申 健，李夢豪，鄧煥堂，李志明，何麗珍，張 宇，羅艷芳，謝雄偉，劉錦光

廣東省惠州市中心人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，惠州 516001

急性心肌梗死是全球范圍內(nèi)最常見的心血管危重癥之一，其發(fā)病后出現(xiàn)心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[1-2]。心肌缺血/再灌注損傷是一個(gè)非常復(fù)雜的病理生理過程，可導(dǎo)致嚴(yán)重的急性和慢性心肌損傷[3]。心肌缺血再灌注過程中，除了細(xì)胞壞死外，細(xì)胞凋亡也是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的另一個(gè)重要原因[4]。此外，還證實(shí)了該過程中會(huì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[4-5]。因此，減少細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)可能對(duì)探究缺血/再灌注損傷的分子機(jī)制，尋找預(yù)防心肌缺血/再灌注損傷的治療方法具有重要意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類競爭性的內(nèi)源性RNA，由于缺乏完整的開放讀碼框架而缺乏蛋白質(zhì)編碼功能。研究證實(shí)LncRNA在急性心肌梗死患者中存在差異表達(dá)[6-8]。LncRNA心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(myocardial infarction-associated transcript 2，Mirt2)是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，其抗炎活性已在現(xiàn)有研究中得到證實(shí)[9]。研究結(jié)果顯示Mirt2可抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥通路激活，并在巨噬細(xì)胞極化反應(yīng)中作為一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子出現(xiàn)[10]。c-Jun氨基末端活化蛋白激酶(Jun kinase enzyme，JNK)及絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MAP kinase phosphatase，MKP-1)在大鼠心肌細(xì)胞炎癥損傷中發(fā)揮重要作用[11-12]。然而，Mirt2在心肌細(xì)胞缺血再灌注中的作用及與MKP-1/JNK信號(hào)通路的關(guān)系目前仍不清楚。

本研究通過構(gòu)建H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型來模擬心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)Mirt2，探究其對(duì)心肌細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步探討Mirt2在心肌缺血再灌注中的作用及其機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療心肌損傷提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

大鼠心肌細(xì)胞H9C2購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。培養(yǎng)液(DMEM)、胎牛血清(FBS)、無糖培養(yǎng)液、緩沖液(PBS)、鏈霉素/青霉素雙抗購于美國Gibco公司。

1.2 臨床樣本

收集廣東省惠州市中心人民醫(yī)院急性心肌梗死患者和正常人血液樣本各10例，分析LncRNA Mirt2在急性心肌損傷患者血液中的表達(dá)水平變化。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

H9C2心肌細(xì)胞分組4組：對(duì)照組；缺氧復(fù)氧組，缺氧2 h，復(fù)氧12 h；過表達(dá)對(duì)照組，缺氧復(fù)氧的細(xì)胞轉(zhuǎn)染Mirt2過表達(dá)對(duì)照載體；Mirt2過表達(dá)組，缺氧復(fù)氧的細(xì)胞轉(zhuǎn)染Mirt2過表達(dá)載體。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將購買的H9C2細(xì)胞復(fù)蘇，接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換新的培養(yǎng)液。細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，用胰酶消化液將H9C2細(xì)胞消化下來，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將LncRNA Mirt2 mimics和陰性對(duì)照(過表達(dá)對(duì)照載體)轉(zhuǎn)染入H9C2細(xì)胞中。

1.6 qRT-PCR檢測LncRNA Mirt2的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效率

收集血液和細(xì)胞樣本。采用Trizol提取血液和細(xì)胞中的RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用以下程序：在50℃下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄2 min，在94℃下初始變性2 min，然后45次循環(huán)，溫度為95℃，持續(xù)15 s，55℃持續(xù)1 min，72℃持續(xù)5 s。采用SYBR混合試劑盒，用lightcycler 2.0(Roche)進(jìn)行qRT-PCR檢測。

1.7 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

分組處理后，將細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，加入10 μL CCK-8試劑在每個(gè)孔中與培養(yǎng)液混合，37℃下反應(yīng)1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值。

1.8 Caspase-3活性檢測

將細(xì)胞接種于24孔板中，根據(jù)Caspase-3活性分析試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，檢測各組細(xì)胞中Caspase-3活性的變化。

1.9 TUNEL染色法分析細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞接種在6孔板中，培養(yǎng)12 h后，加PBS清洗2次，根據(jù)TUNEL檢測細(xì)胞凋亡操作步驟，分析細(xì)胞凋亡情況。

