陳敏氡 王彬 劉建汀 葉新如 曾美娟 朱海生 溫慶放 康玉妹

摘要?[目的]通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建絲瓜LcPPO1基因編輯載體。[方法]根據(jù)前期已經(jīng)克隆得到的LcPPO1基因序列，設計2個sgRNA靶位點序列，退火制備sgRNA雙鏈，分別與線性PCA1301-Cas9載體連接獲得2個重組載體，將重組載體轉化DH5α感受態(tài)細胞，再對其進行PCR鑒定及測序比對分析。[結果]2個sgRNA靶位點序列已經(jīng)分別準確地連入PCA1301-Cas9載體，插入序列無突變。[結論]成功構建了絲瓜LcPPO1基因編輯載體PCA1301-Cas9-sgRNA1和PCA1301-Cas9-sgRNA2，為后續(xù)研究絲瓜LcPPO1基因功能奠定了基礎。

關鍵詞?絲瓜;LcPPO1基因;CRISPR/Cas9技術;基因編輯

中圖分類號?S188?文獻標識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）03-0105-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.028

Abstract?[Objective]LcPPO1?gene?editing?vector?for?luffa?was?constructed?by?CRISPR/Cas9?system.?[Method]Based?on?the?sequence?of?LcPPO1?gene?cloned?in?previous?stage，?two?sgRNA?target?sequences?were?designed，?and?the?sgRNA?double?strand?was?prepared?by?annealing.Then?the?sgRNA?double?strands?were?connected?with?the?linear?PCA1301Cas9?vector?to?obtain?two?recombinant?vectors，?respectively.?The?recombinant?vectors?were?transformed?into?E.coli?DH5α，?and?then?identified?by?PCR?and?sequenced.?[Result]Two?sgRNA?target?sequences?were?accurately?linked?into?the?PCA1301Cas9?vector，?respectively，?and?the?insertion?sequence?had?no?mutation.?[Conclusion]Two?LcPPO1?gene?editing?vectors?for?luffa，?PCA1301Cas9sgRNA1?and?PCA1301Cas9sgRNA2，?were?successfully?constructed，?which?laid?a?foundation?for?further?study?on?the?function?of?LcPPO1?gene?in?luffa.

Key?words?Luffa;LcPPO1?gene;CRISPR/Cas9?technique;Gene?editing

絲瓜為葫蘆科（Cucurbitaeeae）絲瓜屬（Luffa?Mill.）一年生攀援藤本植物，起源于印度，在東亞地區(qū)被廣泛種植，我國各地也均有大面積栽培，是我國重要的蔬菜品種之一[1-2]。絲瓜主要有普通絲瓜[Luffa?cylindrica（L.）Roem.]和有棱絲瓜[Luffa?acutangula（L.）]兩類栽培種，我國大部分地區(qū)以栽培普通絲瓜為主，僅廣西、廣東及海南省等華南地區(qū)種植有棱絲瓜[3]。普通絲瓜在儲藏、運輸、加工和烹飪過程中果肉和果汁容易產(chǎn)生褐變，極大降低了貯藏加工性能，嚴重影響絲瓜產(chǎn)品的營養(yǎng)品質和商品價值，造成了巨大的經(jīng)濟損失。闡明絲瓜褐變機理并控制褐變的發(fā)生已成為絲瓜育種及其采后貯藏保鮮的研究重點[3-6]。

研究發(fā)現(xiàn)，普通絲瓜的褐變屬于酶促褐變，褐變的主要原因是細胞內(nèi)酚類物質在多酚氧化酶（PPO）的催化下氧化形成醌，醌聚合形成黑色或褐色沉淀[7-8]。我國臺灣的幾個學者對絲瓜褐變的生理機制進行了探討，證實絲瓜的褐變主要是PPO酶引起的酶促褐變，PPO酶的含量和活性與褐變具有直接關系[9-10]。課題組前期通過轉錄組測序和RT-PCR方法獲得了3個絲瓜PPO家族基因（LcPPO1、LcPPO2和LcPPO3），分析顯示LcPPO家族基因的表達與絲瓜褐變關系密切，其中LcPPO1、LcPPO2在普通絲瓜果肉褐變過程中發(fā)揮著重要作用[11]。通過對絲瓜LcPPO家族基因的功能驗證，探究其在果實褐變中的調(diào)控作用，可為普通絲瓜品質改良和遺傳育種提供科學依據(jù)。

