★ 劉海云 方永青 何志堅(jiān) 伍慶華 宋渺渺 林倩霞 侯本超（.江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 南昌 0004；.江西省腫瘤醫(yī)院 南昌 009；.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 南昌 0006）

隨著生活壓力逐漸增加，失眠的人數(shù)量越來越多。據(jù)調(diào)查，失眠癥發(fā)生率為10 %～60 %，因地區(qū)不同而概率不同，老年人患上失眠癥一般在30 %～40 %之間,但在某些地區(qū)甚至可以達(dá)到90 %以上［1］。失眠癥的主要表現(xiàn)為夜間時(shí)無法入睡, 長久的失眠會引起機(jī)體免疫力下降，記憶力、注意力等認(rèn)知功能損害，同時(shí)持續(xù)失眠還會增加很多慢性基礎(chǔ)性疾病的風(fēng)險(xiǎn)［2-3］。

研究顯示，睡眠剝奪能加快機(jī)體新陳代謝，增加自由基，降低超氧化物歧化酶（SOD）活性，并形成大量脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）［4］。長期睡眠剝奪病理表現(xiàn)的突出特征為能量消耗過多，在此過程中常產(chǎn)生大量活性氧，大量的氧自由基堆積，當(dāng)這些含氧物超過機(jī)體的抗氧化能力將引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。肖愛嬌等［5］研究發(fā)現(xiàn)熱敏灸可以通過調(diào)節(jié)SOD、MDA的含量恢復(fù)機(jī)體的氧化平衡狀態(tài) ，達(dá)到改善睡眠的作用。吳北峰［6］發(fā)現(xiàn)采用電項(xiàng)針療法可以降低腦干內(nèi)SOD和NO的含量，能夠降低氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的能量過度消耗水平，減少氧化應(yīng)激對腦干的損害，恢復(fù)正常睡眠-覺醒周期。

細(xì)胞因子不但是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，而且具有廣泛的中樞調(diào)節(jié)作用 ，它們不僅在外周血液單核細(xì)胞中釋放并存在，而且外周神經(jīng)和大腦中也存在。因此，細(xì)胞因子能通過不同線路影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的睡眠過程［7］。

目前，對于失眠臨床上常用的藥物副作用比較大，有成癮性和依賴性。因此，尋找一種有效而副作用小的藥物預(yù)防和治療失眠是當(dāng)務(wù)之急。

菟絲子最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又被稱為菟絲實(shí)、吐絲子等。菟絲子味甘、辛，性平，是常用的補(bǔ)益中藥，具有補(bǔ)肝腎、固精縮尿、益精明目等功效，是中醫(yī)補(bǔ)腎、壯陽、固精之要藥［8］。課題組對菟絲子的研究較多，但在失眠方面還未涉及。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，菟絲子可以改善失眠大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對改善失眠有顯著效果［9］，但其作用機(jī)制不清楚?，F(xiàn)從細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激的角度進(jìn)一步探討中藥菟絲子對失眠大鼠的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各30只，體重（200±20）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號 SCXK（京）2016-0011。動物飼養(yǎng)室溫為20～22 ℃。室內(nèi)外空氣交換迅速，通風(fēng)良好。將大鼠雌雄分開于不同的飼養(yǎng)籠中，使用專用的大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。在正式的實(shí)驗(yàn)開始之前先飼養(yǎng)一至兩周。

1.2 試藥 中藥菟絲子購于南昌益豐大藥房；對氯苯丙氨酸（PCPA）試劑盒購于Sigma有限公司；地西泮注射液購于江西省腫瘤醫(yī)院門診部；SOD、MDA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；IL-1β、TNF-α試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器 AdventurerTM電子天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；微量進(jìn)樣器（德國eppendorf公司）；TECAN 酶標(biāo)儀sunrise（奧地利 TECAN公司）；TGL-16G型臺式高速離心機(jī)（上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠）。

2 方法

2.1 制備菟絲子提取物［10］菟絲子1 000 g，8 000 mL水浸泡2 h，藥材微微膨脹，文火煎煮2次，每次0.5 h，合并2次煎煮液，并將其濃縮至0.4 g/mL，置于4 ℃冰箱，備用。

