趙亞妮，李 瑤，張 妍，王四旺，安軍明

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，咸陽(yáng) 712046；2.西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，西安 710069；3.西安市中醫(yī)醫(yī)院針灸推拿科，西安 710021）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis）是一種炎性腸病，主要侵襲直腸和結(jié)腸[1]。臨床表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕、糞便稠度改變、糞便帶血和結(jié)腸縮短，病理表現(xiàn)為結(jié)腸黏膜損傷和腸道組織學(xué)改變[2-3]。近年來(lái)，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率及向結(jié)腸癌轉(zhuǎn)化率升高，已逐漸成為全球重點(diǎn)關(guān)注的疾病之一[4]。動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制及研發(fā)治療藥物的重要基礎(chǔ)，因此建立一個(gè)成熟穩(wěn)定的潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型至關(guān)重要。

葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）是葡聚糖的聚陰離子衍生物，由葡聚糖和氯磺酸的酯化反應(yīng)形成[5]。研究表明，當(dāng)小鼠自由飲用相對(duì)分子質(zhì)量為36 000～50 000 的DSS 達(dá)到累積30 mg/g 時(shí)，即可成功建立急性潰瘍性結(jié)腸炎模型[6]。此外，還可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整DSS濃度和給藥時(shí)間，建立慢性、急慢性交替模型或結(jié)腸癌模型。該造模方法操作簡(jiǎn)便，性價(jià)比高，重復(fù)性好，是結(jié)腸炎建模的首選方法[7-8]。DSS造模給藥方式多推薦自由飲用，但許多學(xué)者擔(dān)心自由飲用會(huì)因小鼠飲水量的差異造成DSS 攝入量不均，最終導(dǎo)致模型組間及組內(nèi)差異較大[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)嘗試通過(guò)灌胃給藥的方式控制每只小鼠的DSS 攝入量，以期達(dá)到與DSS 自由飲用同樣的造模效果，為潰瘍性結(jié)腸炎研究中的建模方式選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠32 只，體質(zhì)量為18～22 g，6～8 周齡，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（陜）2019-001]提供。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（陜）2019-001]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，室內(nèi)溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由飲水，人工控制光照晝夜12 h，墊料1 周更換2 次。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》，按照3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

DSS 相對(duì)分子質(zhì)量為36 000～50 000，購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals 公司（批號(hào)160110）；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司（批號(hào)1225A19）；PBS 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司（批號(hào)20181016）；CKX41型倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司；Shimadzu電子天平購(gòu)自島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；Milli-Q Academic 超純水系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore 公司。

1.3 分組及給藥

取32 只6～8 周齡的雄性C57BL/6 小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白組（Control）、3% DSS 自由飲用組（DSS-3%）、5 g/kg DSS灌胃組（DSS-5 g/kg）和6 g/kg DSS 灌胃組（DSS-6 g/kg），每組8 只?？瞻捉M小鼠自由飲水；DSS-3%組小鼠自由飲用3% DSS 水溶液（將3 g DSS 溶于100 mL 去離子水中配制而成），每天定時(shí)記錄飲水量并更新DSS；DSS-5 g/kg 與DSS-6 g/kg組小鼠分別灌胃500 mg/mL 和600 mg/mL的DSS，小鼠的給藥容量為10 ml/kg，溶劑為去離子水，每天灌胃1 次，連續(xù)7 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)期間，每天記錄各組小鼠的飲水量、體質(zhì)量、糞便性狀及便血情況，進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分。DAI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]見(jiàn)表1。末次給藥24 h 后，脫頸椎處死小鼠，分離結(jié)腸，肉眼觀察病變情況，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度。隨后取中段結(jié)腸1 cm 左右，用1 mL注射器吸取預(yù)冷的PBS 緩沖液，沖洗干凈結(jié)腸內(nèi)容物后，將結(jié)腸組織置于4% 的多聚甲醛溶液中，進(jìn)行HE 染色。組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[11]見(jiàn)表2。分離小鼠胸腺和脾臟，稱其質(zhì)量并計(jì)算臟器指數(shù)。給藥完畢后計(jì)算各組小鼠7 d 內(nèi)的DSS 攝入量，計(jì)算方法[6]如下：DSS-3%組的DSS 攝入量＝[飲水量（mL）×DSS（g）/100 mL]/小鼠體質(zhì)量（g）；DSS-5 g/kg 組的DSS 攝入量＝5（g/kg）×7（d）；DSS-6 g/kg 組的DSS 攝入量＝6（g/k g）× 7（d）。

