廖金花 王 興 彭雙鳳 凌 利 田 鑫 韋祖猛 邵 婧 李 林*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006; 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

2019年末以來(lái)，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)逐漸在全國(guó)乃至全球爆發(fā)，引起國(guó)內(nèi)外的高度重視，而中醫(yī)藥在COVID-19的治療中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。COVID-19屬于中醫(yī)學(xué)“疫”病范疇[1]，病因以“濕”為主，可稱之為“濕毒疫”，病位以上焦為主[2]。散寒除濕抗毒方為國(guó)醫(yī)大師伍炳彩的自擬方，被納入到“江西省新型冠狀病毒肺炎中醫(yī)藥防治方案(試行第三版)”(以下簡(jiǎn)稱江西方案)中，作為治療寒濕郁肺證的推薦方，在江西省的疫情防治中取得了良好的效果[3]。

寒濕郁肺證是由于疫毒濕寒與伏燥搏結(jié)所致[4]；國(guó)醫(yī)大師伍炳彩以“寒溫一統(tǒng)”思想為指導(dǎo)，以《傷寒論》-麻黃加術(shù)湯合《溫病條辨》-杏蘇散加減而成，起到散寒祛濕，理肺化痰的功效。方中麻黃為君，開(kāi)腠理、透毛竅，宣肺平喘；桂枝功效有三：一則解肌發(fā)表，助君藥解表逐邪，二則溫通血脈，暢行營(yíng)陰，三則化氣行水以利寒濕；白術(shù)“主風(fēng)寒濕痹”(《神農(nóng)本草經(jīng)》)，長(zhǎng)于健脾祛濕，配麻黃以發(fā)汗祛濕；杏仁降氣平喘、蘇子降氣化痰、止咳平喘，杏、蘇與麻黃相伍，一宣一降，以助肺氣之宣降；前胡降氣化痰、桔梗與枳殼配伍宣降肺氣，既疏理胸膈氣機(jī)，又化痰止咳祛邪，三藥合用，氣順津布則痰消；陳皮、半夏行氣燥濕化痰，以上共為臣藥。茯苓健脾以杜生痰之源；生姜、大棗滋脾行津，調(diào)和脾胃；炙甘草益氣和中，助正達(dá)邪，緩和藥性，防溫燥之麻、桂辛散太過(guò)而傷元?dú)庵祝鞘顾幎孀羲幹谩ＶT藥合用，邪正兼顧，共奏散寒除濕，宣降肺氣，理肺化痰之功，為散寒除濕抗毒之方劑。

文章通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析散寒除濕抗毒方的潛在有效化學(xué)成分、治療靶點(diǎn)及相關(guān)通路，為本方治療COVID-19提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，亦為本方更好的在國(guó)際抗疫中發(fā)揮積極作用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 篩選與獲取散寒除濕抗毒方藥物成分 在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫(kù)據(jù)庫(kù)中分別輸入散寒除濕抗毒方全方生麻黃、杏仁、桂枝、炙甘草、炒白術(shù)、紫蘇、法半夏、陳皮、前胡、桔梗、枳殼、茯苓、生姜、大棗，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性指數(shù)(DL)≥0.18為條件進(jìn)行篩選，獲得14味中藥潛在的有效成分。

1.2 收集散寒除濕抗毒方對(duì)應(yīng)靶點(diǎn) 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)上述篩選出的散寒除濕抗毒方中14味中藥潛在的有效成分預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)。

1.3 獲取COVID-19疾病靶點(diǎn) 分別在GeneCard(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)以“Coronavirusdisease 2019”和“coronavirus”為關(guān)鍵詞，得到與COVID-19疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.4 獲取潛在作用靶點(diǎn) 利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢散寒除濕抗毒方可能的作用靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名，將其基因名和1.3獲取的疾病靶點(diǎn)基因名分別錄入到Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，制作韋恩圖，獲得交集靶點(diǎn)基因名，作為潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖 將中藥化學(xué)成分的靶點(diǎn)中與潛在作用靶點(diǎn)相合部分，以及“1.4”所得的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer功能對(duì)藥物中的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)的大小代表度(degree)值的大小。

1.6 構(gòu)建清熱化濕抗毒方對(duì)COVID-19疾病的作用靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖 將獲得的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(https://string-db.org/cgi/input.pl)，選擇物種為Homosapiens進(jìn)行分析，獲得蛋白相互作用關(guān)系表，將蛋白相互作用表導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)，其中節(jié)點(diǎn)的大小、顏色的深淺變化代表度值的大小，并根據(jù)節(jié)點(diǎn)的度值篩選出核心作用靶點(diǎn)。

