朱代文，范鈺，巫麗娟，王雨姍，林濤 （.四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科/泌尿外科研究所，國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，器官移植中心，四川 成都 6004；.四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川 成都 6004）

器官移植是治療器官功能衰竭患者的有效外科手段，賢移植由于其開(kāi)展最早、發(fā)展最快、技術(shù)和管理最成熟，目前已經(jīng)成為終末期賢臟疾?。╡nd stage renal disease， ESRD）的最優(yōu)治療方法［1-3］。當(dāng)受者出現(xiàn)移植賢功能不全時(shí)，為明確病因，常需要進(jìn)行移植賢穿刺活檢（診斷的金標(biāo)準(zhǔn)）［4-5］。然而移植賢穿刺活檢有一定的創(chuàng)傷性和出血風(fēng)險(xiǎn)，且病理結(jié)果報(bào)告延時(shí)性較長(zhǎng)（常為1 周），為臨床早診斷早治療帶來(lái)較大的困難。

移植物在發(fā)生損傷時(shí)，其供者來(lái)源細(xì)胞游離DNA（donor-derived cell-free DNA，dd-cfDNA）會(huì)游離釋放到血液或尿液中。由于dd-cfDNA 序列與移植受者自身的DNA 序列存在差異，通過(guò)檢測(cè)體液中dd-cfDNA 的含量，可以反映出移植物受損傷的情況［6］。目前在國(guó)際上已有多項(xiàng)研究采用dd-cfDNA 來(lái)檢測(cè)移植賢的健康狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)dd-cfDNA 在排斥反應(yīng)的診斷中表現(xiàn)出優(yōu)秀的診斷效能，特別是在診斷抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)方面，其敏感度、特異度和受試者工作特征曲線下面積分別達(dá)到了0.84，0.80 和0.89［7］。對(duì)dd-cfDNA的檢測(cè)主要有兩種方法：隨機(jī)測(cè)序法或靶向供受者cfDNA 差異法［8］，目前多采用靶向供受者cfDNA 差異法，涉及到采用第二代測(cè)序技術(shù)（nextgeneration sequencing，NGS）或微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）。NGS 準(zhǔn)確度非常高，但檢測(cè)費(fèi)用也非常昂貴,而ddPCR 不僅準(zhǔn)確度有保證，而且可以提供dd-cfDNA 的絕對(duì)定量?，F(xiàn)在已經(jīng)有商品化的依賴于NGS 平臺(tái)或ddPCR 平臺(tái)的dd-cfDNA 檢測(cè)試劑盒［9］，但因其費(fèi)用昂貴（約4000 ～8000 元/樣），而且所檢測(cè)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)是依據(jù)國(guó)外人群來(lái)制定的，從而限制了國(guó)內(nèi)臨床的廣泛運(yùn)用。

我們前期通過(guò)整合目前國(guó)內(nèi)外dd-cfDNA 的檢測(cè)方法，根據(jù)中國(guó)人群SNP 位點(diǎn)特色，優(yōu)化選擇了8 個(gè)SNP 位點(diǎn)形成了一種高性價(jià)比的dd-cfDNA的檢測(cè)方法（約1200 元/樣）。本研究擬通過(guò)初步臨床試驗(yàn)，明確該方法的臨床實(shí)用性。

1 資料與方法

1.1 dd-cfDNA 檢測(cè)材料：經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究從四川大學(xué)華西醫(yī)院標(biāo)本庫(kù)無(wú)差別獲取同種異體賢移植術(shù)受者的血樣，包括有圍術(shù)期賢移植受者的血樣和明確診斷為活動(dòng)性抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)（active antibody mediated rejection，ABMR）受者的血樣。血樣質(zhì)控合格樣本納入研究進(jìn)行dd-cfDNA 含量測(cè)定。本研究獲四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，倫理批號(hào)為2020-063。測(cè)定用的主要耗材有：優(yōu)化選擇的8 個(gè)SNP 位點(diǎn)形成的dd-cfDNA 檢測(cè)試劑盒（Panel HX-8），細(xì)胞游離DNA 保存管 （KJ1002DNA，江蘇康健公司），cfDNA 提取試劑（RC1101，廈門(mén)愷碩公司）。