表 1 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Disease activity index (DAI) scoring criteria

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s表示，方差齊時(shí)用單因素方差分析，方差不齊時(shí)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

DSS-3%組平均每只小鼠7 d 內(nèi)總飲水量為26.54 mL，計(jì)算可得DSS-3%組每只小鼠7 d 的總DSS 攝入量為39.75 mg/g；DSS-5 g/kg 和DSS-6 g/kg 組平均每只小鼠7 d 內(nèi)總DSS 攝入量分別為35 mg/g 和42 mg/g。因此，3 組小鼠的DSS攝入量均達(dá)到了潰瘍性結(jié)腸炎成模劑量，且以DSS-6 g/kg 組小鼠的DSS 攝入量最高。

造模后，DSS-3%組、DSS-5 g/kg 組和DSS-6 g/kg 組小鼠體質(zhì)量均呈下降趨勢(shì)，DAI 評(píng)分均呈上升趨勢(shì)（圖1）。給藥第3 天起，DSS-3%組小鼠出現(xiàn)軟便；第5 天出現(xiàn)血便；第6 天起糞便呈血水樣，小鼠毛色無(wú)光澤，精神萎靡，與空白組比較DAI 評(píng)分明顯升高（P＜0.01）。從開(kāi)始造模至給藥結(jié)束，DSS-5 g/kg 組和DSS-6 g/kg組小鼠糞便性狀無(wú)明顯變化，DAI 評(píng)分與空白組比較均無(wú)明顯差異（P＞0.05）。給藥第5 天起，與空白組比較，DSS-3%組、DSS-5 g/kg 組和DSS-6 g/kg 組小鼠的體質(zhì)量均明顯降低（P＜0.01），第8 天時(shí)DSS-3%組小鼠體質(zhì)量下降更明顯，顯著低于DSS-5 g/kg 和DSS-6 g/kg 組（均P＜0.01）。

2.2 結(jié)腸長(zhǎng)度

結(jié)腸萎縮是潰瘍性結(jié)腸炎的一個(gè)重要病理特征。本研究發(fā)現(xiàn)，DSS-3%組、DSS-5 g/kg 組和DSS-6 g/kg 組小鼠結(jié)腸均有不同程度的萎縮，與空白組比較均明顯縮短（均P＜0.01）；DSS-3%組與DSS-5 g/kg 組、DSS-6 g/kg 組相比，小鼠結(jié)腸萎縮更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

表 2 組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Histopathological scoring criteria

圖 1 不同給藥方式對(duì)小鼠體質(zhì)量（A）及DAI 評(píng)分（B）的影響Figure 1 Effects of different administration methods on body weight (A) and DAI score (B) of mice

圖 2 不同給藥方式對(duì)小鼠結(jié)腸形態(tài)（A）及結(jié)腸長(zhǎng)度（B）的影響Figure 2 Effect of different administration methods on colon morphology (A) and colon length (B) of mice

2.3 免疫器官指數(shù)

免疫器官指數(shù)可以反映機(jī)體的炎性反應(yīng)水平，而DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎可降低小鼠胸腺指數(shù)，增加脾臟指數(shù)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組相比，DSS-3%組、DSS-5 g/kg 組和DSS-6 g/kg組之間小鼠胸腺指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但DSS-3%組和DSS-6 g/kg 組的小鼠胸腺指數(shù)均有所下降；與空白組相比，DSS-3%組和DSS-6 g/kg 組的小鼠脾臟指數(shù)均明顯升高（P＜0.01 或P＜0.05），其中自由飲用組升高更為明顯；DSS-5 g/kg 組的小鼠脾臟指數(shù)雖有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0 5）。見(jiàn)圖3。

