李洪波，黃 銳，代 將，鐘振東

（1. 四川省廣漢市人民醫(yī)院外二科，廣漢 618300；2. 四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院肝膽外科，成都 610007；3. 四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院急救中心，成都 610007；4. 四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院動物研究中心，成都 610007）

近年來，肝病發(fā)病率逐年上升。據(jù)不完全統(tǒng)計，世界上多達2 5% 的人口有肝病，主要誘發(fā)類型包括病毒性感染、酗酒和非酒精性脂肪肝[1]。肝病后期的主要治療手段是肝臟手術(shù)或肝移植手術(shù)，而肝缺血再灌注（hepatic ischemia reperfusion，HIR）則是手術(shù)必要環(huán)節(jié)。目前，肝缺血再灌注的主要損傷為缺氧造成的器官損傷、炎性反應、細胞過度凋亡和基因突變等，因此，如何預防與治療此類損傷已經(jīng)是全球性課題[2]。

竹節(jié)香附素A（raddeanin A, RA）是從?？刑崛〉膴A竹桃型三萜皂苷[3]。研究發(fā)現(xiàn)RA對人類肝癌細胞具有抗增殖[3]、促凋亡、抑制遷移與侵襲的效果。另外，RA 已被證實能通過抑制核因子-κB 和Wnt/β-catenin 信號通路，引起結(jié)直腸癌細胞凋亡[4]，但至今未見RA 在預防肝缺血再灌注損傷中的相關(guān)報道。此外，RA 參與PI3K/AKT/mTOR 通路誘導乳腺癌細胞凋亡[4]，提示RA能在細胞凋亡通路中起調(diào)節(jié)作用，可能是預防肝缺血再灌注后肝細胞過度凋亡的一個潛在化合物。因此，本實驗從氧化應激與細胞凋亡兩個方面探討RA 對肝缺血再灌注損傷大鼠的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量為260±20 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供[SCXK（川）2015-030]，飼養(yǎng)于四川大學華西醫(yī)院[SYXK(川)2018-119]。本研究經(jīng)四川大學華西醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批通過（編號2020280A）。

1.2 藥物、試劑和儀器

RA 純度≥98%，購自上海源葉生物科技有限公司（批號：20190203）。超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）、TUNEL 測定試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗B 淋巴細胞瘤-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、B 淋巴細胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、β-肌動蛋白（βactin）一抗和羊抗兔二抗均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter 公司）、酶標儀（美國Thermo 公司）、切片機（德國Le i c a 公司）、光學顯微鏡（日本Olympus 公司）、蛋白質(zhì)電泳儀（美國Bio-Rad 公司）、全功能成像儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 主要實驗方法

1.3.1 實驗分組及大鼠肝缺血再灌注模型構(gòu)建[5]

將30只大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分成3組，即模型組、假手術(shù)組與RA 組，每組10 只。RA 組手術(shù)前24 h 與1 h 分別經(jīng)尾靜脈注射RA（10 mg/kg），模型組與假手術(shù)組同法注射等體積的0.9% NaCl溶液（生理鹽水）。最后一次預處理完畢后1 h，各組大鼠腹腔注射戊巴比妥（40 mg/kg），于上腹正中做長約4 cm 切口打開腹腔，暴露肝臟且游離肝周韌帶。模型組與RA 組用無損傷血管夾夾閉肝左葉和肝中葉入肝血管阻斷血流（70%肝臟缺血）60 min 后，松開血管夾恢復血流。假手術(shù)組僅游離肝門而不阻斷血流。再灌注6h 后，從下腔靜脈采血用于丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（A S T）、乳酸脫氫酶（L D H）的檢測；采集左葉肝臟在－80℃下儲存，用于炎性因子、氧化應激因子和凋亡相關(guān)蛋白的檢測；右葉肝臟儲存在4% 的多聚甲醛溶液中固定，用于HE 染色與TUNEL 染色病理學觀察。

1.3.2 血清中ALT、AST、LDH 含量的檢測

收集下腔靜脈血1 mL，以3 000 r/min 離心10 min，取上層血清，按照試劑盒說明書進行操作，使用全自動血液生化儀測定各組血清中ALT、AST 和LDH 的水平。

