李偉霞 王曉艷 賈文匯 張明亮 唐進(jìn)法 李學(xué)林

摘 要 目的：研究腦心通膠囊主要藥效成分對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）JAK/STAT信號(hào)通路、血管活性物質(zhì)、黏附分子、炎癥因子的影響，以期闡明腦心通膠囊活血化瘀的作用機(jī)制。方法：采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度的12個(gè)腦心通膠囊藥效成分[咖啡酸（1.56～200 μmol/L）、阿魏酸（1.56～200 μg/mL）、洋川芎內(nèi)酯H（3.125～200 μmol/L）、丁烯基苯酞（3.125～200 μmol/L）、藁本內(nèi)酯（1.56～200 μmol/L）、隱丹參酮（0.625～80 μmol/L）、丹參素鈉（1.56～200 μmol/L）、芍藥苷（1.56～200 μmol/L）、芒柄花素（1.56～200 μmol/L）、丹酚酸B（1.56～200 μmol/L）、兒茶素（1.56～200 μmol/L）、黃芪甲苷（1.56～200 μmol/L）]作用24 h后對(duì)HUVEC增殖的影響;采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)上述各藥效成分（均分別設(shè)置3個(gè)劑量組，并設(shè)0 μmol/L的空白對(duì)照組，下同）對(duì)HUVEC的JAK/STAT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Janus激酶（JAK2）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子（STAT3）、蛋白激酶B（Akt）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）mRNA表達(dá)的影響;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)各藥效成分對(duì)HUVEC的纖溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、核因子κB p65（NF-κB p65）表達(dá)的影響。結(jié)果：阿魏酸（6.25、25～200 μg/mL）、洋川芎內(nèi)酯H（6.25～200 μmol/L）、藁本內(nèi)酯（200 μmol/L）、隱丹參酮（10～80 μmol/L）、芍藥苷（1.56、6.25、12.5 μmol/L）、丹酚酸B（1.56～12.5、200 μmol/L）和兒茶素（25 μmol/L）可顯著抑制HUVEC增殖，咖啡酸（1.56、12.5 μmol/L）、藁本內(nèi)酯（50 μmol/L）、丹參素鈉（6.25 μmol/L）、芒柄花素（1.56、100、200 μmol/L）可顯著促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖（P<0.05或P<0.01）。與空白對(duì)照組比較，阿魏酸、芒柄花素、丹酚酸B和黃芪甲苷部分劑量組細(xì)胞中JAK2、STAT3和Akt的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;咖啡酸、阿魏酸和丁烯基苯酞部分劑量組細(xì)胞中PAI-1表達(dá)水平顯著降低，咖啡酸、阿魏酸、丁烯基苯酞、隱丹參酮、芒柄花素和兒茶素部分劑量組細(xì)胞中ICAM-1和VCAM-1表達(dá)水平顯著降低，阿魏酸、丁烯基苯酞、芒柄花素、丹酚酸B和黃芪甲苷部分劑量組細(xì)胞中NF-κB p65表達(dá)水平顯著降低，咖啡酸和兒茶素部分劑量組細(xì)胞中VEGF表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：腦心通膠囊中藥效成分可能通過抑制HUVEC中JAK/STAT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白mRNA和PAI-1、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB p65的表達(dá)，并促進(jìn)VEGF表達(dá)，從而發(fā)揮其活血化瘀的功效。

關(guān)鍵詞 腦心通膠囊;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;血管活性物質(zhì);黏附分子;炎癥因子;藥效成分;JAK/STAT信號(hào)通路;作用機(jī)制

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）03-0301-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.03.09

