李蒙航，趙振軍，李佩佩*

(1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023； 2.大連理工大學(xué)，遼寧 大連 116024)

基因是遺傳的主要功能單位，它們所包含的核酸堿基的特定序列能夠編碼生物體功能所需的大部分蛋白質(zhì)。作為基因的載體，2種類(lèi)型的核酸：核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)或脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)受到廣泛關(guān)注，尤其是基于核酸的體外分子檢測(cè)技術(shù)，成為強(qiáng)大的生物學(xué)研究工具[1-2]。基于核酸的PCR(Polymerase Chain Reaction)診斷比傳統(tǒng)方法(基于酶或者抗體的分析)具有更多的優(yōu)勢(shì)：更高的修改靈活性、更高的檢測(cè)靈敏度以及更快、更早的獲得檢測(cè)結(jié)果[3]，在人類(lèi)疾病控制(如艾滋病[4]、瘧疾[5]和丙型肝炎[6]等)、農(nóng)作物病害控制[7]、畜牧業(yè)疫病防控[8]和食品安全領(lǐng)域[9]均發(fā)揮著極其重要的作用。PCR診斷包括多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：核酸的提取，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及結(jié)果讀出[10]。從生物體中提取核酸，需要將核酸從含有蛋白質(zhì)、多糖和脂肪等多種生物大分子的復(fù)雜體系中進(jìn)行分離、純化，是PCR、測(cè)序等生物學(xué)分析的先決條件[11]。核酸提取的質(zhì)量，會(huì)顯著影響后續(xù)分析的準(zhǔn)確性和靈敏度。生物樣本中殘留的抑制性成分(血紅素、球蛋白等成分)及分離、純化過(guò)程中殘留的有機(jī)物和鹽分，是影響PCR靈敏性和分析穩(wěn)定性的重要因素[12-14]。

傳統(tǒng)的核酸的分離方法是基于有機(jī)溶劑萃取的液相分離，如Chomczynski’s法[15]、酚氯抽提方法[16-17]、溴化乙錠-氯化鈣梯度離心法等[18]。液相分離方法雖然有效，但存在著很大的局限性：所需樣品量大、分離時(shí)間長(zhǎng)、易受污染、降解率高[19]。另外，液相分離方法中有機(jī)溶劑的殘留顯著增加了PCR抑制劑的殘留風(fēng)險(xiǎn)。為了提高提取核酸樣品的純度與濃度，核酸的提取方法也在不斷更新，目前固相萃取核酸的方法受到更多學(xué)者的青睞。固相萃取核酸的方法主要是采用一些對(duì)核酸有結(jié)合作用的固相材料，在一定條件下結(jié)合核酸然后又在適當(dāng)條件下脫附，實(shí)現(xiàn)核酸的分離。與液相萃取方法相比，固相萃取方法減少了有機(jī)溶劑的使用，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，分離時(shí)間短，樣品在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不易污染與降解，提取的核酸無(wú)論是濃度還是純度都相對(duì)較高[20-23]。本論文通過(guò)綜述具有核酸結(jié)合能力的固相材料及其在核酸固相分離過(guò)程中的研究進(jìn)展，探討核酸固相分離在病原PCR診斷應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)和局限，預(yù)測(cè)其發(fā)展趨勢(shì)。

1 具有核酸結(jié)合能力的固相材料及其作用機(jī)制

固相核酸分離主要是通過(guò)對(duì)核酸有吸附作用的固體顆粒在一定條件下結(jié)合核酸而實(shí)現(xiàn)的分離。目前，報(bào)道的具有核酸結(jié)合功能的固相材料主要包括：二氧化硅及其衍生物[24-30]、金屬及其衍生物[31-35]、云母[36]、合成樹(shù)脂[37-38]、纖維素[39]和氧化石墨烯[40-41]等，通過(guò)靜電作用、共價(jià)鍵結(jié)合等機(jī)制結(jié)合、分離核酸。

