龐韜,張欣宗,鄧順美,伍嘉寶,周雨,唐雨倩,朱勝輝,鐘文謠,蔣敏△

國家衛(wèi)生健康委員會(huì)男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所 1男科,2中心實(shí)驗(yàn)室,3優(yōu)生遺傳科(廣東廣州 510600)

雄性生殖細(xì)胞包括精母細(xì)胞和精子，發(fā)育于青春期，在新生期后很長時(shí)間內(nèi)存在，并建立了自我耐受機(jī)制。血睪屏障將這些細(xì)胞分隔，防止抗體和免疫活性細(xì)胞進(jìn)入曲細(xì)精管腔。因此，精子細(xì)胞表達(dá)免疫系統(tǒng)從來沒有遇到過的抗原，并作為自身抗原引發(fā)雄性和雌性的免疫反應(yīng)[1]。對精子的免疫反應(yīng)是導(dǎo)致不育的原因之一，這一點(diǎn)已經(jīng)在人類和多種動(dòng)物身上得到證實(shí)[2]?？咕涌贵w(AsAb)在血液與精子表面的含量不同，檢測方法不一，血液和精液AsAb兩者間存在差異，在臨床診斷的應(yīng)用上存在爭議。根據(jù)《世界衛(wèi)生組織(WHO)男性不育的標(biāo)準(zhǔn)化檢查、診斷和治療手冊》(簡稱《手冊》)，男性免疫性不育的標(biāo)準(zhǔn)化診斷方案主要是檢測精子表面存在的AsAb[3]。AsAb分為循環(huán)抗體和局部抗體，循環(huán)抗體主要存在于血液中，采樣和檢測較為方便，局部抗體主要存在于精子表面，取樣和檢測受到一定的限制，血液和精子表面的AsAb檢測結(jié)果在臨床上吻合度欠缺，給臨床醫(yī)師診斷、治療帶來不少困惑。血液和精液AsAb之間是否存在聯(lián)系，需要我們?nèi)パ芯刻剿鳌?/p>

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年6月至2019年4月期間到廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院就診的男性不育患者，排除生殖道等器質(zhì)性病變，遺傳、內(nèi)分泌障礙、損傷、感染等引起的器質(zhì)性原因，且染色體正常，無內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，共3 253例，年齡28～40歲，均為婚后兩年以上，性生活正常，未采取任何避孕措施。

1.2 樣本

1.2.1 精液 所有患者在標(biāo)本采集前均禁欲2～7 d，在取精房用手淫的方法收集于干燥潔凈的90 mL取精杯內(nèi)。采集后于37℃水浴箱內(nèi)孵育至液化后進(jìn)行檢測。共采集1 672例。

1.2.2 血液 按照一般原則進(jìn)行靜脈采血5 mL，使用肝素抗凝管，棄用明顯溶血、黃疸血和脂血樣品。3 000 r/min離心5 min得到血漿。共采集2 055例。

1.3 儀器與試劑 美國寶特BIO-TEK Elx-800酶標(biāo)儀、德國IBL公司抗精子抗體酶聯(lián)免疫定量試劑盒(RE52001)、深圳華康生物醫(yī)學(xué)有限公司精子膜表面抗體IgG檢測試劑盒。

1.4 研究方法

1.4.1 精子表面AsAb檢測[混合抗球蛋白反應(yīng)試驗(yàn)(mixed antiglobulin reaction test,MAR試驗(yàn))] 應(yīng)用MAR試劑盒，按照說明書操作。在潔凈載玻片上充分混勻新鮮精液標(biāo)本、致敏微球和抗血清各5 μL，覆蓋蓋玻片，室溫37℃孵育3 min，在400×高倍相差顯微鏡下觀察結(jié)果，10 min后再觀察1次，計(jì)數(shù)與致敏微球相互黏附的活動(dòng)精子百分率(忽略尾尖結(jié)合)。每片至少計(jì)數(shù)200個(gè)活動(dòng)精子。MAR陽性結(jié)果用SCMC(精子-宮頸粘液接觸試驗(yàn))和Kremer′s(精子-宮頸黏液穿透實(shí)驗(yàn))驗(yàn)證。超過50%的活動(dòng)精子包裹在致敏微球上，可判為精子膜表面抗體IgG陽性；如果結(jié)合僅限于尾尖，則無臨床意義。