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of the main active components of Naoxintong capsule （NXTC） on the JAK/STAT signal pathway of human umbilical vein endothelial cell （HUVEC） vasoactive substances， adhesion molecules and inflammatory factors so as to clarify the mechanism of NXTC for promoting blood circulation and removing blood stasis. METHODS： The effects of different concentration of 12 active components [caffeic acid （1.56-200 μmol/L）， ferulic acid （1.56-200 μmol/L）， senkyunolide H （3.125-200 μmol/L）， n-butylidenephthalide （3.125-200 μmol/L）， ligustilide （1.56-200 μmol/L）， cryptotanshinone （0.625-80 μmol/L）， tanshinol sodium （1.56-200 μmol/L）， paeoniflorin （1.56-200 μmol/L）， formononetin （1.56-200 μmol/L）， salvianolic acid B （1.56-200 μmol/L）， catechin （1.56-200 μmol/L） and astragaloside Ⅳ （1.56-200 μmol/L）] on the proliferation of HUVECs were evaluated by CCK-8 assay. The effects of above active components （3 dose groups， setting up 0 μmol/L blank control group， hereinafter） on mRNA expression of key proteins JAK2， STAT3， Akt， ERK in JAK/STAT signal pathway were measured by RT-PCR. The effects of each active component on the expression of PAI-1， VCAM-1， ICAM-1， VEGF and NF-κB p65 were detected by ELISA. RESULTS： Ferulic acid （6.25，25-200? μg/mL）， senkyunolide H （6.25-200 μmol/L）， ligustilide （200 μmol/L）， cryptotanshinone （10-80 μmol/L）， paeoniflorin （1.56， 6.25， 12.5 μmol/L）， salvianolic acid B （1.56-12.5 μmol/L， 200 μmol/L） and catechin （25 μmol/L） could significantly inhibit the proliferation of HUVECs; caffeic acid （1.56， 12.5 μmol/L）， ligustilide （50 μmol/L）， trashinol sodium （6.25 μmol/L） and paeoniflorin （1.56， 100， 200 μmol/L） could significantly promote the proliferation of HUVECs? （P<0.05 or P<0.01）. Compared with blank control group， mRNA expression of JAK2， STAT3 and Akt were decreased significantly in some dose groups of ferulic acid， formononetin， salvianolic acid B and astragaloside Ⅳ （P<0.05 or P<0.01）; the expression of PAI-1 were significantly decreased in some dose groups of caffeic acid， ferulic acid and n-butylphthalide; the expression of ICAM-1 and VCAM-1 were decreased significantly in some dose groups of caffeic acid， ferulic acid， n-butenylphthalide， cryptotanshinone， formononetin and catechin; the expression of? NF-κB p65 were decreased significantly in some dose groups of ferulic acid， n-butenylphthalide， formononetin， salvianolic acid B and astragaloside Ⅳ; the expression of VEGF were increased significantly in some dose groups of caffeic acid and catechin （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The active components of Naoxintong capsule may play the role of promoting blood circulation and removing blood stasis by inhibiting the expression of JAK/STAT signal pathway key protein mRNA and PAI-1， ICAM-1， VCAM-1， NF-κB p65 in HUVEC， and promoting the expression of VEGF.

KEYWORDS? ?Naoxintong capsule; Human umbilical vein endothelial cells; Vasoactive substances; Adhesion molecule; Inflammation factors; Active component; JAK/STAT signal pathway; Mechanism

腦心通膠囊組方是在《醫(yī)林改錯(cuò)·卷下·癱痿論》中補(bǔ)陽還五湯的基礎(chǔ)上加味蟲類藥、活血化瘀藥共16味中藥而成，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)的功效[1-2]。相關(guān)研究報(bào)道，腦心通膠囊主要通過抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎性反應(yīng)、抗血小板聚集、改善血管內(nèi)皮功能和抗心肌缺血再灌注損傷等藥理作用發(fā)揮治療心腦血管疾病的作用[1-4]。

Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）信號(hào)通路是目前心腦血管疾病分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[5]，其通路相關(guān)蛋白JAK2、STAT3、蛋白激酶B（Akt）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）與活血化瘀和血管新生的作用關(guān)系密切，并參與血管內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)[6]。纖溶酶原激活系統(tǒng)是體內(nèi)防止血栓形成的重要機(jī)制，纖溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的活性物質(zhì)，在機(jī)體內(nèi)含量越高，形成血栓的可能性也就越高[7];血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）可通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化、管腔形成等，促進(jìn)血管生成[8];內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子主要有血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）和細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1），在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)與活化、凝血和血栓形成、組織損傷修復(fù)等生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，當(dāng)機(jī)體內(nèi)黏附分子含量升高，容易形成血栓[9-10];炎癥是心腦血管疾病的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，核因子κB（NF-κB）與多種關(guān)鍵炎癥因子如細(xì)胞因子類[腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）]、黏附分子類（VCAM-1、ICAM-1）等的表達(dá)有關(guān)[11-12]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸類（如咖啡酸、阿魏酸、丹參素鈉、丹酚酸B）、苯酞內(nèi)酯類（如洋川芎內(nèi)酯H、丁烯基苯酞、藁本內(nèi)酯）、黃酮類（如隱丹參酮、芒柄花素、兒茶素）和皂苷類（如芍藥苷、黃芪甲苷）等是腦心通膠囊的主要藥效成分[13-15]。而上述藥效成分如何通過調(diào)節(jié)JAK/STAT信號(hào)通路、血管活性物質(zhì)、黏附分子和炎癥因子發(fā)揮治療腦血管疾病藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為載體，通過考察腦心通膠囊各藥效成分對(duì)其JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白（JAK2、STAT3、Akt、ERK）mRNA、血管活性物質(zhì)（PAI-1、VEGF）、黏附分子（VCAM-1、ICAM-1）及炎癥因子（NF-κB p65）等相關(guān)指標(biāo)的影響，研究該藥活血化瘀作用的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：Light Cycler 96型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（瑞士Roche公司），VeritiTM 96-Well Thermal Cycler型梯度PCR儀（美國(guó)ABI公司），NanoDrop One型超微量分光光度計(jì)、3111型CO2恒溫培養(yǎng)箱、Multiskan FC型酶標(biāo)儀、Megafuge 8型離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），AE31型倒置相差顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），S11型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯H、丁烯基苯酞、藁本內(nèi)酯對(duì)照品（南京良緯生物科技有限公司，批號(hào)分別為lw16081501、lw170112004、lw18010302、lw16042702、lw18010501，純度均不低于98%），隱丹參酮、丹參素鈉、芍藥苷、芒柄花素、丹酚酸B、兒茶素、黃芪甲苷對(duì)照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)分別為CHB190305、CHB180108、CHB190124、CHB180130、CHB180108、CHB180809、CHB190107，純度均不低于98%），磷酸鹽緩沖液（PBS，博斯特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)PYGOO21），二甲基亞砜（DMSO）、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為1213C0330、20190320），胎牛血清、胰酶、DMEM高糖完全培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)分別為? ? ?NYMI1035、J170003、AL209346），CCK-8試劑[東仁化學(xué)科技（上海）有限公司，批號(hào)NG703]，PAI-1、ICAM-1、VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司，批號(hào)分別為0711E19、0711E19、0711E19），NF-κB p65、VCAM-1 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為W5Z6C3RW4T、1BRVZE5H94），RNA快速提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司，批號(hào)分別為20190901、20190901、20190901），PCR引物（華大基因公司設(shè)計(jì)合成，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1）。

1.3 細(xì)胞

HUVEC由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HUVEC復(fù)蘇后，接種到含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“培養(yǎng)基”），于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每隔2 d進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 腦心通膠囊各藥效成分對(duì)細(xì)胞增殖的影響

采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。將HUVEC按3 000個(gè)/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，備用。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（溶劑為含或不含0.1%DMSO的培養(yǎng)基）和腦心通膠囊藥效成分不同濃度組[每個(gè)藥效成分均設(shè)置8個(gè)終濃度（各濃度設(shè)置參考預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，詳見表2），按相應(yīng)對(duì)照品溶解性采用含或不含0.1%DMSO的培養(yǎng)基配成]。空白對(duì)照組加入含或不含0.1% DMSO的培養(yǎng)基200 μL，腦心通膠囊藥效成分不同濃度組加入相應(yīng)藥液200 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基后，每孔加入CCK-8溶液60 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率=OD藥效成分組/OD空白對(duì)照×100%）。

