廖一波，吳旻暉，梁書利，林影

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

近年來，具有調(diào)節(jié)Ⅲ型蛋白賴氨酸脫乙酰酶（Sirtuins）活性能力的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）被認(rèn)為具有治療癌癥、帕金森病、肥胖、糖尿病及其他衰老相關(guān)疾病的潛力，NAD是Sirtuins唯一的底物，NAD的水平高低直接決定了Sirtuins家族的活性，而Sirtuins活性又對細(xì)胞壽命有著重要的影響[1-5]。但NAD難以直接進(jìn)入細(xì)胞，因此需要通過補充其前體來提高NAD在細(xì)胞中含量，從而起到抗衰老等作用。在NAD各前體中，NMN在口服管飼小鼠實驗中提高胞內(nèi)NAD的效果最佳，30 min內(nèi)NMN可以被迅速吸收并有效轉(zhuǎn)化為主要代謝組織中的NAD，因此適合作為NAD補充劑[4,5]。NMN廣泛存在于蔬菜、真菌、肉類和蝦中等天然食物中，且在長時間干預(yù)期中，NMN未顯示有任何明顯的毒性和副作用，具有較高的食品安全性[6]。加工特性研究發(fā)現(xiàn)，NMN在水中或乳中，75 ℃處理5 min，活性穩(wěn)定；95 ℃處理5 min后活性損失約20%，表明在巴氏殺菌乳中添加NMN具有可行性。日本的Megumi開發(fā)了NMN與白藜蘆醇的食物組合物，實驗表明具有可以降低血液中總膽固醇含量、減少血液中尿酸含量等作用[4,6,7]。

生產(chǎn)NMN的方法中，生物酶法因無有機(jī)溶劑殘留也不存在手性問題，成為最環(huán)保無公害的生產(chǎn)方法。然而利用生物酶法生產(chǎn)NMN仍然存在一些限制。Nampt催化煙酰胺和磷酸核糖焦磷酸合成NMN，但已報道的來源較少。Emmanuel的研究表明在ATP水解與NMN合成的弱偶聯(lián)下，人源的Nampt合成NMN的系統(tǒng)催化效率可以提高了1100倍，與底物NAM親和力也大幅度增加[8]。近年來也有表達(dá)Nampt應(yīng)用于生產(chǎn)NMN的研究報道，George在大腸桿菌中單獨過表達(dá)分別來源于Mus musculus，Shewanella oneidensis和Haemophilus ducreyi的Nampt，補加底物NAM，邊發(fā)酵邊生產(chǎn)NMN。其中過表達(dá)Haemophilus ducreyi來源的Nampt的大腸桿菌NMN產(chǎn)量可達(dá)14.33 mg/L培養(yǎng)液[9]。篩選和表達(dá)一個酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良、穩(wěn)定的Nampt酶，成為生物酶法合成NMN的關(guān)鍵。

本研究采用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)來源Meiothermus ruber的Nampt，該酶在前期經(jīng)過同源建模以及和底物小分子NAM的分子對接等一系列手段進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)來源于嗜熱菌Meiothermus ruber可能是高效穩(wěn)定催化生產(chǎn)NMN的酶元件。本研究采用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)來源Meiothermus ruber的Nampt，在測定該酶酶學(xué)特性的基礎(chǔ)上進(jìn)行單酶催化生產(chǎn)NMN，旨在挖掘一個酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)良、穩(wěn)定的Nampt，為NMN酶法合成提供研究基礎(chǔ)。

圖1 Nampt催化反應(yīng)示意圖Fig.1 Schematic of Nampt-catalyzed reaction

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

克隆宿主菌Escherichia coliTop10、表達(dá)宿主菌E. coliBL21（DE3）、表達(dá)載體pET-30a(+)由華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院微生物酶學(xué)實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和NotⅠ、KOD DNA聚合酶、DNA Marker、標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)購自TaKaRa公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自GeneRay公司；IPTG、質(zhì)粒提取試劑盒，凝膠回收試劑盒購自Magen公司；卡那霉素（KAN）購自上海生工生物工程有限公司；煙酰胺購于Sigama公司，磷酸核糖焦磷酸購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SKY2102S小容量恒溫培養(yǎng)搖床，上海速坤儀器儀表有限公司；5804R型高速冷凍臺式離心機(jī)，德國Eppendorf公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)，美國通用電氣公司；PCR儀，德國Eppendorf公司；HisTrap FF crude預(yù)裝柱，美國通用電氣公司；多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1 pET-30a(+)-nampt載體構(gòu)建及鑒定