1.4.2 血液抗精子抗體定量檢測(ELISA試驗(yàn)) 用稀釋液將樣品分別按1∶51的比例進(jìn)行稀釋，混合均勻。根據(jù)所用試劑盒操作說明的步驟要求進(jìn)行ELISA檢測，其中加入TMB底物液100 μL 25℃溫育15 min，最后加入終止液100 μL后在酶標(biāo)儀上測定波長450 nm的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將OD值轉(zhuǎn)換成樣本測定的AsAb濃度值。AsAb濃度>75 U/mL為陽性結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，對兩組標(biāo)本的抗體陽性檢出率進(jìn)行2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

血液、精液AsAb檢測結(jié)果:受檢患者3 253例，其中血液抗精子抗體檢測2 055例，陽性375例，陽性率為18.25%；精子表面AsAb檢測1 672例，陽性12例，陽性率為0.718%，兩種樣品組的陽性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

其中474例患者同時(shí)檢測精子表面抗體和血液抗體，發(fā)現(xiàn)精子表面抗體陽性1例，但該例血液中抗體為陰性，精子抗體陽性率為0.21%；血液中抗體陽性為39例，但精子表面抗體均為陰性；血液抗體陽性率為8.23%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明精子表面抗體與血液抗體的檢出率并無相關(guān)性。

3 討論

《手冊》指出，免疫因素是男性不育的重要病因，正確的診斷相當(dāng)重要。AsAb的檢測是精子免疫介導(dǎo)不育的主要檢查指標(biāo)。Marconi等[4]指出AsAb產(chǎn)生是由于血-睪丸屏障破壞引起的，9%～12%不育夫婦血液中存在AsAb；1%～2.5%正常生育男性血液發(fā)現(xiàn)AsAb。而國內(nèi)研究尚無精子表面AsAb陽性率的大數(shù)據(jù)分析結(jié)果。本研究通過10年間1672例的男性門診患者大樣本量分析，得出陽性檢出率僅為0.718%，與歐洲正常生育男性結(jié)果相近。范晶等[5]用MAR檢測了288例男性不育癥患者精液中的AsAb IgG，陽性率為1.74%，Leushuis 等[6]用MAR檢測了1 794對夫婦的丈夫精液中的 AsAb IgG，陽性率約3%。本研究應(yīng)用ELISA檢測男性血液AsAb 2 055例，陽性率18.25%，遠(yuǎn)高于精子表面AsAb的陽性率。Bohring等[7]發(fā)現(xiàn)在60%的健康男性血清中發(fā)現(xiàn)了AsAb，其中15%～30%的AsAb與精子結(jié)合，與本研究結(jié)果相符。

《手冊》推薦精子表面AsAb檢測采用混合抗球蛋白反應(yīng)試驗(yàn)或免疫珠試驗(yàn)(immunobead test,IBT)[3]，而ELISA是目前廣泛使用的血液AsAb檢測方法，不同的方法和標(biāo)本來源使檢測結(jié)果受到多方面的影響。精子抗原包括了固有抗原和附著抗原[8]。固有抗原是精子自身產(chǎn)生的，附著抗原是精子進(jìn)入附睪或與精漿混合后，一些特異蛋白吸附在精子膜上而形成的,此類抗原也可刺激AsAb產(chǎn)生。本研究中，474例患者同時(shí)檢測精子表面和血液的抗體，精子表面抗體陽性率為0.21%；血液中抗體陽性率為8.23%，血液AsAb陽性率明顯高于精子表面，說明血液中出現(xiàn)AsAb并不代表精子表面就有AsAb，兩者相關(guān)性差。血液AsAb濃度與MAR結(jié)果無線性關(guān)系,僅有的1例MAR陽性，其患者血液AsAb濃度也是遠(yuǎn)低于參考值下限,說明血液與精子表面的AsAb沒有必然的相關(guān)性。

