談思益 綜述，康偉超 審校

(徐州醫(yī)科大學(xué)：1.第二臨床醫(yī)學(xué)院；2.麻醉學(xué)院，江蘇 徐州 221004)

人眼是人體結(jié)構(gòu)中最復(fù)雜的結(jié)構(gòu)之一，由數(shù)百萬個具有不同細胞類型的組織構(gòu)成。眼睛在解剖學(xué)上可分為前部和后部。前部包含角膜、虹膜、瞳孔和晶狀體，后部則由鞏膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、黃斑和視神經(jīng)組成。光線通過角膜和晶狀體進入眼內(nèi)，位于眼后的視網(wǎng)膜將聚焦的光的輸入轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕哪Ｊ?，然后傳輸?shù)酱竽X形成周圍環(huán)境的視覺圖像，但視覺處理的第一步發(fā)生在視網(wǎng)膜。

1 視網(wǎng)膜發(fā)育的過程

視網(wǎng)膜起源于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育形成的神經(jīng)外胚層，因此，視網(wǎng)膜也被認為是大腦的一部分[1]。超過30%的大腦功能是分析眼睛攜帶的光的信息[2]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)是視網(wǎng)膜中最先出現(xiàn)的細胞類型之一，緊隨其后的是無長突細胞、視錐細胞和水平細胞。在視網(wǎng)膜發(fā)育的后期，產(chǎn)生桿狀細胞，接著是雙極細胞，最后是Müller膠質(zhì)細胞。RGC位于視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)中的最內(nèi)層，光感受器則更多地占據(jù)外圍層。一些細胞外信號分子調(diào)節(jié)眼的發(fā)育過程，包括Wnt[3]、胰島素樣生長因子(IGFs)[4]、成纖維細胞生長因子(FGFs)[5]、Notch、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、維甲酸(RA)[6]。這些細胞外信號分子在發(fā)育的不同階段出現(xiàn)，以調(diào)節(jié)一系列不同的發(fā)育事件。RGC是連接到大腦軸突的小神經(jīng)元，將光信號發(fā)送到大腦指定區(qū)域，如外側(cè)膝狀核或視上丘，作為視網(wǎng)膜的最終輸出[7-8]。因此，RGC有更大的細胞體和更粗的軸突，這都是動作電位遠距離傳播所必需的[9-10]。這些軸突在神經(jīng)纖維層中聚集在一起形成視神經(jīng)。RGC在將視覺信息從眼睛傳遞到大腦中起著至關(guān)重要的作用。當RGC的傳導(dǎo)因疾病或損傷被切斷，從而抑制光信息到達適當?shù)奶幚碇行?，進而導(dǎo)致視力喪失和失明。

2 青光眼疾病的特點

青光眼是一組以RGC進行性退化為特征的視網(wǎng)膜疾病，是不可逆轉(zhuǎn)失明的主要原因之一。據(jù)估計，全球有超過7 600萬人受青光眼影響，2040年影響約1.118億人[11]。我國40歲以上人群青光眼患病率為1.5%～3.6%[12]。盡管青光眼在全球普遍流行，但目前還沒有有效的治療方法來治療RGC的退化和隨后的視野損傷。目前針對青光眼的治療大多數(shù)都旨在降低眼壓來限制視力喪失的進展，因為高眼壓是青光眼唯一確認的可改變的危險因素[13]。然而青光眼也可以在正常眼壓下發(fā)生[14]，所以降低眼壓不能有效防止視力喪失。因此針對RGC退變及視力損傷機制的研究，以及RGC的移植替代研究具有重要的意義。

各種用于治療青光眼的細胞療法正在研究當中。青光眼明顯的表現(xiàn)是RGC的丟失。傳統(tǒng)對抗RGC變性的方法是依賴于在疾病過程的早期階段進行治療，此時神經(jīng)保護仍然有效。實際上大多數(shù)視神經(jīng)病變患者在診斷時已經(jīng)產(chǎn)生了顯著的RGC丟失，并且在疾病的后期階段，大量不可逆轉(zhuǎn)的細胞丟失使得神經(jīng)保護變得徒勞。在這種情況下，移植健康的RGC以取代退化的細胞是恢復(fù)視覺功能的最后選擇。然而，由于RGC軸突的遠距離投射及有效地恢復(fù)突觸的功能性等障礙，RGC的替代策略一直缺乏成功的發(fā)展。目前干細胞療法已經(jīng)在帕金森病和脊髓損傷等神經(jīng)退行性疾病中被證明具有改善作用，治療的成功在于對損傷、丟失的神經(jīng)元進行替換。實際上，由于人眼是脊椎動物體內(nèi)的免疫優(yōu)勢部位，因此一直處于干細胞移植研究的前沿[15]。移植細胞的免疫排斥問題是決定移植后細胞能否在宿主體內(nèi)存活并良好整合的關(guān)鍵。而由于血-眼屏障、眼內(nèi)腔的免疫抑制微環(huán)境和前房相關(guān)的免疫偏離存在使眼具有了獨特的免疫赦免條件。此外，移植細胞的作用機制不僅在于完成細胞整合和補充的任務(wù)，還在于提供神經(jīng)保護環(huán)境，產(chǎn)生生長因子和細胞因子，減緩神經(jīng)退變過程，恢復(fù)視功能。