2.3 腦心通膠囊各藥效成分對(duì)細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響考察

采用RT-PCR法進(jìn)行測(cè)定。將HUVEC按1×105個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，備用。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組和腦心通膠囊藥效成分不同濃度組（各藥效成分終濃度根據(jù)“2.2”項(xiàng)下篩選結(jié)果制定，按相應(yīng)對(duì)照品溶解性采用含或不含0.1% DMSO的培養(yǎng)基配成相應(yīng)藥液）?？瞻讓?duì)照組加入含或不含0.1% DMSO的培養(yǎng)基4 mL，腦心通膠囊藥效成分不同濃度組加入含相應(yīng)藥液4 mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞并提取總RNA后，取適量逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：PCR擴(kuò)增緩沖液10 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.04 μL和適量雙蒸水。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法[16]分析JAK2、STAT3、Akt、ERK mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 腦心通膠囊各藥效成分對(duì)血管活性物質(zhì)、黏附分子及炎性因子表達(dá)的影響考察

采用ELISA法進(jìn)行測(cè)定。將HUVEC按3 000個(gè)/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，備用。將細(xì)胞按“2.3”項(xiàng)下方法分組并培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞上清液，然后按照相應(yīng)試劑盒的說明書方法操作，檢測(cè)PAI-1、ICAM-1、VEGF、VCAM-1和NF-κB p65的表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞存活率的測(cè)定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，阿魏酸6.25、25、50、100、200? ? μg/mL組，洋川芎內(nèi)酯H 6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L組，藁本內(nèi)酯200 μmol/L組，隱丹參酮10、20、40、80 μmol/L，芍藥苷1.56、6.25、12.5 μmol/L組，丹酚酸B 1.56、3.125、6.25、12.5、200 μmol/L組，兒茶素25 μmol/L組細(xì)胞存活率均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;咖啡酸1.56、12.5 μmol/L組，藁本內(nèi)酯50 μmol/L組，丹參素鈉6.25 μmol/L和芒柄花素1.56、100、200 μmol/L組細(xì)胞存活率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果見表3?；诖?，選擇腦心通膠囊各藥效成分對(duì)HUVEC增殖無明顯抑制作用的3個(gè)濃度（低、中、高）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，即咖啡酸25、50、100 μmol/L，阿魏酸0.025、0.25、2.5 μg/mL，洋川芎內(nèi)酯H 1.25、2.5、5 μmol/L，丁烯基苯酞0.01、0.1、1 μmol/L，藁本內(nèi)酯0.025、0.25、2.5 μmol/L，隱丹參酮0.3、1、3 μmol/L，丹參素鈉5、10、20 μmol/L，芍藥苷25、50、100 μmol/L，芒柄花素2.5、5、25 μmol/L，丹酚酸B 25、50、100 μmol/L，兒茶素5、50、100 μmol/L，黃芪甲苷2.5、5、25 μmol/L。

3.2 腦心通膠囊各藥效成分對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，咖啡酸50 μmol/L組細(xì)胞中STAT3，阿魏酸0.025 μg/mL組細(xì)胞中JAK2，洋川芎內(nèi)酯H 2.5 μmol/L組細(xì)胞中JAK2及5 μmol/L組Akt，丁烯基苯酞1 μmol/L組細(xì)胞中Akt及0.1 μmol/L組ERK，藁本內(nèi)酯0.025 μmol/L組細(xì)胞中JAK2，芒柄花素2.5 μmol/L組細(xì)胞中ERK，丹酚酸B 100 μmol/L組細(xì)胞中STAT3的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）;阿魏酸2.5? ? ?μg/mL組細(xì)胞中STAT3、Akt、ERK，芒柄花素25 μmol/L組細(xì)胞中JAK2，丹酚酸B 50? μmol/L組細(xì)胞中JAK2、STAT3，黃芪甲苷2.5 μmol/L組細(xì)胞中Akt 的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果見表4（注：表中0 μg/mL均表示空白對(duì)照）。