2.4 組織病理學(xué)

HE 染色結(jié)果顯示，空白組小鼠的結(jié)腸組織黏膜上皮完整，腺體排列整齊，隱窩結(jié)構(gòu)正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；DSS-3%組小鼠的結(jié)腸組織黏膜上皮嚴(yán)重缺損，大量腺體破壞，隱窩結(jié)構(gòu)消失，黏膜下層水腫，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與空白組、DSS-5 g/kg 組和DSS-6 g/kg 組小鼠相比，DSS-3%組小鼠的結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分均明顯升高（P＜0.01 或P＜0.05）。DSS-5 g/kg組和DSS-6 g/kg 組小鼠的結(jié)腸組織黏膜上皮基本完整，部分腺體及隱窩結(jié)構(gòu)變形破壞，黏膜下層有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與空白組相比，DSS-6 g/kg組小鼠的結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分明顯升高（P＜0.05），而DSS-5g/kg 組雖有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0 5）。見(jiàn)圖4。

圖 3 不同給藥方式對(duì)小鼠胸腺指數(shù)（A）及脾臟指數(shù)（B）的影響Figure 3 Effects of different administration methods on thymus index (A) and spleen index (B) of mice

圖 4 不同給藥方式對(duì)小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)（A）和組織病理學(xué)評(píng)分（B）的影響（HE，×200）Figure 4 Effects of different administration methods on histopathomorphology (A) and histopathological score (B) of colon tissue in mice（HE, ×200）

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是消化系統(tǒng)的一種慢性炎性反應(yīng)，其發(fā)病因素復(fù)雜，可能與環(huán)境、免疫、腸道菌群及患者精神狀況等有一定的關(guān)系[14-15]。近年來(lái)，潰瘍性結(jié)腸炎在亞洲的發(fā)病率普遍上升，且趨于年輕化。潰瘍性結(jié)腸炎一旦發(fā)病，難以治愈，大部分患者均需終生用藥治療，工作和生活均受到嚴(yán)重的影響[16]。目前，臨床上針對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎一般采用美沙拉嗪口服聯(lián)合栓劑給藥治療，嚴(yán)重者可選用腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）抑制劑（如英夫利昔等）進(jìn)行治療，但仍有超過(guò)40%的患者對(duì)TNF-α 抑制劑抵抗[17-18]。因此，治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物研究尤為迫切，而建立一個(gè)穩(wěn)定成熟的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是潰瘍性結(jié)腸炎藥物研究的基礎(chǔ)。

目前，建立潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型的方法主要有化學(xué)刺激法、免疫法、基因修飾法等[19-20]。其中，化學(xué)刺激法中以乙酸、DSS 和三硝基苯磺酸最為常見(jiàn)；免疫法中以胎鼠結(jié)腸種植、大鼠結(jié)腸細(xì)菌菌株移植和結(jié)腸黏膜組織致敏為主；基因修飾則主要是采用現(xiàn)代技術(shù)對(duì)特定基因敲除而引發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎。由于免疫法對(duì)環(huán)境和操作技術(shù)的要求嚴(yán)格，成功率較低，而基因修飾法價(jià)格昂貴，因此以往研究仍以化學(xué)刺激法居多。然而，乙酸建立的潰瘍性結(jié)腸炎模型在發(fā)病機(jī)制上與人類差異很大；三硝基苯磺酸建立的潰瘍性結(jié)腸炎模型的免疫反應(yīng)以輔助性T 細(xì)胞1（T helpercells 1，Th1）/Th17 為主，更適合克羅恩病的研究。通過(guò)控制DSS 的不同給藥濃度和給藥周期能夠建立穩(wěn)定的急性或慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型，且其引起的免疫反應(yīng)和病理表現(xiàn)癥狀與人類相似。由于DSS 給藥多采用自由飲水的方式，小鼠飲水量的差異會(huì)影響到造模效果的均一性，因此本課題組嘗試通過(guò)DSS 灌胃的方式來(lái)建立更穩(wěn)定、均一的急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型。