3 神經(jīng)節(jié)細胞的標志物

RGC功能特性可作為鑒別和純化篩選細胞的依據(jù)之一。RGC具有對谷氨酸做出反應(yīng)的能力[16-17]，還表現(xiàn)出興奮性突觸后電位(EPSPs)[18]。在分化培養(yǎng)中為了將RGC與其他類型的細胞區(qū)分開，使用一些分子標記可以將其識別出來。早期使用遺傳標記TUJ1作為RGC樣細胞的共同標記[19]，RGC表達這種標記，但不具有特異性，因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有許多投射神經(jīng)元表達此標記[20]。用于識別RGC的最常見的轉(zhuǎn)錄因子是BRN3。BRN3由視網(wǎng)膜內(nèi)的RGC特異性表達。然而，BRN3的表達也存在于體感神經(jīng)元和聽神經(jīng)元中[21]。免疫熒光是一種純化RGC的技術(shù)，其利用RGC表達的表面抗原Thy-1的RGC特異性表達。使用兩步法，可以從出生后的大鼠視網(wǎng)膜獲得99.5%以上純度的RGC培養(yǎng)[22]。雖然Thy-1特異性地表達在視網(wǎng)膜內(nèi)的RGC中，但這個標記在神經(jīng)系統(tǒng)的許多其他類型的神經(jīng)元中都有表達[23]。因此，必須注意不能僅僅依靠一個標記鑒別,而應(yīng)該結(jié)合遺傳標記、形態(tài)特征和功能特征的組合表達才能鑒別RGC。目前關(guān)于RGC發(fā)育和成熟的研究發(fā)現(xiàn)RGC具有多樣性，在動物模型中發(fā)現(xiàn)和鑒定了30多種在分子、形態(tài)和生理特性上不同的亞型[24]。這些亞型表達特定的分子標記，具有不同的分子、結(jié)構(gòu)和功能特征[24]。雖然在動物模型中已經(jīng)觀察到大多數(shù)RGC亞型，但最近有研究在人類多能干細胞(hPSC)分化得到的RGC中也發(fā)現(xiàn)了不同亞型的存在[25]。這些動物研究不僅描述了這許多亞型的復(fù)雜性，還觀察了急性損傷或疾病后不同亞型的存活和再生現(xiàn)象[26]。接下來應(yīng)該集中于如何將特定的亞型從hPSC中區(qū)分出來，以便正確理解不同視神經(jīng)疾病中特定RGC亞型的退變情況，為今后在細胞替代研究和治療中解決退行性細胞丟失問題提供更多的了解。

4 視網(wǎng)膜移植細胞的來源

目前用于移植的各種細胞來源大致可分為成體組織來源的干細胞、胚胎來源的干細胞、祖細胞和多能干細胞。多能干細胞(PSC)目前被認為是最好的細胞來源，hPSCs可以產(chǎn)生視網(wǎng)膜再生所需的所有細胞類型[27]。2006年，TAKAHASHI等[28]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)幾乎可以從人體的任何細胞中人工地制造出來，并具有與胚胎干細胞相同的功能，如無限增殖、自我更新和分化為3個胚層的能力。iPSCs可以提供自體干細胞的來源，而不需要考慮使用胚胎干細胞需要破壞胚胎的倫理問題。因此，iPSCs非常適合用于干細胞移植和體外疾病模型的建立。對于iPSC分化的過程包括2個步驟：首先細胞失去其特有的特征，呈現(xiàn)出一種較低分化程度的狀態(tài)；其次，細胞分化過程重新啟動，通過特定的生長因子、細胞因子和細胞外基質(zhì)分子的參與，開始新的分化過程。

