唐連剛，張乃崇，賴廷海

茂名市人民醫(yī)院神經(jīng)外一科(廣東茂名 525000)

膠質(zhì)瘤是最常見的腦腫瘤，約占原發(fā)性惡性腦腫瘤的80%，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的分類，膠質(zhì)瘤可分為低級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅰ/Ⅱ級(jí))和高級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅲ /Ⅳ級(jí))[1]。Ⅰ/Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤是緩慢生長的腫瘤，沒有侵襲性特征，而Ⅲ /Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出與高增殖活性，強(qiáng)侵襲能力和新生血管形成相關(guān)的惡性表型。雖然在過去的幾十年中膠質(zhì)瘤治療取得了不少的進(jìn)展，但其臨床效果仍不太理想[2]。研究[3]表明，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM，Ⅳ級(jí))的中位生存時(shí)間在診斷后持續(xù)不到15個(gè)月。雖然近年來對(duì)膠質(zhì)瘤中癌基因和腫瘤抑制因子進(jìn)行了不少的研究，單膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制仍未完全明確。基底膜是細(xì)胞黏附的細(xì)胞外基質(zhì)，其將神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和來自相鄰結(jié)締組織的其他細(xì)胞分開?；啄榧?xì)胞提供物理屏障，有助于細(xì)胞黏附、增殖、遷移和存活[4]?；啄さ闹饕Y(jié)構(gòu)組分包括層粘連蛋白(laminin)、Ⅳ型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖perlecan和集聚蛋白，層粘連蛋白是異源三聚體家族，各自由α、αβ和αγ亞基組成[5]。目前已經(jīng)鑒定了5個(gè)α，4個(gè)β和3個(gè)γ亞基鏈。這些亞基的不同組合組裝了16種不同的哺乳動(dòng)物層粘連蛋白同種型。層粘連蛋白γ1(Laminin subunit gamma-1，LAMC1)由LAMC1基因合成，其在早期和晚期細(xì)胞形態(tài)發(fā)生中起重要作用[6]。LAMC1的C-末端層粘連蛋白型球狀結(jié)構(gòu)域是位于α-亞基C-末端的主要受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其與整聯(lián)蛋白、α-肌萎縮蛋白、肝素的硫酸化相互作用，通過N-末端LN結(jié)構(gòu)域的相互作用進(jìn)行聚合[7]。LAMC1在層粘連蛋白亞基中廣泛表達(dá)，主要在基底膜中發(fā)現(xiàn)，腦膜瘤中上調(diào)的LAMC1表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)呈正相關(guān)[8]。研究[9]表明，上調(diào)的LAMC1可能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，因此LAMC1可能是治療人類癌癥的重要治療靶點(diǎn)。但目前LAMC1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與臨床特征，以及其對(duì)患者預(yù)后的影響仍未明確。本研究旨在探討LAMC1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)及與臨床特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年6月至2018年2月因神經(jīng)膠質(zhì)瘤于我院行手術(shù)治療患者共68例的病理組織石蠟塊資料，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后病理確診為神經(jīng)膠質(zhì)瘤；(2)患者臨床資料和隨訪資料完整；(3)術(shù)前未進(jìn)行放療、化療和靶向治療；排除合并免疫性疾病，以及合并其他腫瘤或其他腫瘤腦轉(zhuǎn)移的患者；另外10例正常腦組織標(biāo)本來自患有創(chuàng)傷性腦損傷且經(jīng)內(nèi)部減壓手術(shù)治療的患者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。68例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中男41例，女27例，確診時(shí)平均年齡(42.3±5.7)歲，范圍26～64歲，根據(jù)WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ級(jí)9例，Ⅱ級(jí)18例，Ⅲ級(jí)21例，Ⅳ級(jí)20例。