1.10 Western blot檢測蛋白表達(dá)

用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA試劑盒測定上述提取蛋白的濃度。隨后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離不同分子量的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用脫脂奶封膜過夜。孵育一抗PARP、Cleaved PARP、pro-Caspase-3、Cleave Caspase-3、IL-1β、IL-6、MKP-1、t-JNK、p-JNK、t-c-Jun、p-c-Jun(均購自Abcam公司)及GAPDH，4℃冰箱過夜。取出后，室溫下，用二抗孵育1 h。洗膜后，加化學(xué)發(fā)光試劑，顯影。采用Image J軟件進(jìn)行蛋白定量分析。

1.11 酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbenta assay，ELISA)實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種在24孔板中，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行分析。采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測IL-1β和IL-6的濃度，按照產(chǎn)品操作說明進(jìn)行。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Mirt2在急性心肌損傷患者中的表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果顯示，Mirt2在急性心肌損傷患者血液樣本中的表達(dá)下調(diào)，與正常健康對(duì)照相比，Mirt2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，圖1)。

2.2 Mirt2在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中的表達(dá)及轉(zhuǎn)染驗(yàn)證

qRT-PCR結(jié)果表明，Mirt2在缺氧復(fù)氧后H9C2細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組相比，Mirt2的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，圖2A)；與過表達(dá)對(duì)照組相比，Mirt2過表達(dá)組的Mirt2水平顯著升高(P<0.05，圖2B)。以上結(jié)果證實(shí)Mirt2在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中表達(dá)減少，過表達(dá)Mirt2效率明顯。

圖1 Mirt2在急性心肌損傷患者中的表達(dá)(n=10)Fig.1 Expression of Mirt2 in patients with acute myocardial injury(n=10)

A:Mirt2在缺氧復(fù)氧后表達(dá)下調(diào);B:Mirt2過表達(dá)組Mirt2水平顯著高于過表達(dá)對(duì)照組圖2 Mirt2在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中的表達(dá)及轉(zhuǎn)染驗(yàn)證Fig.2 Mirt2 expression and transfection validation in hypoxia-reoxygenation-induced cardiomyocytes

2.3 過表達(dá)Mirt2對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞炎性因子的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，H9C2心肌細(xì)胞在缺氧復(fù)氧條件下，IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)顯著增加，與過表達(dá)對(duì)照組相比，Mirt2過表達(dá)可以顯著減少炎性因子IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)(均P<0.05，圖3A)。ELISA檢測結(jié)果顯示，H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧條件下，IL-1β和IL-6的釋放顯著增加(均P<0.05)，與過表達(dá)對(duì)照組相比，Mirt2過表達(dá)可以顯著減少炎性因子IL-1β和IL-6的釋放(均P<0.05，圖3B)。以上結(jié)果表明在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中過表達(dá)Mirt2可以保護(hù)細(xì)胞，減輕炎性反應(yīng)。

A:Western blot;B:ELISA實(shí)驗(yàn);1：對(duì)照組；2：缺氧復(fù)氧組；3：過表達(dá)對(duì)照組；4：Mirt2過表達(dá)組；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與過表達(dá)對(duì)照組比較，#P<0.05圖3 Mirt2過表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞炎性因子的影響Fig.3 Effects of Mirt2 overexpression on inflammatory factors in hypoxia-reoxygenation-induced cardiomyocytes

2.4 過表達(dá)Mirt2對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞活力和凋亡的影響

CCK-8檢測結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞活力顯著降低；與過表達(dá)對(duì)照組相比，Mirt2過表達(dá)可以增加細(xì)胞的活力(均P<0.05，圖4A)。Caspase-3試劑盒檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞中Caspase-3的活性顯著增加；與過表達(dá)對(duì)照組相比，Mirt2過表達(dá)組細(xì)胞中Caspase-3的活性顯著降低(均P<0.05，圖4B)。TUNEL染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量增加；與過表達(dá)對(duì)照組相比，Mirt2過表達(dá)組的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少(均P<0.05，圖4C、4D)。這些結(jié)果表明過表達(dá)Mirt2可以提高心肌細(xì)胞活力，保護(hù)心肌細(xì)胞避免缺氧復(fù)氧損傷。

A:心肌細(xì)胞活力;B:Caspase-3活性;C、D:心肌細(xì)胞凋亡；1：對(duì)照組；2：缺氧復(fù)氧組；3：過表達(dá)對(duì)照組；4：Mirt2過表達(dá)組；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與過表達(dá)對(duì)照組比較，#P<0.05圖4 Mirt2過表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞活力和凋亡的影響Fig.4 Effect of Mirt2 overexpression on the viability and apoptosis of hypoxia-reoxygenation-induced cardiomyocytes

2.5 過表達(dá)Mirt2對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞中Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白顯著增加，與過表達(dá)對(duì)照組相比，過表達(dá)Mirt2減少了Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)(均P<0.05，圖5)。以上結(jié)果表明過表達(dá)Mirt2可以減少缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞的活力。