從NCBI上找到來源Meiothermus ruber的Nampt的氨基酸序列（GenBank：ADD29592.1），對編碼的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。在基因上下游分別引入NdeⅠ和NotⅠ這兩個限制性核酸內(nèi)切酶位點，基因N端引入6*His-Tag標(biāo)簽，將合成的基因克隆至pET-30a(+)的NdeⅠ和NotⅠ位點間，獲得的重組質(zhì)粒命名為pET-30a(+)-nampt。對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定及測序再次確定后，將鑒定后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在卡那霉素抗性平板上挑取單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并雙酶切鑒定，將驗證正確的菌種于-80 ℃甘油管保藏。

1.2.2 目的蛋白的表達(dá)、純化及SDS-PAGE分析

挑取活化的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET30a(+)-nampt單菌落于10 mL含50 μg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)12～15 h。將過夜培養(yǎng)的菌液按2%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL含50 μg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.6～0.8。加入1 mol/L IPTG至終濃度為0.20 mmol/L，16 ℃，180 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)21 h。

將發(fā)酵液7800 r/min離心7 min，棄上清后，用蒸餾水將菌體洗滌1次后加入10 mL Buffer A緩沖液懸浮細(xì)胞。在冰浴條件下利用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)對重組大腸桿菌進(jìn)行破碎，破碎條件：6 mm變幅桿，40 min，10 mL菌體懸浮液。對破碎后的懸浮液進(jìn)行冷凍離心，10000 r/min，4 ℃，30 min，分離上清和沉淀，4 ℃保存待用。

利用Ni親和層析的方法，對預(yù)處理后的菌體破碎上清進(jìn)行純化。安裝好Ni柱（His TagTMFF），用4倍柱體積的超純水沖洗至基線平，接著用Buffer B沖洗至基線平，再用Buffer A清洗至基線平，然后以恒定3 mL/min的流速上樣，最后以一定濃度的Buffer B（預(yù)實驗中確定最佳濃度為80%）將目的蛋白洗脫并收集。用5倍柱體積的超純水沖洗至基線平，最后20%乙醇沖洗保存柱子和系統(tǒng)，卸柱，關(guān)閉系統(tǒng)，卸下的柱子置于4 ℃冰箱保存。純化后樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.3 酶活力測定

采用熒光檢測法測定Nampt酶活性[9,10]。

酶反應(yīng)體系：1.5 mL離心管中加入3.45 μL 1 mol/L Tris-HCl、1.38 μL 1% BSA、0.83 μL 1 mol/L MgCl2、1.38 μL 0.1 mol/L ATP、0.28 μL 0.1 mol/L PRPP、1.38 μL 0.1 mol/L二硫蘇糖醇、58.10 μL純水、1.5 μL稀釋一定倍數(shù)的純酶液、0.69 μL 200 μmol/L NAM。在恒溫震蕩儀中反應(yīng)，45 ℃，15 min。設(shè)置純水代替酶液的反應(yīng)體系為空白對照。

中止酶反應(yīng)：將離心管于95 ℃水浴1 min滅活酶。

產(chǎn)物NMN衍生物反應(yīng)：往離心管中加入27.7 μL 2 mol/L KOH，再加入27.7 μL 20%苯乙酮，短暫渦旋混勻后置于冰中充分冰浴2 min。加入125 μL 88%甲酸，低速短暫離心，在恒溫震蕩儀中反應(yīng)，37 ℃，10 min。

測定熒光：吸取離心管中240 μL液體至黑色96孔板測定孔中，用Tecan多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)光382 nm，發(fā)射光445 nm下測定熒光。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置若干個0～1 μmol/L濃度梯度的NMN水溶液，每個69 μL。每個離心管中加入27.7 μL 2 mol/L KOH，再加入27.7 μL 20%苯乙酮，短暫渦旋混勻后置于冰中充分冰浴2 min。加入125 μL 88%甲酸，低速短暫離心，在恒溫震蕩儀中反應(yīng)，37 ℃，10 min。吸取離心管中240 μL液體至黑色96孔板測定孔中，用Tecan多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)光382 nm，發(fā)射光445 nm下測定熒光。以純水作為空白對照。根據(jù)NMN濃度和對應(yīng)的熒光值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

計算：結(jié)合測定熒光值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活。酶活力單位（1 U）定義為：在上述條件下，每分鐘生成1 μmol產(chǎn)物NMN所需的酶量。