2.2 分組 60只SD大鼠隨機(jī)分為五組，分別為模型組、空白對照組、地西泮對照組（地西泮注射液0.9 mg/kg）、低劑量菟絲子提取物給藥組［菟絲子提取物150 mg/（kg·d）劑量組］、高劑量菟絲子提取物給藥組［菟絲子提取物350 mg/（kg·d）劑量組］，每組各12只。

2.3 建立對氯苯丙氨酸失眠大鼠模型 除空白對照組外，其他組都進(jìn)行腹腔注射對氯苯丙氨酸混懸液（350 mg/kg），每天1次，時(shí)間持續(xù)3 d［11］。

2.4 給藥 建立模型后（即造模第四天），開始對不同組大鼠給藥。地西泮對照組的大鼠使用地西泮注射液（0.9 mg/kg）灌胃［12］，給藥組選擇不同濃度的菟絲子對大鼠進(jìn)行灌胃，而空白對照組與模型組則都用相同體積的生理鹽水對實(shí)驗(yàn)大鼠灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃14 d。

2.5 大鼠血清的制備 最后一次灌胃后，第二天對大鼠進(jìn)行腹腔注射5 %的戊巴比妥鈉（60 mg/kg），將其麻醉。大鼠被麻醉后立刻開腹，選擇鈍性分離將大鼠體內(nèi)的臟器分開，腹主動脈取血［13］。置于離心機(jī)中進(jìn)行低溫離心，轉(zhuǎn)速為5 000轉(zhuǎn)/min，15 min后，取出，去除沉淀，取上清液將其放置于20 ℃的冰箱。

2.6 血清中IL-1β和TNF-α的測定 放射免疫法測定大鼠血清中IL-1β和TNF-α 的含量進(jìn)行測定［14］。即在抗原或抗體上利用放射性同位素標(biāo)記，將其與被測的抗體或者抗原相互結(jié)合，形成抗原與抗體相互結(jié)合的復(fù)合物，利用儀器對形成的抗原抗體復(fù)合物來進(jìn)行分析，并測定其含量。

2.7 血清中SOD活性及MDA含量的測定 按試劑盒的操作進(jìn)行測定。

2.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 24.0進(jìn)行處理，得到的結(jié)果用（±s）表示，通過多重比較法分析數(shù)據(jù)并且對每組的數(shù)據(jù)進(jìn)行組間相互比較。當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況 造模前所有大鼠情況正常，飲食健康，睡眠穩(wěn)定。腹腔注射PCPA兩天后，除空白對照組，所有大鼠都呈現(xiàn)失眠狀態(tài)，晝夜活動紊亂，飲食規(guī)律不正常。灌胃一周后，地西泮對照組與高劑量菟絲子給藥組的大鼠狀況都十分接近正常組，而低劑量給藥組的大鼠狀況與模型組的差異較大，較為接近空白對照組。從大鼠健康狀況可知，菟絲子提取物可較為有效的改善失眠，且高劑量的療效比低劑量的療效好。

3.2 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中的IL-1β、TNF-α含量的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠IL-1β、TNF-α的含量都顯著降低。而與模型組比較，地西泮對照組、低劑量組、高劑量組的大鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量都顯著增加，其中地西泮對照組和高劑量組的IL-1β、TNF-α含量與空白對照組十分相近。見表1。

表1 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中的IL-1β、TNF-α水平的影響（±s，n=12） ng/L

表1 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中的IL-1β、TNF-α水平的影響（±s，n=12） ng/L

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別 IL-1β TNF-α空白對照組 66.88±8.62 41.48±10.08模型組 36.42±13.12** 20.49±12.42**地西泮對照組 56.02±14.81# 36.58±9.47##低劑量組 39.43±12.13# 28.11±13.38#高劑量組 51.02±13.88## 33.02±9.36##

3.3 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中SOD活性、MDA含量的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠血清中SOD活性顯著減少，而MDA含量升高。與模型組比較，地西泮對照組、低劑量組、高劑量組的大鼠血清中SOD的活性都顯著增加，MDA的含量下降。其中地西泮對照組與高劑量組的SOD活性和MDA含量均接近空白對照組。見表2。