1.2 dd-cfDNA 檢測(cè)方法：受者血樣經(jīng)1600×g 離心10 min 后取血漿，再在低溫高速離心機(jī)（Heraeus 75004250，美國(guó)賽默飛公司）中以16 000×g 離心10 min 后取血漿進(jìn)行cfDNA 提取。后在ddPCR 檢驗(yàn)平臺(tái)（D040101，D050101，D010103，杭州領(lǐng)航公司）上用Panel HX-8 對(duì)dd-cfDNA 進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出dd-cfDNA 含量百分比（%）。

1.3 臨床資料收集和分析：回顧性收集納入研究血樣所對(duì)應(yīng)受者的臨床資料。其中圍術(shù)期受者，根據(jù)其術(shù)后血清肌酐 （serum creatinine，Scr）下降情況，分為4 組（具體分組標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1）：移植物功能迅速恢復(fù)組（immediate graft function，IGF）、移植物功能緩慢恢復(fù)組（slow graft function，SGF）、移植物功能延遲恢復(fù)組（delayed graft function，DGF 組）和Scr 反彈組（creatinine elevation，CE 組）。

表1 圍術(shù)期受者分組方法

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較使用t 檢驗(yàn)，同組間前后比較使用配對(duì)t 檢驗(yàn)。P ＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本研究共獲取合格血樣共330 份，來(lái)自于2020 年3 月至2021 年5 月于四川大學(xué)華西醫(yī)院就醫(yī)的84 例同種異體賢移植圍術(shù)期的受者和3 例經(jīng)移植賢穿刺活檢確診為ABMR 的受者。84 例圍術(shù)期受者中，有61 例受者供賢是來(lái)源于腦死亡后捐獻(xiàn)（donation after brain death，DBD）供者，23 例供賢來(lái)源于活體捐獻(xiàn)（living donation，LD）供者。

圍術(shù)期受者中，IGF 組73 例，SGF 組4 例，DGF 組2 例，CE 組5 例。 受者平均年齡為（31.7±11.3）歲，女性占比28.6%（24/60），一般情況見(jiàn)表2，Scr 和dd-cfDNA 的變化見(jiàn)表3。其中，IGF 組受者術(shù)后1 d（postoperative day 1，POD1）、POD3、POD5、POD7 和POD12 的平均Scr 分別為：（448.0±200.2） μmol/L、（161.5±70.8 ）μmol/L、（126.4±44.3） μmol/L、（116.2±33.7） μmol/L 和（115.4±38.2） μmol/L， 成指數(shù)型下降，Scr 在POD7 達(dá)到谷平臺(tái)值（圖1A）；相一致的，IGF 組POD1、POD3、POD5 和POD7 的dd-cfDNA 也呈指數(shù)型下降：4.0%±3.3%、1.4%±2.3%、0.8%±1.5%和0.9%±1.5%，dd-cfDNA 在POD5 達(dá)到谷平臺(tái)值（圖1B）。SGF 組POD1 的dd-cfDNA 顯著高于IGF 組（28.5%±38.8%比4.0%±3.3%，P ＝0.003）（圖1B），DGF 組POD1 的dd-cfDNA 在數(shù)值上也較IGF 組高 （9.9%±1.8%比4.0%±3.3%，P ＝0.083）（圖1B）。雖然POD3、POD5 和POD7 的dd-cfDNA各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），但DGF組POD3 的平均dd-cfDNA 在數(shù)值上大于IGF 組（3.7%±1.1%比1.4%±2.3%，P ＝0.064）（圖1B）。在CE 組中，POD12 的Scr 在數(shù)值上大于POD7（150.8±25.9 μmol/L 比118.6±22.0 μmol/L，P ＝0.171）（圖1A），POD7 的dd-cfDNA 在數(shù)值上大于POD5 （5.4%±9.6% 比1.4%±0.9%，P ＝0.064）（圖1B）。