3.3 腦心通膠囊各藥效成分對(duì)細(xì)胞中PAI-1、ICAM-1、VCAM-1、VEGF和NF-κB p65表達(dá)水平的影響

與空白對(duì)照組比較，咖啡酸100 ?mol/L組細(xì)胞中PAI-1和50、100 ?mol/L組ICAM-1以及25、50、100 ?mol/L組VCAM-1，阿魏酸2.5 ?g/mL組細(xì)胞中PAI-1和0.025、0.25、2.5 ?g/mL組ICAM-1、NF-κB p65，洋川芎內(nèi)酯H 1.25、2.5 ?mol/L組細(xì)胞中VEGF，丁烯基苯酞1 ?mol/L組細(xì)胞中PAI-1和0.01、0.1、1 ?mol/L組ICAM-1、NF-κB p65以及0.1、1 ?mol/L組VEGF、VCAM-1，隱丹參酮3 ?mol/L組細(xì)胞中ICAM-1，芒柄花素25 ?mol/L組細(xì)胞中VCAM-1和5 ?mol/L組NF-κB p65，丹酚酸B 25、50、100 ?mol/L組細(xì)胞中NF-κB p65，兒茶素100 ?mol/L組細(xì)胞中VCAM-1，黃芪甲苷25 ?mol/L組細(xì)胞中NF-κB p65的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;咖啡酸25、50 ?mol/L組細(xì)胞中VEGF，阿魏酸0.025、0.25、2.5 ?g/mL組細(xì)胞中VCAM-1，洋川芎內(nèi)酯H 1.25、2.5、5 ?mol/L組細(xì)胞中ICAM-1、NF-κB p65和1.25 ?mol/L組VCAM-1，隱丹參酮3 ?mol/L組細(xì)胞中VCAM-1，丹參素鈉5 ?mol/L組細(xì)胞中PAI，芍藥苷25 ?mol/L組細(xì)胞中ICAM-1，兒茶素50 ?mol/L組細(xì)胞中PAI和5 ?mol/L組ICAM-1、VEGF，黃芪甲苷5 ?mol/L組細(xì)胞中VCAM- 1的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表5。

4 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持血管的正常功能以及血管新生有著重要作用，其中HUVEC因具有干細(xì)胞的潛能，故常用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[17]。JAK/STAT信號(hào)通路是參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路之一，其廣泛參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡及氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)過程，同時(shí)還介導(dǎo)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)及腫瘤生成等過程，該通路中的JAK2、STAT3、ERK和Akt蛋白失調(diào)可能導(dǎo)致多種疾病[18-19]。此通路涉及機(jī)制較多，隨之出現(xiàn)的細(xì)胞模型也越來越多，如高糖誘導(dǎo)HUVEC凋亡模型[20]、TNF-α誘導(dǎo)HUVEC損傷模型[21]、NaS2O4誘導(dǎo)HUVEC缺氧損傷模型[22]、氯化鈷誘導(dǎo)HUVEC缺氧損傷模型[23]、H2O2誘導(dǎo)HUVEC損傷模型[24]等，但各模型均僅針對(duì)心腦血管疾病機(jī)制中的一個(gè)具體機(jī)制，不能完全模擬其發(fā)病機(jī)制，且對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路影響不一，故本研究采用正常的HUVEC進(jìn)行試驗(yàn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，阿魏酸在常氧或缺氧狀態(tài)下均可促進(jìn)HUVEC的增殖和遷移，其對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能可能與ERK1/2信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)[25];黃芪甲苷促進(jìn)受損心肌組織血管新生及內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)[26]?；诖?，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦心通膠囊中阿魏酸（2.5 μg/mL）可顯著下調(diào)細(xì)胞中STAT3、Akt、ERK的mRNA表達(dá)，丹酚酸B（50 μmol/L）可顯著下調(diào)細(xì)胞中JAK2和STAT3的mRNA表達(dá)，芒柄花素（25 μmol/L）和黃芪甲苷（2.5? ? ? ? μmol/L）分別可顯著下調(diào)細(xì)胞中JAK2和Akt的mRNA表達(dá);而部分有效成分如咖啡酸（50 μmol/L）、阿魏酸（0.025 μg/mL）等可顯著升高STAT3和JAK2的mRNA表達(dá)。