CRISPR/Cas9（clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeats/CRISPR）（CRISPRassociated?proteins?9，Cas9）基因編輯系統(tǒng)是近些年來人們驗證特定基因功能的一種新手段[12]。其原理是crRNA與tracrRNA通過堿基配對結合形成sgRNA，引導Cas9蛋白在與crRNA配對靶位點處形成雙鏈斷裂（doublestranded?DNA?breaks，DSBs），之后細胞可以通過非同源性末端接合（nonhomologous?end?jouning，NHEJ）修復機制實現(xiàn)基因組特定位點的DNA插入、缺失、堿基突變或修飾，從而使基因發(fā)生移碼突變[13]。與其他基因組編輯技術相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的操作性更高，突變效率更高，可輕松實現(xiàn)對目標基因的敲除、替換和定點突變等操作，而且容易在第一代得到純合的突變體[14]。目前，植物?CRISPR/Cas9?系統(tǒng)日趨完善，已經(jīng)在擬南芥[15]、煙草[16]、番茄[17]和玉米[18]等多個物種中成功實現(xiàn)了定點基因組編輯。然而迄今為止，CRISPR/Cas9基因編輯技術在絲瓜基因功能研究中的應用鮮見報道。該研究根據(jù)前期已經(jīng)克隆得到的絲瓜LcPPO1基因序列，設計2個sgRNA靶位點序列，構建2個LcPPO1基因CRISPR/Cas9基因編輯載體，以期為接下來的遺傳轉化及LcPPO1基因的功能研究奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?質粒與菌株。

植物CRISPR/Cas9基因編輯載體為pCA1301-Cas9，由南京農(nóng)業(yè)大學郭世榮課題組饋贈;所用菌株為大腸桿菌DH-5α，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2?主要酶及試劑。

多功能DNA純化回收試劑盒、Bbs?I和T4?DNA連接酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司;T3?Super?PCR?Mix購自北京擎科生物科技有限公司;DL2000?DNA?Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2?方法

1.2.1?sgRNA靶位點序列的設計與引物合成。

使用CRISPR?Primer?Designer?V1.1.2設計工具，在LcPPO1基因外顯子序列尋找Cas9潛在的靶向位點，根據(jù)靶位點的位置及GC含量，篩選出2個合適的打靶位點，分別為LcPPO1-sgRNA1和LcPPO1-sgRNA2。根據(jù)該靶點得到相應引物，并在引物上添加酶切識別序列，由鉑尚生物技術（上海）有限公司合成，引物序列見表?1。

1.2.2?pCA1301-Cas9-sgRNA重組載體的構建。

1.2.2.1?pCA1301-Cas9載體的酶切及回收。

使用限制性內(nèi)切酶Bbs?I對pCA1301-Cas9載體進行酶切，反應體系為10×buffer?5?μL，Bbs?I酶1?μL，pCA1301-Cas9質粒2?μL，加水補至50?μL。使用金屬浴37?℃酶切4?h，酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶，經(jīng)多功能DNA純化回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。

1.2.2.2?sgRNA引物退火。

將sgRNA寡核苷酸單鏈以逐步降溫的方法退火成雙鏈，程序如下：95?℃5?min;95?℃1?min，-1?℃/循環(huán)，40個循環(huán);55?℃30?min;55?℃1?min，-1?℃/循環(huán)，22個循環(huán);4?℃保持備用。