1.3.3 肝臟中IL-1β、IL-6、TNF-α 及SOD、MDA含量的檢測

將左葉肝臟制備10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書進行操作，使用全自動酶標儀測定肝臟中IL-1β、IL-6、TNF-α 及SOD、MDA 的含量。

1.3.4 肝臟形態(tài)學分析

所有組織病理學檢查均采用“雙盲法”。將固定好的各組肝臟標本用石蠟包埋后分別使用HE染色，在400 倍下進行組織學分析，評價肝臟組織被膜、肝索、中央靜脈和核膜等的損傷情況。

1.3.5 肝細胞凋亡率的檢測

各組肝臟標本用石蠟包埋、切片后，按照TUNEL染色試劑盒進行染色操作，使用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，每張切片隨機選取5個400倍視野，按每100 個細胞中含凋亡細胞數(shù)計算細胞凋亡率。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測

將左葉肝臟取出，提取總蛋白并測定蛋白濃度。蛋白樣品（20μg）使用10 % SDS-PAGE進行電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉將膜封閉60 min，然后加入下列一抗在4 ℃條件下過夜孵育：兔抗大鼠B a x（1 ∶1 000）、兔抗大鼠Bcl-2（1∶1 000）、兔抗大鼠Caspase-3（1∶1 000）、兔抗大鼠β-actin（1∶1 000）。使用TBST 將膜清洗干凈后，加入羊抗兔IgG（1∶1 0000），室溫孵育2 h，最后使用ECL試劑盒曝光顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)進行分析。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 RA 預處理對大鼠肝臟功能的保護作用

再灌注6 h 后，與假手術(shù)組相比，模型組與RA 組血清中ALT、AST 與LDH 含量明顯增高（P＜0.01）。與模型組相比，RA 組血清中ALT、AST 與LDH 的含量明顯減少（P＜0.01）（表1）。

2.2 RA 預處理對大鼠炎性因子的影響

再灌注6 h 后，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肝臟中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量明顯增多（P＜0.01）；與模型組相比，RA 組肝臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量明顯減少（P＜0.05）（表2）。

2.3 RA 預處理對大鼠肝臟氧化應激因子的影響

再灌注6 h 后，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肝臟中SOD 含量明顯降低，MDA 含量明顯增多（均P＜0.0 5）；與模型組相比，R A 組肝臟中SOD 含量明顯增多，MDA 明顯減少（均P＜0.05）（表3）。

表 1 3 組大鼠血清中ALT、AST、LDH 含量Table 1 Serum ALT, AST and LDH contents in the three groups of rats( ± s, n=10)

表 1 3 組大鼠血清中ALT、AST、LDH 含量Table 1 Serum ALT, AST and LDH contents in the three groups of rats( ± s, n=10)

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，##P ＜0.01。

組 別 ALT/(U·L-1) AST/(U·L-1) LDH/(U·L-1)假手術(shù)組模型組竹節(jié)香附素A 組45.83±5.95 199.50±15.24**129.87±14.88##110.67±5.68 203.67±11.02**166.67±6.72##791.53±21.33 1717.57±75.74**1347.23±34.36##

表 2 3 組大鼠肝臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量Table 2 IL-1β, IL-6 and TNF-α contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

表 2 3 組大鼠肝臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量Table 2 IL-1β, IL-6 and TNF-α contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，##P ＜0.01。

組 別 IL-1β/(ng·L-1) IL-6/(ng·L-1) TNF-α/(ng·L-1)假手術(shù)組模型組竹節(jié)香附素A 組4.55±0.21 5.28±0.14**4.82±0.16##3.58±0.11 3.99±0.13**3.70±0.10##35.96±1.47 40.36±0.66**37.99±0.30##

表 3 3 組大鼠肝臟中SOD 和MDA 含量Table 3 SOD and MDA contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

表 3 3 組大鼠肝臟中SOD 和MDA 含量Table 3 SOD and MDA contents in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