1.2 臨床標(biāo)本收集和免疫組化 免疫組化染色檢測(cè)均由我院病理科醫(yī)師進(jìn)行，所有的神經(jīng)膠質(zhì)瘤或正常腦組織常規(guī)固定在10%中性緩沖甲醛溶液，并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋。將石蠟包埋的神經(jīng)膠質(zhì)瘤或正常腦組織切成5 μm進(jìn)行制片。在二甲苯中脫蠟并再水合后，用3%H2O2孵育將切片用過氧化物酶封閉，在1 mmol/L乙二胺四乙酸中進(jìn)行微波加熱抗原修復(fù)。使用5%胎牛血清(FBS)來阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后，將切片與第一抗體孵育，大鼠抗LAMC1單克隆抗體(anti-LAMC1，ab80580，Abcam，Cambridge，UK)在4℃孵育過夜。在第一抗體反應(yīng)后，將樣品與HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗室溫孵育30 min。并使用過氧化物酶底物進(jìn)行可視化，未與一抗孵育的切片用作陰性對(duì)照。由本院2名病理科醫(yī)師每個(gè)切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野(×200)拍照后進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 免疫組化評(píng)估 通過Image-Proplus 6.0軟件通過每張測(cè)量組織照片中神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織的LAMC1表達(dá)水平。先采用軟件對(duì)照片進(jìn)行校正光密度，再根據(jù)免疫組化染色選擇特定染色物的顏色，采用平均光密度評(píng)估LAMC1的表達(dá)水平，具體先測(cè)量一下有效測(cè)量區(qū)域的面積，再測(cè)量這個(gè)面積范圍內(nèi)目標(biāo)染色區(qū)域的累積光密度值IOD，兩者相除得到mean density。通過68例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的LAMC1的表達(dá)水平取通過取中位數(shù)作為cut-off值區(qū)分為LAMC1高表達(dá)和LAMC1低表達(dá)。

1.4 臨床資料收集和隨訪 通過患者病例資料查找納入研究患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤周圍水腫情況、患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況、IDH1基因突變情況，記錄所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床WHO分期。所有患者通過電話和網(wǎng)絡(luò)隨訪記錄患者的生存時(shí)間和復(fù)發(fā)情況。

2 結(jié)果

2.1 LAMC1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況 LAMC1在正常腦組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)情況如圖1所示，其中神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的平均LAMC1表達(dá)水平為0.672±0.094，正常腦組織的平均LAMC1表達(dá)水平為0.132±0.041，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的LAMC1表達(dá)水平顯著高于正常腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

注：A：正常腦組織中LAMC1的表達(dá)；B：WHO分級(jí)為Ⅰ級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織LAMC1表達(dá)；C：WHO分級(jí)為Ⅱ級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織LAMC1表達(dá)；D：WHO分級(jí)為Ⅲ級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織LAMC1表達(dá)；E：WHO分級(jí)為Ⅳ級(jí)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織LAMC1表達(dá)

2.2 LAMC1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 其中神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中LAMC1表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤周圍水腫和IDH1突變沒有顯著的相關(guān)性(P>0.05)，而LAMC1在WHO分期為Ⅲ～Ⅳ期高表達(dá)的比例顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，且術(shù)后復(fù)發(fā)的患者其LAMC1高表達(dá)的比例顯著高于術(shù)后未復(fù)發(fā)的患者(P<0.05)，見表1。

表1 LAMC1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織表達(dá)與臨床特征的關(guān)系(n=68) 例

2.3 LAMC1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 68例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的隨訪時(shí)間為5～36個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為19個(gè)月，其中神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中LAMC1高表達(dá)的患者其總體生存率顯著低于LAMC1低表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=2.035，95%CI：1.113～3.723，P=0.021)，見圖2。

圖2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的LAMC1表達(dá)水平對(duì)患者總體生存率的影響

2.4 LAMC1表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床預(yù)后的多元Cox回歸分析 綜合68例患者的臨床特征進(jìn)行Cox 多因素分析，結(jié)果顯示LAMC1高表達(dá)(HR=1.952，95%CI：1.106～2.354，P=0.017)、腫瘤大小≥35 mm、WHO分期為Ⅲ～Ⅳ期、術(shù)后復(fù)發(fā)和合并IDH1突變是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌患者COX多因素生存分析 (n=68)