纖溶酶原激活系統(tǒng)是體內(nèi)防止血栓形成的重要機(jī)制，而PAI-1是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的活性物質(zhì)，是纖溶酶原激活物的生理性抑制劑[7]。本研究結(jié)果顯示，腦心通膠囊中的咖啡酸（100 μmol/L）、阿魏酸（2.5 ?g/mL）和丁烯基苯酞（1 ?mol/L）均可顯著下調(diào)PAI-1的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[27]。VCAM-1可介導(dǎo)單核細(xì)胞的黏附作用，對(duì)腦梗死患者而言，脫落于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VCAM-1具有高可溶性，能夠促進(jìn)區(qū)域血小板聚集，加速血栓形成;ICAM主要分布于上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，其血清含量高表達(dá)提示內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞黏附作用的增強(qiáng)[28];且ICAM和VCAM的表達(dá)水平與冠心病的嚴(yán)重程度相關(guān)[29]。本研究結(jié)果顯示，咖啡酸（50、100 ?mol/L）、丁烯基苯酞（0.1、1 μmol/L）均可顯著下調(diào)ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，阿魏酸（0.025、0.25、2.5 μmol/L）、丁烯基苯酞（0.01? ? ? μmol/L）和隱丹參酮（3 μmol/L）均可顯著下調(diào)ICAM-1的表達(dá)，咖啡酸（25 ?mol/L）、芒柄花素（25 μmol/L）、兒茶素（100 μmol/L）均可顯著下調(diào)VCAM-1的表達(dá)。

NF-κB家族中活性較強(qiáng)的是p65和p50蛋白構(gòu)成的NF-κB異源二聚體，其在細(xì)胞內(nèi)含量最高[11]。本研究結(jié)果顯示，阿魏酸（0.025、0.25、2.5 ?g/mL）、丁烯基苯酞（0.01、0.1、1 ?mol/L）、芒柄花素（5 ?mol/L）、丹酚酸B（25、50、100 ?mol/L）、黃芪甲苷（25 ?mol/L）可顯著下調(diào)NF-κB p65的表達(dá)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，丹酚酸B可顯著降低缺氧造模后H9C2細(xì)胞中NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)水平[30];黃芪甲苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性血管內(nèi)皮損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號(hào)通路、降低炎癥反應(yīng)有關(guān)[31]，與本研究結(jié)果基本一致。

VEGF與心腦血管疾病組織損傷有密切關(guān)系，還可誘導(dǎo)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子再生、促進(jìn)鈣離子吸收、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等[10]。本研究結(jié)果顯示，咖啡酸（25、50 μmol/L）和兒茶素（5 μmol/L）均可顯著上調(diào)VEGF的表達(dá)，與文獻(xiàn)結(jié)果一致[32]。

值得注意的是，由于中藥成分具有多靶標(biāo)、多通路的作用特點(diǎn)，所以不同成分對(duì)同一通路或者同一指標(biāo)并不一定具有相同的調(diào)節(jié)趨勢(shì)，且劑量依賴性不強(qiáng)，而是整體發(fā)揮作用[33]。例如有文獻(xiàn)報(bào)道，黃芪甲苷Ⅳ可降低骨髓抑制模型小鼠血清中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）水平，而芒柄花素、阿魏酸可顯著升高血清中GM-CSF水平[34];4 ?mol/L丹酚酸B可顯著升高氧化應(yīng)激和高糖損傷的HUVEC中TNF-α水平，而20、100 ?mol/L丹酚酸B可顯著降低TNF-α水平[35]。此外，本文PCR結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，對(duì)Ct值未進(jìn)行均一化處理，因此本研究各空白對(duì)照組間的mRNA表達(dá)量具有差異，此現(xiàn)象在部分研究中也存在[36]。