注：與假手術(shù)組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05。

組 別 SOD/(ng·L-1) MDA/(ng·L-1)假手術(shù)組模型組竹節(jié)香附素A 組22.97±1.08 20.47±0.14*21.13±0.32#0.73±0.02 0.84±0.02**0.79±0.02#

2.4 RA 預處理對大鼠肝臟形態(tài)學的影響

HE 染色后光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組肝臟組織均為正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，未見明顯的纖維組織增生及炎性滲出（圖1A）。模型組肝臟被膜完整，肝索排列紊亂；大量肝細胞空泡變性或壞死，可見細胞明顯腫脹變形，細胞質(zhì)內(nèi)含大小不等的空泡，細胞核多被擠于一側(cè)，部分細胞核固縮或溶解，細胞結(jié)構(gòu)模糊；門管區(qū)結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理改變（圖1B）。RA 組肝臟被膜完整，肝索排列較為整齊，肝細胞腫脹、空泡變性，偶見少量肝細胞呈點狀壞死，并伴少量中性粒細胞或淋巴細胞浸潤；門管區(qū)結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理改變（圖1 C）。

圖 1 3組大鼠肝臟病理形態(tài)學觀察 (HE染色)Figure 1 Observation on pathological morphology of the liver in the three groups of rats (HE staining)

圖 2 3組大鼠肝細胞凋亡觀察 (TUNEL染色)Figure 2 Observation on apoptosis of hepatocytes of the three groups of rats (TUNEL staining)

2.5 RA 預處理對大鼠肝臟細胞凋亡的影響

TUNEL 法結(jié)果顯示，假手術(shù)組細胞核多數(shù)呈藍色，細胞結(jié)構(gòu)完整，凋亡細胞較少（圖2A）；模型組大部分細胞核呈黃色，說明細胞結(jié)構(gòu)被破壞，凋亡細胞大量生成（圖2B）；RA組細胞核大部分呈藍色，部分細胞核呈黃色，說明出現(xiàn)部分凋亡細胞（圖2C）。與假手術(shù)組相比，模型組和RA 組肝臟細胞凋亡率均明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，RA 組肝臟細胞凋亡率明顯降低（P＜0.0 1）（表4）。

2.6 RA 預處理對大鼠肝臟凋亡蛋白的影響

與假手術(shù)組相比，模型組與RA 組中Bax 與Caspase-3 的蛋白表達水平明顯升高，而Bcl-2 的蛋白表達水平明顯降低（均P＜0.05）；與模型組相比，RA 組中Bax 與Caspase-3 的表達水平明顯降低，Bcl-2 的表達水平明顯升高（P＜0.05）（表5，圖3）。

表 4 3 組大鼠肝細胞凋亡率Table 4 Apoptosis rates of hepatocytes in the three groups of rats( ± s, n=10)

表 4 3 組大鼠肝細胞凋亡率Table 4 Apoptosis rates of hepatocytes in the three groups of rats( ± s, n=10)

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，##P ＜0.01。

組 別 凋亡率/%假手術(shù)組模型組竹節(jié)香附素A 組0.02±0.04 16.15±0.33**6.62±0.99##

表 5 3 組大鼠肝臟中Bax、Bcl-2 和Caspase-3 表達Table 5 Expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

表 5 3 組大鼠肝臟中Bax、Bcl-2 和Caspase-3 表達Table 5 Expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in the liver of the three groups of rats( ± s, n=10)

注：與假手術(shù)組相比，**P ＜0.01；與模型組相比，#P ＜0.05，##P<0.01。

組 別 Bax Bcl-2 Caspase-3假手術(shù)組模型組竹節(jié)香附素A 組1.00±0.00 2.43±0.33**1.81±0.11##1.00±0.00 0.54±0.12**0.77±0.14#1.00±0.00 1.61±0.17**1.23±0.05##

圖 3 3 組大鼠肝臟中Bax、Bcl-2、Caspase-3 表達Figure 3 Expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in the liver of the three groups of rats