1.2.4 Nampt最適溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性研究

為確定溫度對酶活的影響，在pH 8.0條件下，測定不同溫度下（20、25、30、37、40、45、50、60、65、70 ℃）Nampt的酶活力。以超純水為空白對照，每個樣品平行操作三次，繪制溫度-相對酶活力曲線。為確定pH對酶活的影響，在45 ℃條件下，測定在不同pH條件下（5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10）Nampt的酶活力。以純水代替酶液的反應(yīng)體系為空白對照，每個樣品平行操作三次，繪制pH-相對酶活力曲線。

為確定該酶的熱穩(wěn)定性，在45 ℃，pH 6條件下，測定相同濃度的酶在不同溫度（45、50 ℃）下保溫不同時間（15、30、60、90、120 min）的殘余酶活力，以0 min未處理的酶液酶活作為100%，以相對酶活力為縱坐標(biāo)，每個試驗點重復(fù)三次測定，繪制時間-殘余酶活曲線。

為確定該酶的pH穩(wěn)定性，在45 ℃，pH 6條件下，測定相同濃度的酶在不同pH（5.5、6.0、6.5）下保溫不同時間（15、30、60、90、120 min）的殘余酶活力，以0 min未處理的酶液酶活作為100%，以相對酶活力為縱坐標(biāo)，每個試驗點重復(fù)三次測定，繪制時間-殘余酶活曲線。

1.2.5 動力學(xué)參數(shù)測定

為測定煙酰胺（NAM）作為底物時Nampt的動力學(xué)參數(shù)，按照“1.2.3”反應(yīng)體系與方法，設(shè)置若干個不同底物NAM濃度（0.039～20 μmol/L）的反應(yīng)體系。以純水代替酶液的反應(yīng)體系為空白對照，使用雙倒數(shù)作圖法，將酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)對底物NAM濃度的倒數(shù)的作圖，得到Km及Vmax值。

1.2.6 Nampt單酶催化生產(chǎn)NMN

反應(yīng)在2 mL離心管內(nèi)進(jìn)行。反應(yīng)體系為1.5 mL，主要包括終濃度為50 mmol/L Tris-HCl pH 6、0.1 mmol/L NAM、0.1 mmol/L PRPP、12 mmol/L MgCl2、2 mmol/L ATP、一定量的Nampt酶。45 ℃下反應(yīng)，每隔一定時間取樣，根據(jù)“1.2.3”方法測定熒光值，以計算NMN的產(chǎn)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

酶活力測定以及反應(yīng)合成NMN設(shè)置三個平行，數(shù)據(jù)值為三個平行樣品的平均值，用誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒pET-30a(+)-nampt的構(gòu)建及鑒定

圖2 重組質(zhì)粒pET-30a(+)-nampt的雙酶切鑒定與序列測定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-30a (+)-nampt by enzyme digestion and sequence determination results

圖3 SDS-PAGE分析Nampt表達(dá)與純化Fig.3 SDS-PAGE analysis of Nampt expression and purification

將合成的基因克隆至pET-30a(+)獲得重組質(zhì)粒，對構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2a：雙酶切產(chǎn)物的大小分別有約5000 bp及約1500 bp的條帶，與預(yù)期大小相符。將重組質(zhì)粒，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與密碼子優(yōu)化的目的基因nampt比對結(jié)果如圖2b所示，可以得出結(jié)論pET-30a(+)-nampt構(gòu)建成功。將鑒定后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在卡那霉素抗性平板上挑取單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并雙酶切鑒定，將驗證正確的菌種于-80 ℃甘油管保藏。

2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化、比酶活測定

根據(jù)方法“1.2.2”對Nampt酶重組菌進(jìn)行發(fā)酵，重組BL21(DE3)/pET30a(+)與BL21(DE3)/pET-30a(+)-nampt發(fā)酵后離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎儀破碎后，將細(xì)胞破碎液在10000 r/min，4 ℃條件下離心60 min，并收集離心上清液。上清液利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，其中80% Buffer B條件下洗脫的收集液為純化酶液。分別對粗酶液、Ni柱純化樣品等進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，結(jié)果如圖3所示，分析可知SDS-PAGE電泳膠圖中純化樣品在接近55 ku處有單一條帶，與目的蛋白預(yù)期大小相符。根據(jù)方法“1.2.3”，在pH 6，45 ℃下測定Nampt純酶的比酶活為3.20 U/mg。