綜上所述，腦心通膠囊中12個(gè)藥效成分可通過抑制JAK-STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白mRNA、黏附分子相關(guān)指標(biāo)或炎癥相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，從而促進(jìn)血管活性物質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮活血化瘀的作用?；诖?，本課題組后續(xù)將在HUVEC的缺糖缺氧/復(fù)氧模型上進(jìn)一步探索腦心通膠囊治療血管性疾病的作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 王階，趙濤，李軍，等.腦心通膠囊治療冠心病的臨床療效與作用機(jī)制[J].中醫(yī)雜志，2020，61（9）：814-817.

[ 2 ] 宋曉征，李成杰，吳雪英.腦心通膠囊對(duì)外周血組織炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)理[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2019，27（6）：1966-1972.

[ 3 ] XUE J，ZHANG XJ，ZHANG C，et al. Protective effect of Naoxintong against cerebral ischemia reperfusion injury in mice[J]. J Ethnopharmacol，2016. DOI：10.1016/j.jep. 2016.02.022.

[ 4 ] 劉振權(quán).腦心通膠囊治療缺血性中風(fēng)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2005.

[ 5 ] GROTE K，LUCHTEFELD M，SCHIEFFER B. JANUS under stress：role of JAK/STAT signaling pathway in vascular diseases[J]. Vascul Pharmacol，2005，43（5）：357- 363.

[ 6 ] BARTOLI M，PLATT D，LEMTALSI T，et al. VEGF differentially activates STAT3 in microvascular endothelial cells[J]. FASEB J，2003，17（11）：1562-1564.

[ 7 ] 李建會(huì)，裴俊文，蔣立峰.黃芪含藥血清對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制因子的影響[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，31（10）：1554-1555.

[ 8 ] CYBULSKY MI，IIYAMA K，LI H，et al. A major role for VCAM-1，but not ICAM-1，in early atherosclerosis[J]. J Clin Invest，2001，107（10）：1255-1262.

[ 9 ] NOWACKA M，OBUCHOWICZ E. BDNF and VEGF in the pathogenesis of stress-induced affective diseases：an insight from experimental studies[J]. Pharmacol Rep，2013，65（3）：535-546.

[10] DI BATTISTA AP，RHIND SG，HUTCHISON MG，et al. Inflammatory cytokine and chemokine profiles are asso- ciated with patient outcome and the hyperadrenergic state following acute brain injury[J]. J Neuroinflammation，2016. DOI：10.1186/s12974-016-0500-3.

[11] CHAMORRO ?，DIRNAGL U，URRA X，et al. Neuroprotection in acute stroke：targeting excitotoxicity，oxidative and nitrosative stress，and inflammation[J]. Lancet Neurol，2016，15（8）：869-881.

[12] LUTGENS E，ATZLER D，D?RING Y，et al. Immunotherapy for cardiovascular disease[J]. Eur Heart J，2019，40（48）：3937-3946.

[13] LI J，BAI Y，BAI Y，et al. Pharmacokinetics of caffeic? ? acid，ferulic acid，formononetin，cryptotanshinone，and tanshinone Ⅱ after oral administration of naoxintong capsule in rat by HPLC MS/MS[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2017. DOI：10.1155/2017/9057238.

[14] XU HY，SHI Y，ZHANG YQ，et al. Identification of key active constituents of Buchang Naoxintong capsules with therapeutic effects against ischemic stroke by using an integrative pharmacology-based approach[J]. Mol Biosyst，2016，12（1）：233-245.

[15] 王鐸，盛龍生，宋越，等. HPLC-MS法測(cè)定步長(zhǎng)腦心通中多種黃芪皂苷類成分[J].中國(guó)天然藥物，2006，4（4）：287-290.

[16] 孔瑕，劉嬌嬌，李慧，等.黃精多糖對(duì)高脂血癥小鼠脂代謝相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2018，43（18）：3740-3747.

