠調(diào)節(jié)雌激素受體的表達［22-24］。

對葛根改善胰島素抵抗靶點進行通路富集分析，發(fā)現(xiàn)鈣離子信號通路，膽汁酸分泌信號通路及缺氧誘導(dǎo)因子信號通路等是顯著性信號通路。鈣是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的第二信使，主要存貯在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，維持適量的鈣離子濃度有利于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊和運輸，反之，則內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊和運輸功能異常，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過JNK和IRS-1通路在激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和Akt/蛋白激酶B（PKB）途徑導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4型（GLUT4）囊泡到細(xì)胞表面，促進胰島素抵抗［25］。膽汁酸由肝臟分泌，作為一種代謝調(diào)節(jié)因子,能夠激活多種核受體和膜受體介導(dǎo)的信號通路,參與多種代謝調(diào)節(jié)過程,不僅可以促進食物中脂類的消化吸收,還參與糖、脂及能量的代謝,同時膽汁酸又是代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變與肥胖和2型糖尿病相關(guān)［26］。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）是一種由缺氧激活的轉(zhuǎn)錄因子，在多種組織器官中表達，參與調(diào)控血管生成、細(xì)胞增殖和炎癥等，與多種代謝疾病均有關(guān)聯(lián)。脂肪組織和小腸缺氧，激活缺氧誘導(dǎo)因子HIF1α和HIF2α，導(dǎo)致胰島素抵抗; 小腸中HIF2α的激活增加唾液酸酶3的表達，導(dǎo)致小腸和血清的神經(jīng)酰胺升高，促進胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生; 此外，脂肪細(xì)胞中HIF1α可誘導(dǎo)SOCS3表達來活化STAT3，增強炎癥因子表達、減少脂聯(lián)素表達，導(dǎo)致胰島素抵抗［27］。

葛根具有生津止渴的功效，臨床上可以改善胰島素抵抗，治療糖尿病，改善糖尿病三多一少的臨床癥狀。本研究基于胰島素抵抗應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探索葛根活性物質(zhì)、作用靶點及通路，初步研究發(fā)現(xiàn)葛根活性成分，可以作用于EGFR,ESR1，PTGS2等胰島素抵抗疾病靶點，通過鈣離子信號、膽汁酸代謝、缺氧誘導(dǎo)因子等信號通路發(fā)揮生津止渴的功效，改善胰島素抵抗，治療糖尿病等疾病，為葛根功效深入研究提供了科學(xué)依據(jù)。