2.3 Nampt的最適pH和溫度、熱穩(wěn)定性研究

圖4 溫度和pH對Nampt酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature and pH on the activity of Nampt

根據(jù)方法“1.2.4”，測定pH和溫度對Nampt活性的影響，圖4 a結(jié)果表明：Nampt在45 ℃的條件下酶活最高，且在37～55 ℃較寬范圍內(nèi)相對酶活力在80%以上，可以保持穩(wěn)定的酶活力。在20～25 ℃下Nampt的相對酶活力低于20%，65～70 ℃下Namtpt的相對酶活力低于40%。圖4 b表明，Nampt在pH 6的條件下酶活最高。在pH 4～5幾乎檢測不到酶活力，在pH 6～8較寬范圍內(nèi)，可以保持較高的酶活力（高于80%）。在較寬范圍的溫度和pH下，該酶相對酶活力保持較高水平，有利于此后應(yīng)用于生產(chǎn)NMN時對溫度和pH波動的適應(yīng)性。

熱穩(wěn)定性方面，圖5結(jié)果表明，在最適反應(yīng)溫度45 ℃和附近較高的溫度50 ℃下水浴保溫處理，保溫不同時間測定的殘余酶活顯示，在120 min時，Nampt的殘余酶活仍然在80%以上，熱穩(wěn)定性良好，有利于生產(chǎn)NMN過程中酶催化劑能夠長時間保持相對穩(wěn)定。

pH穩(wěn)定性方面，在最適反應(yīng)pH 6.0及附近pH 5.5和6.5條件下，于45 ℃水浴保溫處理，測定保溫不同時間的殘余酶活。結(jié)果如圖6，在pH 6.0和6.5條件下，120 min時Nampt的殘余酶活仍然分別在80%和70%以上，pH穩(wěn)定性良好。但是在pH 5.5條件下，15 min時殘余酶活低于50%，90 min以后殘余酶活低于20%。pH穩(wěn)定性結(jié)果表明，該Nampt在最適pH 6.0及略大的pH 6.5條件下穩(wěn)定性良好，但在略小的pH 5.5條件下，短時間酶活損失較大。該酶對過低的pH穩(wěn)定性較差，在應(yīng)用于生產(chǎn)NMN時，應(yīng)避免反應(yīng)體系pH低于6.0。

圖5 Nampt的熱穩(wěn)定性分析Fig.5 Thermal stability analysis of Nampt

圖6 Nampt的pH穩(wěn)定性分析Fig.6 pH stability analysis of Nampt

圖7 雙倒數(shù)曲線法測定Nampt的動力學(xué)參數(shù)Fig.7 Determination of kinetic parameters of Nampt by double reciprocal curve method

表1 Nampt動力學(xué)參數(shù)比較Table 1 Comparison of Nampt kinetic parameters from different sources

2.4 Nampt動力學(xué)參數(shù)測定

在最適溫度和pH下，設(shè)置不同濃度梯度的NAM并進(jìn)行酶活力測定。使用雙倒數(shù)作圖法，將酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)對底物NAM濃度的倒數(shù)的作圖。結(jié)果如圖7所示，通過擬合的趨勢線與橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)的截距來計算Km和Vmax值。以NAM為底物，Nampt的Km為0.39 μmol/L，Vmax為3.20 μmol/(mg·min)，R2為0.98。與已測定動力學(xué)參數(shù)來源的Nampt比較如表1所示。Homo sapiens來源的Nampt Km最小，對底物NAM親和力最好，表中兩篇報道測定值相差較大可能是由于測定產(chǎn)物NMN方法不一樣導(dǎo)致[8,11]。Homo sapiens與Mus musculus來源的Nampt kcat值較小，可能無法滿足工業(yè)生產(chǎn)NMN的要求，George研究中使用了Mus musculus來源的Nampt，相對于其他兩個細(xì)菌來源的Nampt，相同時間內(nèi)Mus musculus來源的Nampt在大腸桿菌過表達(dá)后生產(chǎn)NMN的產(chǎn)量較低[9]。本研究表達(dá)的Nampt的Kcat值遠(yuǎn)高于其他來源，kcat/Km為目前已表征的Nampt中最高，更加適用于工業(yè)生產(chǎn)NMN。