[17] BOU?S D，HOSPERS GA，MEIJER C，et al. Endothelium in vitro：a review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research[J]. Angiogenesis，2001，4（2）：91-102.

[18] XIN P，XU X，DENG C，et al. The role of JAK/STAT signaling pathway and its inhibitors in diseases[J]. Int Immunopharmacol，2020. DOI：10.1016/j.intimp.2020.106210.

[19] VILLARINO AV，KANNO Y，F(xiàn)ERDINAND JR，et al. Mechanisms of JAK/STAT signaling in immunity and di- sease [J]. J Immunol，2015，194（1）：21-27.

[20] 王樹蓉. [Gly14]-humanin在高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2019.

[21] 秦明春，王若光，尤昭玲，等.黃芩苷對(duì)TNF-α誘導(dǎo)下人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的初步研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（8）：2016-2019.

[22] 趙汴霞，馬莉，宛蕾.人參皂苷Rd對(duì)Na2S2O4致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用[J].河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，24（5）：580-583、723.

[23] 吳昊，孫昊，王軍，等.川芎嗪對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株 （Eahy926）氯化鈷誘導(dǎo)缺氧后纖溶功能的影響[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，30（5）：641-645.

[24] 張繼江，劉影哲，周亞濱.黃芪含藥血清對(duì)H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型細(xì)胞活性的影響[J].中醫(yī)藥信息，2011，28（2）：19-21.

[25] LIN CM，CHIU JH，WU IH，et al. Ferulic acid augments angiogenesis via VEGF，PDGF and HIF-1α[J]. J Nutr Biochem，2010，21（7）：627-633.

[26] 李玉梅，楊辛欣，韓旭，等.川芎嗪與黃芪甲苷配伍對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的作用及機(jī)制探討[J].中草藥，2017，48（4）：722-727.

[27] 周英，李敏，孫黔云.綠原酸、咖啡酸和阿魏酸對(duì)補(bǔ)體旁路激活致內(nèi)皮細(xì)胞炎癥相關(guān)分子表達(dá)的干預(yù)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2016，32（12）：1723-1728.

[28] 孫燕輝.丹參川芎嗪注射液對(duì)急性腦梗死老年患者血清血管細(xì)胞間黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1、內(nèi)皮素-1和一氧化氮水平的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，25（19）：2088-2090.

[29] ZHAO JH，GUAN JL. Signal transduction by focal adhesion kinase in cancer[J]. Cancer Metastasis Rev，2009，28（1/2）：35-49.

[30] 李慶菊.丹酚酸B通過抑制NLRP3炎癥小體priming階段減輕缺氧誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2020，36（2）：210-215.

[31] 潘增烽，周園，阮巖，等.兒茶素抑制NF-κB-TSLP通路緩解過敏性哮喘小鼠炎癥反應(yīng)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2018，34（2）：207-212.

[32] 戰(zhàn)云，張英杰，冷彬.黃芪甲苷通過TLR4/NF-κB通路改善脂多糖誘導(dǎo)的急性血管內(nèi)皮損傷[J].中藥藥理與臨床，2018，34（3）：77-80.

[33] 王升啟.中藥作用分子機(jī)制研究新策略[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2019，33（9）：647.

[34] 徐昊，黃小平，張偉，等.黃芪和當(dāng)歸的主要活性成分配伍對(duì)骨髓抑制小鼠造血功能的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2019，35（5）：707-713.

[35] 孫成靜，曾慧婷，宿樹蘭，等.丹參莖葉提取物及其主要成分對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中草藥，2019，50（14）：3357-3367.

[36] DOI T，ISHIKAWA T，OKAYAMA T，et al. The JAK/STAT pathway is involved in the upregulation of PD-L1 expression in pancreatic cancer cell lines[J]. Oncol Rep，2017，37（3）：1545-1554.

（收稿日期：2020-06-04 修回日期：2020-10-27）

（編輯：唐曉蓮）