表2 圍術(shù)期受者的基線特征

表3 受者Scr 與dd-cfDNA（±s）

表3 受者Scr 與dd-cfDNA（±s）

注：Scr IGF 為IGF 組的Scr；dd-cfDNA IGF：IGF 組的dd-cfDNA。

類別POD1POD3POD5POD7POD12治療前治療后Scr IGF（μmol/L）448.0 ± 200.2161.5 ± 71.8126.4 ± 44.3116.2 ± 37.7115.4 ± 38.2 Scr SGF（μmol/L）894.6 ± 246.3 699.0 ± 108.9 629.0 ± 108.0486.3 ± 46.3334.0 ± 255.0 Scr DGF（μmol/L）974.0 ± 347.9705.0 ± 50.9680.0 ± 75.0527.5 ± 153.4330.5 ± 89.8 Scr CE（μmol/L）413.6 ± 224.5145.0 ± 43.5121.6 ± 27.5118.6 ± 22.0150.8 ± 25.9 Scr ABMR（μmol/L）127.3 ± 3.1110.0 ± 7.5 dd-cfDNA IGF（%）4.0 ± 3.31.4 ± 2.30.8 ± 1.50.7 ± 0.6 dd-cfDNA SGF（%）28.5 ± 38.82.7 ± 4.70.5 ± 0.40.5 ± 0.3 dd-cfDNA DGF（%）9.9 ± 1.83.7 ± 1.11.3 ± 0.80.4 ± 0.1 dd-cfDNA CE（%）6.2 ± 8.24.4 ± 6.91.4 ± 0.95.4 ± 9.6 dd-cfDNA ABMR（%）4.2 ± 2.00.6 ± 0.1

3 例ABMR 受者均采用激素沖擊、血漿置換和靜注人丙種球蛋白治療。在接受治療前的Scr 分別為130 μmol/L、128 μmol/L 和124 μmol/L（圖1C），dd-cfDNA 分別為2.1%、4.4%和6%；治療后的Scr 分別為111 μmol/L、117 μmol/L 和102 μmol/L，dd-cfDNA 分別為0.7%、0.7% 和0.5%（圖1C）。

圖1 IGF、SGF、DGF、CE、ABMR 組的Scr 和dd-cfDNA

3 討 論

移植器官在圍術(shù)期間容易受到免疫損傷、缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）、藥物毒性和手術(shù)并發(fā)癥相關(guān)的許多急性損傷［13-16］，在術(shù)后至長(zhǎng)期隨訪過(guò)程中也面臨著排斥反應(yīng)、原發(fā)病復(fù)發(fā)、感染等損傷可能［17-18］。因此如何及時(shí)、準(zhǔn)確地判斷移植物的狀態(tài)，根據(jù)損傷病因選擇有效的治療是保證移植物長(zhǎng)期存活的關(guān)鍵因素。雖然臨床上采用Scr 來(lái)反映賢臟功能，但Scr 的變化并不能特異性地反映出移植物損傷的情況。當(dāng)Scr 出現(xiàn)上漲有可能只是一個(gè)短暫的過(guò)程，例如鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑濃度過(guò)高導(dǎo)致的移植賢血流動(dòng)力學(xué)改變，或者賢前性血容量不足［19］。而且損傷導(dǎo)致Scr 升高時(shí)，移植賢往往已經(jīng)發(fā)生了較嚴(yán)重的損傷［20］。組織病理學(xué)檢查是判斷移植物損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，有許多移植中心采用程序性活檢的方式來(lái)定期監(jiān)測(cè)移植物狀態(tài)［21-22］。但穿刺活檢需受者住院行有創(chuàng)的穿刺操作，整體費(fèi)用較高，且據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道移植賢穿刺活檢的并發(fā)癥發(fā)生率為2.9%～5.8%［23］，限制了其臨床廣泛應(yīng)用。由于這些不足，研究者一直在尋找更為特異的無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)記物來(lái)監(jiān)測(cè)移植物的健康狀況，dd-cfDNA 的檢測(cè)就是其中一個(gè)迅速興起的領(lǐng)域。