2.5 NMN酶法合成及鑒定

測定了Nampt的酶學(xué)性質(zhì)以及熱穩(wěn)定性后，嘗試將該酶應(yīng)用于酶法合成NMN。根據(jù)方法“1.2.6”，通過改變Nampt的添加量，觀察不同Nampt的添加量對NMN產(chǎn)量的影響。如圖8a所示，酶添加量為0.002、0.008、0.02 g/L時，NMN產(chǎn)量達(dá)到最高時所需要的反應(yīng)時間，隨著酶添加量的增加而減少，NMN的最高產(chǎn)量隨著酶添加量的增加而提高。但當(dāng)酶添加量增加到0.1 g/L時，NMN最高產(chǎn)量幾乎和酶添加量為0.02 g/L時候一致，在反應(yīng)5 min NMN產(chǎn)量達(dá)到最大值約15 mg/L，生產(chǎn)效率為3 mg/(L·min)。NMN產(chǎn)量不再隨著酶的添加量增加而提高，可能是由于底物之一的PRPP不穩(wěn)定，在-80 ℃或室溫解凍和反應(yīng)過程降解損耗導(dǎo)致，體系中另一底物NAM仍未反應(yīng)完全。為驗證此猜想，在酶添加量為0.1 g/L的反應(yīng)體系中，待反應(yīng)至5 min時，補加一次0.1 mmol/L的底物PRPP，反應(yīng)結(jié)果如圖8b所示，反應(yīng)至10 min時NMN產(chǎn)量檢測到約為30 mg/L，生產(chǎn)效率為3 mg/(L·min)。該實驗結(jié)果表明通過補加PRPP的方法，提高NMN的產(chǎn)量。

圖8 Nampt催化生產(chǎn)NMNFig.8 Nampt catalyzes production of NMN

圖9 質(zhì)譜鑒定反應(yīng)產(chǎn)物Fig.9 Identification of reaction products by mass spectrometry

3 結(jié)論

3.1 本文成功在大腸桿菌中活性表達(dá)Meiothermus ruber來源的Nampt。在最適pH 6，最適溫度45 ℃條件下，該酶kcat為0.39 μmol/L，Vmax為3.20 μmol/(mg·min)，kcat為1.39 1/s，與已報道和表征的其他來源Nampt相比[8,11-14]，該酶kcat/Km最高，更加工業(yè)生產(chǎn)NMN。該酶在較寬范圍的溫度和pH下，酶活力在較高水平，有利于此后應(yīng)用于生產(chǎn)時對溫度和pH波動的適應(yīng)性。在45 ℃和50 ℃保溫120 min后，該酶酶活殘余仍有80%以上，有利于生產(chǎn)NMN過程中酶催化劑能夠長時間保持相對穩(wěn)定。在pH 6.0和6.5條件下，120 min時Nampt的殘余酶活仍然分別在80%和70%以上，pH穩(wěn)定性良好。但是在pH 5.5條件下，短時間酶活損失較大，在應(yīng)用于生產(chǎn)NMN時，應(yīng)避免反應(yīng)體系pH低于6.0。初步利用該酶進(jìn)行催化生產(chǎn)NMN，酶添加量為0.1 g/L的情況下，反應(yīng)5 min時補加一次PRPP，NMN最高產(chǎn)量可達(dá)30 mg/L，NMN產(chǎn)量已超過George[9]利用大腸桿菌過表達(dá)Nampt邊發(fā)酵邊生產(chǎn)的方法。本研究為Nampt應(yīng)用于NMN的酶法合成提供良好的研究基礎(chǔ)。

3.2 本研究雖然成功表達(dá)性質(zhì)較優(yōu)的Nampt，但后續(xù)仍然存在許多挑戰(zhàn)。例如固定化酶技術(shù)的使用會提高酶元件的穩(wěn)定性與重復(fù)利用率，進(jìn)而可以降低生產(chǎn)成本，但固定化酶可能帶來酶催化性質(zhì)變差的問題，如底物親和力降低等，因此尋求到合適的固定化酶方法將會大大在降低酶消耗帶來的生產(chǎn)成本[15,16]。此外單酶法生產(chǎn)NMN的底物之一的PRPP不穩(wěn)定且價格較貴，影響了生產(chǎn)NMN的經(jīng)濟(jì)效益。后續(xù)可以通過使用多酶法，先從更為廉價穩(wěn)定的底物出發(fā)得到中間產(chǎn)物PRPP，例如可以通過核糖激酶（EC 2.7.1.15），PRPP合成酶（EC 2.7.6.1）代謝途徑，由ATP和核糖出發(fā)得到PRPP。