1：對(duì)照組；2：缺氧復(fù)氧組；3：過表達(dá)對(duì)照組；4：Mirt2過表達(dá)組；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與過表達(dá)對(duì)照組比較，#P<0.05圖5 Mirt2過表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Mirt2 overexpression on apoptosis proteins in hypoxia-reoxygenation-induced cardiomyocytes

2.6 過表達(dá)Mirt2對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中MKP-1/JNK通路的影響

Western blot蛋白檢測結(jié)果顯示，t-JNK、t-c-Jun的表達(dá)在各組之間無差異。與對(duì)照組相比，H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞中MKP-1蛋白表達(dá)顯著減少，p-JNK、p-c-Jun蛋白表達(dá)顯著增加；與過表達(dá)對(duì)照組相比，過表達(dá)Mirt2增加了MKP-1蛋白表達(dá)，減少了p-JNK、p-c-Jun的蛋白表達(dá)(均P<0.05，圖6)。以上結(jié)果表明過表達(dá)Mirt2可能通過影響MKP-1/JNK通路在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

1：對(duì)照組；2：缺氧復(fù)氧組；3：過表達(dá)對(duì)照組；4：Mirt2過表達(dá)組；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與過表達(dá)對(duì)照組比較，#P<0.05圖6 Mirt2過表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡蛋白的影響Fig.6 Effect of Mirt2 overexpression on apoptosis proteins in hypoxia-reoxygenation-induced cardiomyocytes

3 討論

急性心肌梗死(AMI)是一種常見的致死性疾病，威脅著全球人民的生命健康[13]。及時(shí)再灌注是搶救缺血心肌的關(guān)鍵[14]。盡管再灌注可以保護(hù)缺血心肌免受不可避免的死亡，但它有副作用，造成缺血/再灌注(I/R)損傷。最近研究發(fā)現(xiàn)LncRNA參與缺血/再灌注的心肌細(xì)胞損傷過程[15-16]。因此，需要進(jìn)一步探究LncRNA與缺血/再灌注心肌細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制。

炎癥反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及細(xì)胞因子、趨化因子、血管生成因子和其他介質(zhì)的協(xié)同作用[17]。缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活有關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可刺激多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8[18-19]。因此，限制這些炎癥介質(zhì)對(duì)治療心肌缺血再灌注可能是有益的。我們研究發(fā)現(xiàn)，H9C2心肌細(xì)胞在缺氧復(fù)氧條件下，IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)和濃度顯著增加，與過表達(dá)對(duì)照組相比，Mirt2過表達(dá)可以顯著減少炎性因子IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)和釋放。因此，過表達(dá)Mirt2可以抑制炎癥反應(yīng)，在缺血再灌注中發(fā)揮保護(hù)作用。

心肌損傷后心肌細(xì)胞凋亡是一個(gè)與缺氧復(fù)氧相關(guān)的持續(xù)的動(dòng)態(tài)過程[20]。減少心肌細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是治療心肌缺血再灌注損傷的有效治療策略[21]。在我們的研究中，過表達(dá)Mirt2增加了缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的活性，減少了心肌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，過表達(dá)Mirt2對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)也產(chǎn)生影響。過表達(dá)Mirt2減少了Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明過表達(dá)Mirt2可以減少缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡蛋白，保護(hù)細(xì)胞的活力。

MKP-1是雙特異性磷酸酶的成員，對(duì)ERK1/2、JNK和p38 MAPK活性負(fù)調(diào)控[22]。據(jù)報(bào)道，它參與調(diào)節(jié)LPS反應(yīng)，并抑制促炎性細(xì)胞因子的分泌[23]。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-101可以抑制MKP-1的表達(dá)以延長巨噬細(xì)胞中MAPKs的激活[24]。此外，JNK被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的MKP-1的產(chǎn)生[25]。Kim等[26]發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺通過激活MKP-1和抑制LPS處理的HDPCs中的NF-κB和MAPK途徑發(fā)揮抗炎作用。眾所周知，MKP-1/JNK通路在細(xì)胞增殖、活性和凋亡的生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)有研究報(bào)道其與炎癥反應(yīng)也存在密切關(guān)系[27]。我們研究發(fā)現(xiàn)H9C2心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞中MKP-1蛋白表達(dá)顯著減少，p-JNK、p-c-Jun的蛋白顯著增加，與過表達(dá)對(duì)照組相比，過表達(dá)Mirt2增加了MKP-1蛋白表達(dá)和減少了p-JNK、p-c-Jun的蛋白表達(dá)。因此，Mirt2在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷中通過MKP-1/JNK通路發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA Mirt2參與心肌缺氧復(fù)氧損傷過程，發(fā)揮抗炎癥和保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。因此，調(diào)控Mirt2表達(dá)可以在一定程度上為心肌缺血再灌注損傷提供新的治療策略。