3 討論

膠質(zhì)瘤是成人中最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，并且其腫瘤存在高度異質(zhì)性和預(yù)后不良。盡管結(jié)合手術(shù)切除、放療和化療的療法取得了一定的進(jìn)展，膠質(zhì)瘤仍是最致命的人類癌癥之一，不到5%的患者存活超過5年[10]。目前膠質(zhì)瘤其具體的分子機(jī)制仍未明確，找到膠質(zhì)瘤的有效治療靶點(diǎn)仍是目前研究的重點(diǎn)。LAMC1是一種對(duì)基底膜組裝必不可少的蛋白質(zhì)，既往報(bào)道層粘連蛋白在腫瘤組織中對(duì)組織發(fā)育、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要作用[11]。層粘連蛋白存在于細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞膜中，作為檢測(cè)的潛在生物標(biāo)志物。目前LAMC1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及對(duì)臨床預(yù)后的影響仍未明確。本研究中首次通過組織學(xué)檢測(cè)了LAMC1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)和臨床意義。本研究結(jié)果初步表明，在膠質(zhì)瘤組織中LAMC1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著增高，且LAMC1表達(dá)水平與WHO分期、術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后密切相關(guān)，表明了LAMC1是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。

LAMC1編碼層粘連蛋白γ1鏈，其是層粘連蛋白最常見的γ亞基，并參與各種惡性腫瘤的病情進(jìn)展。本研究中，LAMC1其在膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平顯著升高，且與WHO分期密切相關(guān)，表明了LAMC1的表達(dá)水平隨著腫瘤的惡性程度增加而增高。最近研究[12]證實(shí)LAMC1在宮頸癌中上調(diào)，其表達(dá)與FIGO分期、子宮肌層浸潤、頸/附件受累、血管淋巴管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。對(duì)247例肝細(xì)胞癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進(jìn)行無偏隨機(jī)存活森林分析，發(fā)現(xiàn)LAMC1表達(dá)上調(diào)與晚期腫瘤分期呈正相關(guān)，LAMC1高表達(dá)的患者總體無腫瘤存活率較低[13]。通過微陣列分析研究多發(fā)性骨髓瘤，不同類型發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)含量在不同的RPMI-8226抗藥性亞系中有所改變，LAMC1基因在潑尼松耐藥亞系中大量過表達(dá)[14]。且LAMC1與子宮癌的不同亞型及其臨床分期有關(guān)，與正常增殖和分泌性子宮內(nèi)膜相比，其中LAMC1幾乎檢測(cè)不到，在從非典型增生到低級(jí)別和高級(jí)別子宮內(nèi)膜樣癌的上皮細(xì)胞中觀察到LAMC1表達(dá)增加[15]。

本研究也明確了LAMC1高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者其臨床預(yù)后不良，且LAMC1是影響膠質(zhì)瘤患者其臨床預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。盡管LAMC1在腫瘤中具有明確的生物學(xué)意義，但其異常表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制及其功能背后的機(jī)制仍有待研究。既往研究[16]miRNA在調(diào)控LAMC1的表達(dá)中具有重要的作用，在前列腺癌中，LAMC1是miR-29s的直接靶標(biāo)。而在人肝細(xì)胞癌中，SP1反式激活LAMC1啟動(dòng)子，LAMC1的表達(dá)受到Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[17]。此外，PI3K/AKT、NF-κB和JAK/STAT3信號(hào)通路可能與COL1A1介導(dǎo)的侵襲密切相關(guān)[18]。這些研究為LAMC1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制提供了新的研究方向。

綜合上述，本研究結(jié)果初步表明了LAMC1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平顯著增高，且與膠質(zhì)瘤的WHO分期及臨床預(yù)后密切相關(guān)。對(duì)于LAMC1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的具體調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。