雖然dd-cfDNA 最初是被當(dāng)作一種排斥反應(yīng)的無(wú)創(chuàng)標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行研究，但很快就發(fā)現(xiàn)dd-cfDNA實(shí)質(zhì)上是一種反映移植物損傷的標(biāo)記物，而導(dǎo)致?lián)p傷最常見(jiàn)原因是排斥反應(yīng)［24］。據(jù)目前文獻(xiàn)所報(bào)道的數(shù)據(jù)表明，dd-cfDNA 在檢測(cè)排斥反應(yīng)方面具有優(yōu)秀的整體診斷性能，用dd-cfDNA 百分比來(lái)診斷排斥反應(yīng)的靈敏度為80%，特異度為76%，ROC 曲線下面積為0.81［25-26］。值得一提的是，dd-cfDNA 百分比的陰性預(yù)測(cè)值達(dá)到了90%，這提示在臨床應(yīng)用中，如果dd-cfDNA 在低于界定值時(shí)（通常為1%）可以考慮排除移植物發(fā)生損傷，例如ABMR［27］。在本研究中，ABMR 受者在治療前平均dd-cfDNA 為4.2%，經(jīng)過(guò)治療后平均dd-cfDNA下降到了0.6%。dd-cfDNA 的下降，反映了針對(duì)ABMR 進(jìn)行治療明顯緩解了移植賢的損傷。另外，本研究中也發(fā)現(xiàn)IGF 組受者的dd-cfDNA 從POD1的4.0%快速下降到POD5 的0.8%，比Scr 更快達(dá)到谷平臺(tái)值，dd-cfDNA 的下降情況可能比Scr 的下降情況更敏感地反映出移植賢的快速康復(fù)。相對(duì)應(yīng)的，CE 組的平均Scr 從POD7 的118.6 μmol/L 上漲到了POD12 的150.8 μmol/L，而平均dd-cfDNA則是更早的從POD5 的1.4%上漲到了POD7 的5.4%，也提示dd-cfDNA 比Scr 更加靈敏。在圍術(shù)期，1 例CE 組的受者行移植賢穿刺活檢，診斷為急性臨界性T 細(xì)胞介導(dǎo)排斥反應(yīng)；其余4 例受者均未行移植賢穿刺活檢。

DBD 供賢較LD 供賢會(huì)經(jīng)歷更長(zhǎng)時(shí)間的冷/熱缺血時(shí)間，所受到的IRI 程度更重［28］，因此受損的組織細(xì)胞量更多，術(shù)后早期dd-cfDNA 的釋放量更大。本研究中SGF 組的DBD 供賢占75%，DGF組的供賢全部是來(lái)源于DBD 供者。這可能是導(dǎo)致SGF 組和DGF 兩組POD1 的dd-cfDNA 都要高于IGF 組的一個(gè)重要因素。而只要移植賢沒(méi)有繼續(xù)受到損傷，隨著時(shí)間推移，受損組織細(xì)胞吸收并修復(fù)，dd-cfDNA 會(huì)迅速下降。Gielis 等［29］發(fā)現(xiàn)術(shù)后恢復(fù)良好的賢移植受者，其dd-cfDNA 會(huì)快速下降，可以從POD1 的2.6%～41.9%迅速降至術(shù)后第10 天的0.46%。本研究中SGF 組和DGF 組ddcfDNA 均快速下降：IGF 組和SGF 組的dd-cfDNA在POD5 下降到了1%以內(nèi)，DGF 組的dd-cfDNA在POD7 下降到了1%以內(nèi)。

近年來(lái)，針對(duì)dd-cfDNA 的臨床研究數(shù)量增長(zhǎng)極快，但由于市面上dd-cfDNA 的檢測(cè)成本較高，限制了dd-cfDNA 在臨床上的廣泛應(yīng)用。Puttarajappa 等人［30］提出，對(duì)于一個(gè)低免疫學(xué)風(fēng)險(xiǎn)的賢移植受者，假設(shè)其發(fā)生亞臨床T 細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)為12%，ABMR 風(fēng)險(xiǎn)為3%，那么在移植后12 個(gè)月進(jìn)行一次程序性活檢可能比用無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)記物進(jìn)行篩查更具有成本效益。限制dd-cfDNA 成為一種具備實(shí)用性的連續(xù)監(jiān)測(cè)生物標(biāo)記物的原因更多在于其檢測(cè)成本。雖然本研究有著樣本量較少、為非前瞻性隨機(jī)對(duì)照研究、圍術(shù)期受者均未行病理檢查、沒(méi)有與商業(yè)化dd-cfDNA 檢測(cè)進(jìn)行性價(jià)對(duì)比等不足之處。但本研究通過(guò)優(yōu)化SNP 位點(diǎn)的選擇，減少了dd-cfDNA 的檢測(cè)成本，并初步驗(yàn)證了該dd-cfDNA 檢測(cè)方法的臨床實(shí)用價(jià)值，為隨后將該方法臨床轉(zhuǎn)化，探索其在臨床連續(xù)dd-cfDNA 監(jiān)測(cè)和廣泛應(yīng)用中的價(jià)值打下了基礎(chǔ)。