1.1 二氧化硅及其衍生物

二氧化硅納米顆粒作為無(wú)機(jī)納米粒子，具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉和比表面積大的特點(diǎn)，其可以均勻地分散在裂解液體系中，能夠更有效地結(jié)合核酸，因此二氧化硅及其衍生物被廣泛用于核酸固相分離[28, 42-43]。二氧化硅吸附核酸的方法主要分為：鹽橋法、直接靜電法和配位法[44]。鹽橋法中二氧化硅顆粒吸附核酸的驅(qū)動(dòng)力包括靜電屏蔽作用、脫水作用以及分子間氫鍵作用。在高濃度鹽中顆粒與核酸之間的靜電斥力會(huì)被屏蔽；當(dāng)鹽濃度達(dá)到1個(gè)臨界值時(shí)，顆粒與核酸足夠近的情況下可以通過(guò)分子間氫鍵的作用使得核酸吸附在二氧化硅顆粒表面；在胍鹽存在的情況下，顆粒和核酸還可以通過(guò)脫水作用結(jié)合在一起[44]。另外，二氧化硅納米顆粒表面也可以包覆聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)[45]、殼聚糖[46]等聚陽(yáng)離子電解質(zhì)，使顆粒在特定的裂解條件下呈正電荷，通過(guò)直接靜電作用與帶負(fù)電荷的核酸相結(jié)合。Jiang等[47]采用雙羧基偶聯(lián)劑與二氧化硅納米顆粒偶連，使得其表面有雙羧基能夠鰲合Fe3+，進(jìn)而通過(guò)Fe3+與磷酸根的配位作用來(lái)結(jié)合核酸。

1.2 金屬及其衍生物

金納米粒子(Au-Nanoparticles，Au-NPS)作為金屬材料，具備與四種脫氧核苷結(jié)合的良好的親和力，被廣泛用來(lái)結(jié)合核酸分子[31, 48-49]。由于雙鏈DNA(Double Stranded DNA，ds-DNA)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜[50]，且具有比單鏈DNA(Single Strand DNA，ss-DNA)更高的電荷密度，不利于與表面帶負(fù)電荷的Au-NPS結(jié)合，因此Au-NPS主要用來(lái)結(jié)合ss-DNA，且該結(jié)合僅在高溫下完成。另外有研究發(fā)現(xiàn)Au-NPS與ss-DNA的結(jié)合隨著DNA鏈的長(zhǎng)度增加而減弱，且粒子的粒徑大小在二者的結(jié)合力強(qiáng)度方面起著非常關(guān)鍵的作用[51]。

另外，學(xué)者們對(duì)銀納米粒子(Ag-Nanoparticles，Ag-NPS)結(jié)合特定的DNA序列的檢測(cè)技術(shù)也進(jìn)行了廣泛研究[52-54]。Basu等[53]發(fā)現(xiàn)銀納米粒子(Ag-NPS)與DNA中的核酸堿基之間存在非常緊密的親和力，根據(jù)Gu等[55]的報(bào)道這是因?yàn)锳g-NPS可以與DNA分子的堿基鳥(niǎo)嘌呤(G)和腺嘌呤(A)的N7原子以及堿基胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的N3原子結(jié)合。Yang等[54]采用原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Ag-NPS與ss-DNA可以實(shí)現(xiàn)有效的結(jié)合，而與ds-DNA之間卻是彼此獨(dú)立的隨機(jī)排列。

除金、銀納米顆粒外，四氧化三鐵納米顆粒，作為一種磁性納米顆粒，可以通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合核酸[24]，只是鮮少用四氧化三鐵納米顆粒直接進(jìn)行核酸分離，因?yàn)樗难趸F納米顆粒在結(jié)合核酸后的超順磁性減弱或者消失[56-57]，則不能發(fā)揮磁力分離的高通量和自動(dòng)化優(yōu)勢(shì)。因此，多是在其表面負(fù)載二氧化硅及其衍生物、進(jìn)行功能基團(tuán)修飾[58-59]，通過(guò)靜電作用等結(jié)合核酸，用于快速分離。