按照WHO男性免疫性不育診斷依據(jù)，必須是使用IBT或MAR方法，測定活動(dòng)精子中黏附免疫珠的精子在50%以上，并用SCMC、Kremer′s或PCT等證實(shí)后才能作出免疫性不育診斷。可見檢測精子表面的AsAb比檢測血液中的AsAb更具有臨床價(jià)值，血液中出現(xiàn)AsAb并不意味著精子表面就有AsAb黏附。血液中AsAb的效價(jià)與精子表面是否存在AsAb的可能性并沒有必然聯(lián)系。許苑等[9]報(bào)道60例精索靜脈曲張患者AsAb情況，分別用MAR測定活動(dòng)精子表面AsAb，用ELISA方法測定血清和精漿AsAb，發(fā)現(xiàn)精漿和精子表面AsAb測定比血清AsAb測定更具有臨床價(jià)值，與本研究結(jié)果一致。此外，許多研究表明只有當(dāng)抗體出現(xiàn)在精子表面時(shí)才有意義，即便血液中AsAb濃度再高，也不如精子表面抗體陽性對臨床對免疫性不育的診斷價(jià)值大[10-12]。

但是，近年國內(nèi)有文獻(xiàn)顯示不育患者AsAb 陽性率多在 15%～60%，甚至有報(bào)道接近90%。筆者認(rèn)為有幾方面的原因：(1)方法學(xué)的選擇：MAR和IBT作為世界衛(wèi)生組織(WHO)的推薦方法，已經(jīng)廣泛使用，但還有一些實(shí)驗(yàn)室或生殖中心采用其他方法，從而導(dǎo)致陽性率有差異。ELISA檢測AsAb具有一定的局限性，仍然存在一些因素制約，僅可作為不孕癥的輔助診斷方法使用[13]。(2)參考值的選取不同：不同版本的WHO手冊AsAb陽性臨界值(MAR)有改變，第2版為10%，第3版為20%，第4版和第5版均為50%，某些MAR試劑盒正常參考值下限仍然采用第2版手冊的10%，導(dǎo)致陽性率虛高。(3)結(jié)果判讀的標(biāo)準(zhǔn)不同：MAR以經(jīng)典的Coombs試驗(yàn)為理論基礎(chǔ)，能夠直接檢測出新鮮精子表面附著的AsAb，但是該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀有一定的主觀性，特別是活力較弱精子在成團(tuán)致敏微球下方顫動(dòng)與真陽性精子由于阻力作用原地旋轉(zhuǎn)難以區(qū)分；此外，不動(dòng)精子表面出現(xiàn)致敏微球與之黏附也不應(yīng)計(jì)數(shù)在內(nèi)。(4)黏稠度高的精液標(biāo)本，其精子容易與致敏微球非特異性結(jié)合，導(dǎo)致誤判為陽性[14]。本研究高黏稠度精液樣本均加入含有菠蘿蛋白酶的液化劑以降低樣本黏稠度，避免出現(xiàn)MAR假陽性。

綜上所述，AsAb的檢測是臨床診斷和治療不育癥的良好指標(biāo)之一，特別對免疫性不育癥的診斷和治療有重要的應(yīng)用價(jià)值。中國應(yīng)收集多中心的男性免疫性不育的流行病學(xué)資料，嚴(yán)格按照《手冊》，以MAR、IBT作為統(tǒng)一的AsAb篩查試驗(yàn)，應(yīng)用符合要求、質(zhì)量過硬的試劑盒，做好陰陽性對照質(zhì)量控制，檢測精子表面的AsAb，為男科臨床提供準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。