表2 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中SOD活性、MDA含量的影響（±s，n=12）

表2 菟絲子提取物對失眠大鼠血清中SOD活性、MDA含量的影響（±s，n=12）

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別 SOD/U·mL-1 MDA/nmol·mL-1空白對照組 84.86±9.09 3.75±0.32模型組 63.05±10.19* 5.15±1.24**地西泮對照組 79.60±7.35# 3.13±1.14##低劑量組 69.59±6.28# 4.04±0.66#高劑量組 74.39±13.34# 3.08±0.31##

4 討論

采用PCPA建立失眠大鼠模型，消耗的時(shí)間比其他造模短，需要的費(fèi)用也比較便宜,而且這種造?？芍貜?fù)性強(qiáng)，因此，一般都是用這種方法造失眠模型［15］。失眠使機(jī)體免疫力下降，免疫系統(tǒng)紊亂，免疫功能失調(diào)。而機(jī)體免疫能力又和細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α有密切的關(guān)系。研究表明TNF-α與睡眠調(diào)節(jié)密切相關(guān)，這兩者之間能相互調(diào)節(jié)，這樣就可以令機(jī)體的睡眠保持在穩(wěn)定的狀態(tài)［16］。同時(shí)，IL-1β與睡眠有關(guān)的，IL-1β水平增加可促進(jìn)睡眠，而抑制IL-1β則阻止睡眠［17］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MIL-1β、TNF-α的含量都低于正常水平，而使用了不同濃度的菟絲子提取物灌胃后血清中IL-1β、TNF-α的含量與模型組相比都有明顯升高，高劑量組的這兩種細(xì)胞因子水平接近陽性對照組，說明菟絲子提取物對大鼠血清中的IL-1β與TNF-α有促進(jìn)作用。

失眠令大鼠消耗的能量增加、 抗氧化應(yīng)激的能力減弱［18］。失眠使機(jī)體在夜間興奮，無法入睡，從而導(dǎo)致機(jī)體能量消耗增多，而能量產(chǎn)生的過程中往往是伴隨著活性氧的生成，能量消耗增加，活性氧含量就不斷增加，當(dāng)產(chǎn)生的活性氧超過機(jī)體的抗氧化能力，大鼠體內(nèi)就會發(fā)生使機(jī)體受到損害的氧化應(yīng)激反應(yīng)。大鼠體內(nèi)一旦發(fā)生這個(gè)反應(yīng)，將產(chǎn)生大量的有害氧化中間產(chǎn)物。丙二醛是機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)得到的物質(zhì),這使得生命大分子物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)聚合，而且它還具有使細(xì)胞死亡的毒性［19］。為了對抗機(jī)體產(chǎn)生損害的反應(yīng)，機(jī)體擁有兩個(gè)抗氧化系統(tǒng)，其中一個(gè)是酶抗氧化系統(tǒng)，另一個(gè)則是非酶抗氧化系統(tǒng)。SOD是機(jī)體中一種能起到比較重要作用的抗氧化酶，它經(jīng)常被機(jī)體用來去除體內(nèi)多余的超氧陰離子自由基［19］，是酶抗氧化系統(tǒng)中比較重要的一種酶。實(shí)驗(yàn)表明失眠大鼠血清SOD活性明顯降低且MDA含量明顯升高［20］，可能是失眠大鼠氧自由基大量產(chǎn)生，從而使得SOD的活性下降，導(dǎo)致了體內(nèi)的氧自由基不斷增多,這些氧自由基攻擊大鼠體內(nèi)的多不飽和脂肪酸，從而使大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生MDA等物質(zhì)，引起細(xì)胞毒性，使細(xì)胞死亡［5］。本研究中，與空白對照組相比，模型組SOD活性明顯降低，MDA含量升高，說明失眠大鼠體內(nèi)正是由于上述原因而發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)；而與模型組相比，低、高劑量給藥組SOD活性都增加，MDA的含量都減少，說明中藥菟絲子提取物具有抗氧化的作用，從而改善了失眠的癥狀。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菟絲子提取物可以提高血清中細(xì)胞因子IL-1β與TNF-α的含量，使血清中SOD活性得到提升，降低MDA的含量，從而改善了失眠大鼠的癥狀。因此，從菟絲子提取物提高失眠大鼠的免疫能力和抗氧化作用的能力來看，其對失眠有一定的治愈效果，本實(shí)驗(yàn)為菟絲子治療失眠的臨床應(yīng)用提供科學(xué)理論依據(jù)。