1.3 其他固相材料

云母[36]作為一種鋁硅酸鹽，可以通過(guò)共價(jià)鍵來(lái)結(jié)合核酸，或者對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾使其帶正電荷，通過(guò)靜電作用結(jié)合帶負(fù)電的DNA分子。同樣，合成樹(shù)脂，如DEAE-Sephaeose[60]往往也是帶正電荷的，可以通過(guò)靜電作用與核酸結(jié)合。另外，DNA與單壁碳納米管[61]、氧化石墨烯[41]可以通過(guò)π堆積作用結(jié)合。Zhao等[62]通過(guò)模擬研究得到的結(jié)果顯示C60可以在水溶液中與核苷酸緊密結(jié)合，驗(yàn)證了核酸與碳材料物質(zhì)間的結(jié)合。當(dāng)然還有一些其他的材料可以用于核酸分離，如纖維素[39]可以與核酸共價(jià)連接。

2 核酸固相分離及其在病原PCR診斷中的應(yīng)用

固相核酸分離方法主要是基于一些對(duì)核酸有吸附作用的聚合物材料，出于提高吸附量的目的，具有高比表面積和多孔結(jié)構(gòu)的納米顆粒材料備受青睞。隨著磁性材料的發(fā)展，1997年，Hawkins等[63]提出了核酸磁力分離——基于磁性材料快速分離核酸，并迅速發(fā)展，成為如今主要的核酸固相分離手段。下面，我們將從核酸磁力分離和非磁力分離綜述近年來(lái)核酸固相分離的進(jìn)展及其在分子檢測(cè)中的應(yīng)用。

2.1 磁力分離的原理

磁力分離是基于磁性納米顆粒的一種固相分離手段，其中磁性納米顆粒是指納米級(jí)的粒子，一般為核殼型結(jié)構(gòu)，由Fe、Co、Ni及其氧化物等組成內(nèi)核，核外層則由高分子聚合物組成殼層，具有超順磁性、比表面積大、無(wú)毒和粒徑可控等優(yōu)點(diǎn)[64-69]。這種基于磁性顆粒的核酸磁力分離，通過(guò)在一定溶液條件下，對(duì)核酸進(jìn)行選擇性吸附，吸附核酸的磁性納米顆粒在外加磁場(chǎng)(如磁鐵)時(shí)可控移動(dòng)，從而從含有蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)的體系中分離出來(lái)，再通過(guò)洗滌、脫附，實(shí)現(xiàn)核酸的提取，全過(guò)程通?？稍?0 min內(nèi)完成[70-71]。分離過(guò)程示意圖如圖1所示。磁力分離過(guò)程因?yàn)楸苊饬穗x心、過(guò)濾等繁瑣操作，有效提高了分離速度，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，現(xiàn)已有基于磁力分離原理的核酸自動(dòng)提取儀實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，通過(guò)自動(dòng)化操作不僅極大限度地節(jié)約了人力資源，同時(shí)也避免了諸多手動(dòng)操作中的誤差[70]。

圖1 磁力分離過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic diagram of magnetic separation

2.2 磁性納米顆粒的制備與開(kāi)發(fā)

由于二氧化硅具備良好的結(jié)合核酸的能力，二氧化硅包覆磁流體形成的Fe3O4@SiO2微球顆粒是最常用的核酸磁力分離納米材料。將二氧化硅涂覆到Fe3O4表面，主要方法有微乳液法[72]和St?ber法(原硅酸四乙酯的堿水解法)[73-76]。St?ber法因?yàn)椴淮嬖诒砻婊钚詣?，合成后的顆粒保留了快速的磁響應(yīng)能力，同時(shí)表面二氧化硅層可以防止顆粒之間的聚集，分散性好，更適合生物應(yīng)用[77-78]。然而St?ber法中的多步修飾程序使制備過(guò)程既耗時(shí)又費(fèi)力，Ma等[79]因此開(kāi)發(fā)了一種溶劑熱法，可以更簡(jiǎn)單、低成本地制備形狀均一、單分散性的Fe3O4@SiO2納米顆粒，將其用于大腸桿菌的核酸分離，可以獲得高品質(zhì)無(wú)蛋白質(zhì)污染的核酸用于PCR擴(kuò)增。Fan等[80]則將溶劑熱法改進(jìn)，首先使用四氯化硅作為交聯(lián)劑修飾Fe3O4顆粒表面,繼而實(shí)現(xiàn)顆粒表面硅層的快速可控生長(zhǎng)，所得納米顆粒具有優(yōu)異的耐酸性和穩(wěn)定、致密的硅涂層，用于質(zhì)粒DNA分離具有比商業(yè)化磁珠更高的產(chǎn)率。