1.2.2.3?T4連接。

使用T4?DNA連接酶連接酶切后的載體與退火形成雙鏈產(chǎn)物，反應體系為5×T4?DNA?Ligase?buffer?2?μL，酶切質粒?2?μL，雙鏈產(chǎn)物?3?μL，T4?DNA?Ligase?1?μL，加水補至10?μL;37?℃連接2?h。

1.2.2.4?轉化。

在10?μL的連接產(chǎn)物中加入DH5α感受態(tài)細胞至100?μL?輕輕混勻，冰水浴放置30?min，42?℃水浴中熱激45?s，迅速移到冰中放置5?min，加入600?μL?LB培養(yǎng)基，37?℃振蕩培養(yǎng)2?h，取100?μL菌液涂到LB（含卡那抗性）平板，倒置平板于37?℃培養(yǎng)12～16?h。

1.2.2.5?重組載體的鑒定。

挑取單菌落進行菌液PCR鑒定及測序。PCR鑒定使用通用引物M13F與sgRNA1-F和sgRNA2-F。反應體系為T3?Super?PCR?Mix?10?μL，引物各1.5?μL，菌液1?μL，加水補至20?μL;PCR反應條件為94?℃預變性3?min;94?℃?1?min，60?℃?1?min，72?℃?1?min，30個循環(huán);72?℃?5?min，4?℃保存。對PCR產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，取陽性的重組載體送測序公司測序。

2?結果與分析

2.1?靶向LcPPO1的sgRNA設計

應用CRISPR?Primer?Designer?V1.1.2設計工具，在LcPPO1基因外顯子序列找到2個合適的sgRNA序列，分別為LcPPO1-sgRNA1：5′-CTTATTTCGTCCCACTTTTC-3′;LcPPO1-sgRNA2：5′-CGAAGCAGAAAGTTTCTCAT-3′。由圖1可知，LcPPO1-sgRNA1位于LcPPO1?CDS序列的55?bp處，LcPPO1-sgRNA2位于LcPPO1?CDS序列的105?bp處，2個sgRNA序列均為20?bp，GC含量達40%，并包含PAM標識位點。

2.2?載體pCA1301-?Cas9的酶切

載體pCA1301-Cas9大小為14?847?bp，用限制性內(nèi)切酶Bbs?I可酶切成大小為20和14?827?bp的2個片段，如圖2所示，A、B為pCA1301-Cas9載體;C為Bbs?I酶切后的線性載體，A、B和C的片段差異很小，D為未加質粒的空對照，沒有跑出條帶，符合預期結果，表明載體pCA1301-Cas9酶切成功。

2.3?重組載體pCA1301-Cas9-sgRNA的構建

重組載體pCA1301-Cas9-sgRNA的構建流程如圖3所示，2個sgRNA寡核苷酸單鏈以逐步降溫的方法退火形成雙鏈[圖3A（1）和圖3A（2）]，接著利用限制性內(nèi)切酶Bbs?I切去pCA1301-Cas9載體中的一小部分（圖3B中陰影部分），從而獲得線性載體，由于限制性內(nèi)切酶Bbs?I本身只需識別序列的一端就可以進行酶切，所以該研究利用1個內(nèi)切酶就能完成雙酶切，最后利用T4連接酶將A1和A2序列分別與pCA1301-Cas9線性載體連接，獲得重組載體pCA1301-?Cas9-sgRNA1和pCA1301-?Cas9-sgRNA2（圖3C）。

2.4?重組載體pCA1301-Cas9-sgRNA的PCR鑒定結果

以M13F和sgRNA1-F為引物對重組載體pCA1301-Cas9-sgRNA1進行菌液PCR鑒定，以M13F與sgRNA2-F為引物對重組載體pCA1301-Cas9-sgRNA2進行菌液PCR鑒定。擴增得到的目的片段（圖4）均在250?bp左右，與預期條帶大小一致，說明2個sgRNA靶位點序列已經(jīng)分別準確地連入pCA1301-Cas9載體，然后將陽性克隆菌液送至公司進行測序，結果顯示插入片段與設計的序列匹配一致，無突變（圖5），表明2個靶向LcPPO1基因的?CRISPR/Cas9基因編輯載體構建成功。