5 細胞移植面對的問題

5.1形成腫瘤 PSC的使用也會產(chǎn)生形成腫瘤的問題。未分化的iPSC可以存在于分化的細胞集落中，一同移植可能會導(dǎo)致畸胎瘤的形成。因此需要提高移植細胞的純度，來避免移植后畸胎瘤的形成。

5.2細胞數(shù)量 雖然各種分化方法都可以產(chǎn)生視網(wǎng)膜神經(jīng)元，但這些方法中大多數(shù)仍然不能大量地產(chǎn)生除視桿細胞以外的特定視網(wǎng)膜神經(jīng)元。因為體外干細胞培養(yǎng)方法模擬了在體內(nèi)正常視網(wǎng)膜發(fā)育的過程，并且在小鼠和人的視網(wǎng)膜中，視桿細胞的數(shù)量遠遠超過RGC[29]。干細胞來源的RGC的平均產(chǎn)量估計為培養(yǎng)細胞的0.1%～30.0%，這與不同發(fā)育階段視網(wǎng)膜中RGC的正常比例相似。

5.3突觸形成 RGC作為視網(wǎng)膜的投射神經(jīng)元，需要將長軸突延伸出眼睛，進入大腦并形成突觸，并正確地連接到突觸后靶點。RGC軸突受限于眼內(nèi)結(jié)構(gòu)的空間限制，目前沒有發(fā)現(xiàn)向外延伸到特定靶點的特性。

5.4免疫反應(yīng) 雖然，主要組織相容性復(fù)合體(MHC)在許多類型的干細胞中的表達很低，但分化的組織表達MHC，這種表達會導(dǎo)致免疫排斥。即使是自體小鼠iPSC也可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生類似自身免疫反應(yīng)。最大限度地減少手術(shù)創(chuàng)傷對于減少固有免疫(如自然殺傷細胞和樹突狀細胞)的激活具有重要的意義，固有免疫反過來可以激活獲得性免疫反應(yīng)。

6 iPSC的應(yīng)用

iPSC為研究人類視網(wǎng)膜退行性疾病提供了一個獨特的工具，包括青光眼等以RGC為靶點的視神經(jīng)疾病。由于RGC連接眼睛和大腦之間視覺信息的傳遞，它們的退化會導(dǎo)致視力喪失，最終導(dǎo)致失明。在過去，動物模型如貓、狗、雞、豬，特別是嚙齒動物，被用來研究一些視網(wǎng)膜疾病相關(guān)的致病機制，使我們對疾病的許多關(guān)鍵方面有了更多了解[30]，但有時由于物種之間的差異使得在臨床環(huán)境下移植到人類身上時會失敗[31]。例如，老鼠是夜間活動的動物，它們的視網(wǎng)膜主要由視桿細胞組成，光感受器僅含有少量的視錐細胞(所有光感受器的3%)，這與人類視網(wǎng)膜存在顯著差異。并且，人類的眼睛在許多方面都是獨一無二的，例如密集斑點和三原色的組成。因此，并不是所有的疾病和藥物反應(yīng)都能在動物模型中得到充分反映。iPSC衍生的RGC模型是篩選能夠改善疾病藥物高度相關(guān)的，與在動物模型上的測試相比，在臨床上具有更高的成功潛力。

以人類來源的疾病模型發(fā)展，可以產(chǎn)生和研究患者特有的細胞。許多基于hPSC的RGC變性的遺傳模型，例如青光眼變性在過去幾年中已經(jīng)發(fā)展起來[32]，包括Six6、TANK結(jié)合激酶1(TBK1)和視神經(jīng)磷酸酶(OPTN)的突變，這些都與家族性正常眼壓性青光眼(NTG)的發(fā)病有關(guān)。Six6因其在眼睛發(fā)育和形態(tài)發(fā)生中的作用而廣為人知，盡管這種轉(zhuǎn)錄因子的突變也被認為會導(dǎo)致NTG的發(fā)生[33]。來自Six6錯義突變患者的hPSC產(chǎn)生神經(jīng)節(jié)細胞和視網(wǎng)膜細胞的效率低下，關(guān)鍵發(fā)育基因的表達減少和表達失調(diào)[34]。此外，Six6錯義突變患者RGC表現(xiàn)出嚴重的發(fā)育、形態(tài)和電生理缺陷，軸突生長減少，軸突引導(dǎo)分子表達不足。此外，Six6錯義突變的RGC表現(xiàn)出明顯更高的活化caspase-3水平。據(jù)推測，Six6中的這種錯義突變會導(dǎo)致RGC發(fā)育缺陷，這可能會使這些RGC在成年后面臨更高的退化風(fēng)險。這些研究結(jié)果為開發(fā)新的視網(wǎng)膜退行性疾病治療方法提供了更多的思路，如果使用得當，基于PSC的視網(wǎng)膜模型對于深入了解許多疾病方面是有益的。