隨著二氧化硅負(fù)載技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的磁性納米粒子被開(kāi)發(fā)出來(lái)，得到了普遍優(yōu)于市售磁性納米顆粒的應(yīng)用效果。Dao等[81]制備了二氧化硅包覆的磁性納米顆粒，用于提取乙型肝炎病毒(Hepatitis virus type B，HBV)和巴爾病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)的基因組DNA，結(jié)果顯示，該磁性顆粒提取的DNA在PCR擴(kuò)增中產(chǎn)物條帶在紫外光下清晰、明亮，具有比市售磁性顆粒更好的DNA純化效率。Xu等[82]制備的二氧化硅包覆的具有理想磁化強(qiáng)度的磁性復(fù)合微球可作為有效的質(zhì)粒DNA富集載體，相較于市售SM1-015B微球有很大優(yōu)勢(shì),能夠得到更大的提取效率與更優(yōu)的質(zhì)量。Deng 等[83]制備了以Fe3O4@SiO2為核、垂直排列的介孔二氧化硅微球，具有均勻的孔徑(2.3 nm)，借助其較大的孔徑和優(yōu)異的磁性，能夠?qū)崿F(xiàn)微囊藻毒素的快速高效(分離效率>95%)分離。Liu等[84]合成了Fe3O4@SiO2納米顆粒用于DNA定量分析，發(fā)現(xiàn)與市售微型Dynabeads(R)相比，該納米顆粒具有更好的靈敏度來(lái)定量DNA，檢測(cè)限能夠達(dá)到4 000堿基對(duì)(人類(lèi)DNA片段)。

二氧化硅廣泛應(yīng)用于包覆Fe3O4制備磁性納米顆粒，不僅可以有效防止磁性納米顆粒聚集，同時(shí)也方便引入其他活性基團(tuán)[78]。He等[85]采用氨基修飾的二氧化硅包覆的磁性顆粒分離質(zhì)粒DNA，發(fā)現(xiàn)從1 mL制備的細(xì)菌裂解液中可分離到約55 μg的pEGFP-N3質(zhì)粒DNA，與傳統(tǒng)的酚氯抽提方法(同樣條件分離到約55 μg的pEGFP-N3質(zhì)粒DNA)相比有很大的優(yōu)勢(shì)，且A260/A280的比值可以達(dá)到1.9，說(shuō)明提取的DNA純度很高，可以忽略蛋白質(zhì)的污染。Wu等[59]采用羧基修飾的二氧化硅包覆的磁性納米顆粒分離大腸桿菌樣品中的DNA，發(fā)現(xiàn)提取的DNA平均濃度為16 mg/L，其A260/A280的比值為1.75(提取質(zhì)量較好)，且電泳結(jié)果顯示大腸桿菌分子量按照預(yù)期分布，每個(gè)波段的亮度均勻，說(shuō)明羧基修飾的磁性納米粒子用于核酸提取的有效性。Pham等[86]采用二氧化硅包覆的磁性顆粒與氧化石墨烯組成的新型磁性材料，用于RNA的提取，發(fā)現(xiàn)得到RNA的數(shù)量是傳統(tǒng)的酚氯抽提方法的1.7倍。Chen等[67]以戊二醛為交聯(lián)劑，通過(guò)共價(jià)鍵將血紅蛋白固定在氨基功能化的Fe3O4@SiO2磁性納米粒子表面，得到了血紅蛋白修飾的新型磁性納米復(fù)合材料，將其應(yīng)用于大腸桿菌中質(zhì)粒DNA的提取，發(fā)現(xiàn)對(duì)質(zhì)粒DNA的吸附效率可以達(dá)到93%。另外，Per?in等[87]制備了新型材料——聚甲基丙烯酸羥乙酯磁性納米粒子，發(fā)現(xiàn)其對(duì)質(zhì)粒DNA的總回收效率可以達(dá)到92%，且該磁性顆粒在不明顯降低質(zhì)粒DNA的吸附量前可被循環(huán)使用6次。