3?討論

CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種新興起的基因定點編輯技術，它是基于細菌獲得性免疫系統(tǒng)原理改造而成的一種全新的人工核酸酶系統(tǒng)，因其操作簡單、編輯高效、成本低廉，已被廣泛應用于多種農(nóng)作物的基因功能研究[19]。CRISPR/Cas系統(tǒng)包括?CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/C2c1和CRISPR/C2c2等亞類型，其中應用最多的是CRISPR/Cas9[19]。然而在葫蘆科作物中一直存在再生成苗率低、遺傳轉化困難等問題，所以一定程度上影響到該技術的利用。近幾年，只在黃瓜和甜瓜中有CRISPR/Cas9技術應用的研究報道。Chandrasekaran等[20]通過改進CRISPR/Cas9技術制造出非轉基因全雌性黃瓜。戚晶晶[21]利用CRISPR/Cas9技術創(chuàng)制出矮生黃瓜株系。王丹等[22]采用CRISPR/Cas9技術編輯了新疆甜瓜全緣葉基因PLL。王雪等[23]構建了甜瓜ACC合成酶基因CRISPR-Cas9表達載體。該研究以絲瓜為材料，構建了LcPPO1基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體，填補了絲瓜在基因編輯研究方面的空缺，同時也為接下來的遺傳轉化及基因功能研究奠定了基礎。

在CRISPR/Cas9基因編輯技術中，sgRNA的設計至關重要，既要考慮切割效率，又要考慮特異性。靶位點的選擇與切割效率密切相關，應該盡量避免靶向基因的N端或C端以及靶向5′和3′非編碼區(qū)。sgRNA序列的長度決定特異性，一般應為20?nt左右。有研究顯示，小于20?nt的短sgRNA，可以在不犧牲靶基因組編輯效率的情況下，減少脫靶位點突變多達5?000倍或更多[24]。該研究按照sgRNA的設計原則，在LcPPO1基因編碼區(qū)序列找到了2個合適的sgRNA序列，2個sgRNA序列均為20?nt，GC含量達40%，包含PAM標識位點，并成功構建了2個靶向LcPPO1的CRISPR/Cas9基因編輯載體，為絲瓜其他基因靶向的CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構建提供了借鑒方法。下一步的工作是通過根癌農(nóng)桿菌的介導將CRISPR/Cas9基因組編輯載體轉入絲瓜，獲得轉基因植株，驗證CRISPR/Cas9基因組編輯載體的有效性。

該研究所構建的2個重組載體均為單靶點CRISPR/Cas9基因編輯載體。通常情況下單個sgRNA只能靶向基因的1個位點，敲除率不穩(wěn)定且偏低，而多個sgRNA靶向同一基因的不同位點，不僅能夠提高基因突變的頻率，還能造成較大片段的缺失突變。汪秉琨等[25]構建了Wx基因雙靶點CRISPR/Cas9表達載體pGK03-Wx-gRNA，在T0、T1和T2代水稻株系中得到了多個位點突變的個體。胡春華等[26]利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶點載體系統(tǒng)，構建了針對香蕉MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-gRNA基因編輯載體，成功在香蕉體內(nèi)實現(xiàn)了對內(nèi)源MaPDS的定點敲除，獲得了基因定點敲除的突變體株系。在后續(xù)的研究中如有必要可以對現(xiàn)有載體進行改進，考慮構建多靶點基因編輯載體。另外，課題組在前期的研究中已獲得與絲瓜褐變相關的基因全長序列15條，包括11條PPO、PAL、POD、CAT和SOD家族基因和4條WRKY轉錄因子家族基因[11，27-34]。還可以利用CRISPR/Cas9技術進行多基因位點的同時編輯，從而進一步提高基因編輯的效率，獲得更多的突變個體。

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