從患者來源的人iPSC生成個性化視網(wǎng)膜細胞也為個性化藥物治療提供了新的可能性。hPSC定向分化的RGC也為大規(guī)模的藥物篩選提供了大量細胞，然后可以特異性地針對RGC來評估化合物對疾病的療效。

7 移植手術(shù)的方式

目前考慮2種神經(jīng)節(jié)細胞替代方式，即以分離的細胞懸浮液的形式移植或以預(yù)先形成的視網(wǎng)膜片狀移植。注射細胞懸液與片狀移植比較的優(yōu)勢在于：(1)可以精確地控制細胞移植的數(shù)量；(2)供體和宿主視網(wǎng)膜細胞形成更好的接觸；(3)手術(shù)微創(chuàng)，減少術(shù)后并發(fā)癥；(4)更容易標記供體細胞。另一方面，高度退化的視網(wǎng)膜非常薄，并顯示出大量的膠質(zhì)瘢痕，因此視網(wǎng)膜薄片移植所需的更復(fù)雜的手術(shù)入路可能會增加瘢痕形成和纖維化的風(fēng)險。

全層視網(wǎng)膜薄片可以卷成套管，注入宿主視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜下間隙。大多數(shù)研究的主要目的是恢復(fù)光感受器功能[35]，但在此過程中也移植了RGC。然而，在貓和豬移植試驗中，幾乎沒有觀察到供體與宿主視網(wǎng)膜組織的整合，這表明視網(wǎng)膜薄片可能不是實現(xiàn)RGC移植的有效途徑。

目前有研究團隊沒有使用視網(wǎng)膜薄片進行移植，而是提純了出生后的小鼠視網(wǎng)膜細胞，并將它們通過玻璃體內(nèi)注射的方式移植到成年嚙齒動物視網(wǎng)膜上[36]。實驗結(jié)果表明，從較早期(胚胎或出生后早期)分離的RGC在移植后存活率較高。盡管RGC移植的成功率很低，但一些RGC移植到宿主視網(wǎng)膜的玻璃體內(nèi)，產(chǎn)生了內(nèi)源性RGC的正常形態(tài)，對光有反應(yīng)，甚至與外側(cè)膝狀體和視上丘建立了突觸聯(lián)系。

WANG等[37]將從胚胎干細胞(hESC)誘導(dǎo)分化出的視杯狀結(jié)構(gòu)中提取大約20 000個RPC移植到N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)處理的小鼠玻璃體腔中。觀察發(fā)現(xiàn)，其中約0.5%的細胞在移植后5周成功整合到NMDA處理的小鼠視網(wǎng)膜中。存活的移植細胞遍布整個神經(jīng)節(jié)細胞層(GCL)，與宿主殘留的RGC在小鼠視網(wǎng)膜GCL內(nèi)呈互補分布。這些RGC投射到視神經(jīng)的能力表明，hESC來源的供體細胞可能具有整合到宿主視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)回路的能力。這些研究表明，hESC來源RGC移植是可能的，盡管效果不是很好。

8 小 結(jié)

在過去的研究中，hPSC已經(jīng)被用來探究不同類型的視網(wǎng)膜細胞發(fā)育和各種神經(jīng)退行性疾病。但大多數(shù)的研究著眼于視網(wǎng)膜外層細胞的疾病，利用hPSC來研究RGC疾病的試驗是缺乏的。目前運用hPSC來治療RGC疾病還存在以下幾個關(guān)鍵的問題需要解決：(1)移植細胞的手術(shù)方式選擇(以細胞懸液還是視網(wǎng)膜薄片)，并培養(yǎng)能夠掌握手術(shù)的臨床醫(yī)生；(2)從hPSC中區(qū)分出特定的亞型，正確理解不同視神經(jīng)疾病中特定RGC亞型的退變情況；(3)移植細胞分化和成熟程度；(4)疾病的最佳移植時期。另外，隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，生物材料在移植中的運用被重視起來。一些生物相容性好的、堅固耐用的材料，如膠原、聚酯、聚環(huán)己內(nèi)酯、聚酰亞胺和對苯二烯等被用來避免移植損傷和免疫反應(yīng)。我們有理由相信，在不久的將來一些目前難以被治愈的視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病在干細胞移植技術(shù)合理運用下可得到突破性的進展。