2.3 磁力分離在病原PCR診斷中的應(yīng)用

磁力分離作為一種高效、節(jié)省成本的分離方法，具備與核酸結(jié)合后能夠在外加磁場(chǎng)快速移動(dòng)的特點(diǎn)[84]，可以避免傳統(tǒng)核酸分離過(guò)程中繁瑣的離心操作和諸多手動(dòng)操作誤差，具有下游高通量和自動(dòng)化應(yīng)用的前景[71]。

Zainabadi等[88]建立了基于二氧化硅磁性粒子高通量分離干血斑核酸(如圖2所示)的方法，全過(guò)程使用排槍在96孔板上操作，通量高，只是整體時(shí)效性尚未有顯著改善(提取時(shí)間約80～120 min)。因?yàn)閺膹?fù)雜的生物體中提取PCR診斷所需的核酸，往往包含多個(gè)步驟：樣本的裂解、核酸的分離、純化與洗脫。樣本裂解作為分離前的必需步驟，目前普遍需要耗時(shí)的溫浴過(guò)程，且對(duì)動(dòng)植物組織樣本，低溫研磨等預(yù)處理又難以避免[89]，不僅不能完全發(fā)揮磁力分離的高通量?jī)?yōu)勢(shì)，同時(shí)制約核酸提取的整體時(shí)效性。Li等[90]則通過(guò)優(yōu)化裂解過(guò)程，排除組織樣本繁瑣預(yù)處理同時(shí)將裂解時(shí)間縮短至最短15 min，再結(jié)合高通量磁力分離，報(bào)道了一種在96孔板上操作的全過(guò)程高通量的核酸提取方法，繼而結(jié)合可視化熒光定量PCR，建立了一種靈敏、準(zhǔn)確的柞蠶微孢子蟲(chóng)快速篩查技術(shù)，為更高效、更準(zhǔn)確的柞蠶微粒子病防疫提供了新思路(如圖3所示)。

圖2 高通量核酸提取方法原理示意圖[88]Fig.2 Schematic diagram of the high throughput nucleic acid extraction method[88]

圖3 a)高通量ALMS-qPCR用于柞蠶微粒子病防疫b)微粒子病防疫策略c)高通量磁力分離核酸靈敏、可視化qPCR檢測(cè)[90]Fig.3 a)High throughput ALMS-qPCR for Pébrine control b) Pébrine control strategy c) high throughput magnetic separation of nucleic acids sensitive and visualized qPCR detection[90]

2.4 非磁力固相分離

現(xiàn)行非磁力固相分離多需要通過(guò)過(guò)濾、離心、

移液等繁瑣操作才能將結(jié)合有核酸的固相材料從裂解液中分離出來(lái)，相比于借助外加磁場(chǎng)即能快速移動(dòng)、分離的磁性顆粒而言，往往需要更多、更密集的人力操作，效率和通量局限大。Zou等[39]利用纖維素可以結(jié)合核酸的特性，選擇具有一定剛性的纖維素紙條作為核酸固相分離載體，通過(guò)在裂解液和清洗液之間轉(zhuǎn)移，快速?gòu)牧呀庖褐蟹蛛x出可供PCR檢測(cè)的模板，時(shí)間不超過(guò)30 s。但遺憾的是，樣本傳統(tǒng)裂解過(guò)程的耗時(shí)性與繁瑣性未能得到有效解決，依舊制約著核酸提取的效率，且纖維素紙條1次只能提取1個(gè)樣本，分離通量低。另外，纖維素洗脫DNA困難，需要將結(jié)合有DNA的纖維素紙條作為PCR擴(kuò)增的模板，對(duì)下游PCR的選擇具有局限性。