DAI 評(píng)分和結(jié)腸組織病理學(xué)變化是潰瘍性結(jié)腸炎模型建立成功的金標(biāo)準(zhǔn)[21-22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，DSS-5 g/kg 組和DSS-6 g/kg組小鼠的DAI 評(píng)分均無(wú)明顯差異（均P ＞0.05）；而DSS-3%組小鼠自第3 天起，DAI 評(píng)分就明顯升高（P ＜0.0 1）；與空白組相比，D S S-3%組、DSS-5 g/kg 組和DSS-6 g/kg 組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度雖都明顯縮短（均P ＜0.01），但DSS-3%組與DSS-5 g/kg 組和DSS-6 g/kg 組相比縮短更為明顯（均P ＜0.01）。從組織病理學(xué)觀察也可看出，DSS-3%組小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎病理表現(xiàn)較DSS-5 g/kg 組和DSS-6 g/kg 組小鼠更為明顯。連續(xù)7 d 灌胃給予小鼠5 g/kg 或6 g/kg DSS，總攝入量分別為35 mg/g 與42 mg/g，已達(dá)到潰瘍性結(jié)腸炎成模所需的最低攝入量（30 mg/g），但仍不能建立穩(wěn)定的潰瘍性結(jié)腸炎模型；而連續(xù)7 d自由飲用3% DSS，攝入量為39.75 mg/g，雖不及6 g/kg DSS 灌胃組，但可成功建立穩(wěn)定的潰瘍性結(jié)腸炎模型。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)DSS-3%組小鼠造模期間出現(xiàn)的體質(zhì)量減輕、黏液膿血便、結(jié)腸縮短及組織病理學(xué)變化均與臨床上的潰瘍性結(jié)腸炎患者癥狀具有相似性，而且胸腺萎縮，說(shuō)明小鼠免疫功能受到該造模方法的影響，這與以往文獻(xiàn)報(bào)告[23-24]一致。而DSS-5 g/kg 組和DSS-6 g/kg 組小鼠在給藥過(guò)程中并未出現(xiàn)黏液膿血便，胸腺也未受到影響；這一結(jié)果與衡宇等[9]的研究結(jié)果不一致。衡宇等[9]研究表明，4 g/kg 灌胃組部分小鼠于第5 天時(shí)出現(xiàn)肉眼血便，第8 天時(shí)出現(xiàn)血水樣便；而本研究發(fā)現(xiàn)，3% DSS 自由飲用組造模第5 天時(shí)全部出現(xiàn)肉眼血便，第6 天轉(zhuǎn)為黏液膿血便，同時(shí)伴隨飲食量和飲水量下降，毛色無(wú)光澤。Thorsten 等[6]研究DSS 攝入量與潰瘍性結(jié)腸炎模型的關(guān)系時(shí)也發(fā)現(xiàn)，7 d 內(nèi)小鼠攝入DSS 量超過(guò)30 mg/g 才能建立有效的潰瘍性結(jié)腸炎模型，而4 g/kg DSS 灌胃量持續(xù)7 d 并不能達(dá)到造模明顯的有效劑量。由于研究目的不同，灌胃建立輕微病變的潰瘍性結(jié)腸炎模型也可能滿足部分實(shí)驗(yàn)要求。

總之，本研究采用5 g/kg 和6 g/kg DSS 的灌胃劑量仍然沒(méi)有建立明顯的潰瘍性結(jié)腸炎模型。這可能是由于自由飲用DSS 組小鼠為緩慢持久攝入，可起到長(zhǎng)久刺激機(jī)體的作用；而灌胃組小鼠給藥后藥物代謝速度快，刺激時(shí)間短，故給藥量雖大，但作用時(shí)間短。因此，DSS 灌胃造模的效果不及自由飲用法。此外，小鼠種屬和體質(zhì)量等因素也可能影響造模結(jié)果[25]。后續(xù)本課題組將嘗試每天少量多次灌胃DSS 溶液來(lái)做對(duì)照研究，以期建立更穩(wěn)定、均一的模型。