3 討論

肝缺血再灌注損傷最主要的特征是肝損傷，而肝功能檢測是目前肝損傷檢測最快捷方便的一個方法，其最常見的檢測指標為血清中的ALT、AST和LDH。肝損傷的主要表現(xiàn)是血清中ALT和AST 的水平異常升高[6-7]。本研究結(jié)果顯示，RA 能有效降低肝缺血再灌注后肝細胞中ALT與AST的水平，同時能降低血清中LDH 的水平（P＜0.01），說明模型制備成功，而且RA 能預防肝缺血再灌注后肝細胞的損傷。

氧化應激平衡在缺血過程中起關(guān)鍵作用，失衡會導致肝細胞損傷[8]，主要原因是缺血導致組織缺氧，形成大量氧自由基，發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用[9-10]。目前檢測氧化應激平衡的常用指標為SOD 與MDA。本研究結(jié)果表明，肝缺血再灌注前使用RA 預防給藥，能明顯降低肝組織中MDA的含量，提高SOD 的水平（P＜0.05），說明RA 能預防肝缺血再灌注帶來的氧化應激失衡。有研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中的巨噬細胞會在再灌注后產(chǎn)生大量的炎性因子與趨化因子，調(diào)節(jié)與激活一系列的炎性機制，造成炎性反應，損傷肝細胞[11]，最終引起細胞死亡和組織壞死[12]。同時，再灌注早期主要的損傷是由促炎因子與細胞因子造成，如IL-1β、IL-6 和TNF-α 等[13]。本實驗發(fā)現(xiàn)，術(shù)前使用RA 預防后，肝臟中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量顯著降低（P ＜0.05），阻止了肝組織氧化應激失衡，同時減輕了炎性因子對肝臟的損傷。

病理學觀察是評價器官病變的重要手段之一，能直觀地反映器官組織的狀態(tài)。對肝臟進行病理學形態(tài)觀察也發(fā)現(xiàn)，HE 染色后，RA 組肝臟組織的細胞核腫脹程度與細胞質(zhì)內(nèi)空白均明顯減少，細胞排列結(jié)構(gòu)也恢復整齊，證明RA 可以預防肝缺血再灌注后的損傷。細胞凋亡是一種細胞死亡方式。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟再灌注會激活相關(guān)凋亡通路，誘導正?；蚴軗p的肝細胞死亡[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)，RA 組中肝細胞的凋亡數(shù)量明顯減少，細胞凋亡率也明顯降低（P ＜0.01）；RA 組凋亡通路中Bax 和Caspase-3 的蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2 的表達水平顯著升高（P ＜0.05），結(jié)果表明，RA 在作用正常肝細胞時，體現(xiàn)的藥理作用主要以抗炎抗氧化為主，通過減少肝臟組織中氧化應激與炎性因子的水平間接避免肝臟細胞受損，表現(xiàn)出細胞凋亡減少的狀態(tài)。綜合兩部分結(jié)果，RA 的預防給藥能減輕肝臟的病變，減少肝細胞的凋亡數(shù)量，其作用機制可能是降低Bax 和Caspase-3 的表達，以及增加Bcl-2 的表達。

缺血再灌注是一種復雜的病理生理現(xiàn)象，是一個包括局部缺血損傷與再灌注損傷的動態(tài)過程[15]，涉及代謝紊亂、氧化應激、炎性反應和細胞凋亡等過程。所以，探討缺血再灌注損傷的確切機制對減輕手術(shù)風險和改善患者預后具有重要意義。RA 作為一種中藥有效提取成分，提取方法簡單，成本低廉且獲取方式多，不良反應少，是一種非常好的治療藥物。RA 在腫瘤細胞中通過促進細胞凋亡產(chǎn)生抗腫瘤的作用，對正常細胞具有保護與抗炎作用，不會對正常細胞造成損傷。本實驗通過對大鼠術(shù)前注射RA，研究發(fā)現(xiàn)其有預防肝缺血再灌注損傷的效果，表現(xiàn)為提升肝功能、降低氧化損傷、減少炎性因子的釋放，以及減少肝細胞凋亡，其作用途徑可能與Bax/Bcl-2/Caspase-3 凋亡通路相關(guān)。