圖4 纖維素紙條提取核酸示意圖[39]Fig.4 Schematic diagram of nucleic acid extraction using cellulose-based paper[39]

3 核酸固相分離的局限及發(fā)展前景

固相核酸分離，尤其是磁力分離，相比液相分離具有下游高通量和自動(dòng)化應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)，本論文通過(guò)綜述核酸結(jié)合材料的開(kāi)發(fā)、結(jié)合機(jī)制、核酸固相分離以及固相分離在病原PCR診斷應(yīng)用方面的進(jìn)展，借以論述核酸固相分離現(xiàn)有的應(yīng)用局限性和發(fā)展前景。

由上所述，我們不難看出，磁力分離作為高通量核酸提取極具優(yōu)勢(shì)，但仍普遍受限于耗時(shí)的樣本裂解過(guò)程，尤其是動(dòng)植物組織樣本難以避免的研磨等繁瑣預(yù)處理，限制了整體核酸提取過(guò)程的全過(guò)程通量及提取時(shí)效性。同時(shí)，報(bào)道指出：磁力分離中納米顆粒解吸核酸困難、DNA提取效率普遍偏低，通過(guò)將磁性納米粒子與DNA的復(fù)合物直接作為PCR模板可以避免這個(gè)問(wèn)題[91]。但磁性顆粒對(duì)PCR擴(kuò)增過(guò)程具有強(qiáng)抑制作用，洗脫過(guò)程不可避免[92]。此外，磁性納米顆粒固有的團(tuán)聚[57]、沉降[93]等現(xiàn)象，在平行處理批量樣本時(shí)，很大程度上會(huì)影響分離過(guò)程的穩(wěn)定性。磁力分離中，因?yàn)榧{米顆粒沉降現(xiàn)象，核酸與磁性納米顆粒不能充分結(jié)合而影響提取產(chǎn)率；納米顆粒團(tuán)聚則可能會(huì)引起清洗不完全與雜質(zhì)包裹等問(wèn)題，影響磁力分離的提取質(zhì)量，而這些過(guò)程與磁性納米顆粒的尺寸、磁化強(qiáng)度及與核酸分子間的作用力強(qiáng)弱等動(dòng)力學(xué)因素息息相關(guān)。因此，磁力分離可能的幾個(gè)發(fā)展方向是：1)開(kāi)展高效生物樣本裂解過(guò)程研究，系統(tǒng)揭示裂解動(dòng)力學(xué)過(guò)程，建立高效、快速、常溫裂解過(guò)程，提高核酸釋放量并降低多樣本平行處理時(shí)的氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)，為后續(xù)高效、高質(zhì)量磁力分離過(guò)程提供保障；2)研發(fā)新型、高效的磁性顆粒材料，并揭示核酸“吸附-脫附”動(dòng)力學(xué)過(guò)程，不斷優(yōu)化磁力分離過(guò)程，提高分離效率和質(zhì)量，是下游病原PCR診斷靈敏度與準(zhǔn)確性的重要保障。

非磁力核酸固相分離，除了同樣需要解決樣本裂解步驟的局限性，同時(shí)還需要攻克核酸分離、純化過(guò)程中對(duì)離心、過(guò)濾和移液等的依賴。纖維素紙條30 s快速分離核酸的報(bào)道[39]，讓我們看到了非磁力固相分離巨大的發(fā)展前景：通過(guò)手動(dòng)或自動(dòng)化設(shè)備，利用機(jī)械力將核酸固相結(jié)合材料快速、直接地從復(fù)雜裂解液體系中轉(zhuǎn)移出來(lái)，能獲得比磁力分離更快、更穩(wěn)定的分離過(guò)程，也避免了顆粒狀的磁性納米顆粒聚集、沉降帶來(lái)的高通量分離過(guò)程不穩(wěn)定的局限。