1.7 GO和KEGG富集分析 通過(guò)Metascape(https://metascape.org/)基因注釋及分析平臺(tái)對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，得到GO(Geneontology)和KEGG(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)富集分析的柱狀圖，并進(jìn)行分層聚類，預(yù)測(cè)散寒除濕抗毒方化學(xué)成分主要作用靶點(diǎn)和潛在生物活動(dòng)機(jī)制。為了進(jìn)一步獲得相關(guān)生物活動(dòng)之間的關(guān)系，運(yùn)用Metascape對(duì)GO和KEGG富集通路進(jìn)行聚類分析，獲取散寒除濕抗毒方治療COVID-19最可能的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 中藥活性化合物及靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以O(shè)B≥30%、DL≥0.18篩選后得到散寒除濕抗毒方活性化合物共266個(gè)，其中白術(shù)7個(gè)、半夏13個(gè)、陳皮5個(gè)、大棗29個(gè)、茯苓15個(gè)、甘草92個(gè)、桂枝7個(gè)、桔梗7個(gè)、杏仁19個(gè)、麻黃23個(gè)、前胡25個(gè)、生姜5個(gè)、枳殼5個(gè)、紫蘇14個(gè)；通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取中藥成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，其中白術(shù)23個(gè)、半夏172個(gè)、陳皮30個(gè)、大棗435個(gè)、茯苓30個(gè)、甘草1769個(gè)、桂枝74個(gè)、桔梗92個(gè)、杏仁207個(gè)、麻黃498個(gè)、前胡373個(gè)、生姜75個(gè)、枳殼123個(gè)、紫蘇151個(gè)，去掉重復(fù)項(xiàng)后共289個(gè)。

2.2 潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 根據(jù)GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到COVID-19的疾病靶點(diǎn)355個(gè)，在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)輸入藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)，繪制韋恩圖(如圖1所示)，兩者交集部分為潛在作用靶點(diǎn)共59個(gè)。

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將散寒除濕抗毒方潛在的有效成分靶點(diǎn)與59個(gè)潛在作用靶點(diǎn)輸入Cytoscape軟件，篩除與靶點(diǎn)無(wú)交集的孤立成分，繪制藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(如圖2所示)。節(jié)點(diǎn)度值(Degree)>15(3倍中位數(shù))的中藥潛在有效成分有7種(詳見(jiàn)表1)，分別為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、山柰酚、川陳皮素、(+)兒茶素，Degree>40的潛在作用靶點(diǎn)有14個(gè)，分別為MAPK3、TNF、IL6、TP53、CASP3、MAPK8、ALB、MAPK1、IL10、IL1B、PTGS2、CXCL8、CCL2、FOS；從表1中發(fā)現(xiàn)大部分為多味中藥的共有化學(xué)成分，且每種成分與多個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)，一個(gè)靶點(diǎn)又可對(duì)應(yīng)多種成分，體現(xiàn)了散寒除濕抗毒方多味中藥可共同作用于同一靶點(diǎn)，每味中藥又可作用于多個(gè)靶點(diǎn)的干預(yù)特點(diǎn)，能有效干預(yù)COVID-19的多靶點(diǎn)，達(dá)到較好的治療效果。

表1 Degree>10的藥物主要化學(xué)成分信息

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將59個(gè)潛在作用靶點(diǎn)錄入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系信息表，使用Cytoscape軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系信息表進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(如圖3所示)。Degree>32.5(中位數(shù))的靶點(diǎn)基因有29個(gè)，與2.3中Degree>40的潛在作用靶點(diǎn)相互映射，取交集得到潛在核心靶點(diǎn)IL6、TNF、CASP3、MAPK、PPARG，推測(cè)散寒除濕抗毒方可能主要通過(guò)以上5個(gè)靶點(diǎn)對(duì)COVID-19進(jìn)行干預(yù)治療。

為了進(jìn)一步探討這些潛在靶點(diǎn)之間相互作用的生物過(guò)程，運(yùn)用Metascape以MCODE算法識(shí)別靶點(diǎn)之間最密切的生物過(guò)程，收集P<0.01，最小計(jì)數(shù)為3和富集因子>1.5(富集因子是觀察到的計(jì)數(shù)與偶然期望的計(jì)數(shù)之比)的術(shù)語(yǔ)，并根據(jù)其成分靶點(diǎn)之間相互關(guān)系的密切程度得到前3個(gè)具有豐富生物過(guò)程的核心富集模塊，進(jìn)行富集分析后按P值劃分，選取3個(gè)最佳功能描述(表2)，圖4中左上核心富集模塊主要涉及乙型肝炎、細(xì)胞凋亡和弓形蟲(chóng)病，右上核心富集模塊主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、癌癥的途徑和鞘脂信號(hào)通路，左下核心富集模塊主要涉及趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用和IL-17信號(hào)通路。

表2 核心富集模塊功能描述

2.5 富集分析 為探討上述59個(gè)交集靶點(diǎn)在治療COVID-19中的作用機(jī)制，運(yùn)用Metascape對(duì)59個(gè)的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG(如圖5所示)和GO(如圖6所示)富集分析，KEGG分析得到206條通路途徑，GO分析得到419分子功能、4435個(gè)生物學(xué)過(guò)程、323個(gè)細(xì)胞組分，KEGG取前20條通路，GO 分子功能、生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞組分分別取前10個(gè)作為重點(diǎn)展示。主要涉及的KEGG富集通路主要涉及：糖尿病并發(fā)癥的年齡-憤怒信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路；GO生物學(xué)過(guò)程：細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、凋亡信號(hào)通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附等；GO細(xì)胞組成：膜筏、Bcl-2家族蛋白復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等；GO分子功能：細(xì)胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、BH3域綁定、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合等。

3 討論

《說(shuō)文解字》中提到“疫者，民皆病也”，疫病具有強(qiáng)烈的傳染性，本次COVID-19亦屬于中醫(yī)“疫”病范疇[5]。針對(duì)此次疫情，仝小林院士等[6]通過(guò)實(shí)際調(diào)查，初步提出本病歸屬于“寒濕疫”，認(rèn)為“寒濕”是COVID-19爆發(fā)的關(guān)鍵因素。國(guó)醫(yī)大師伍炳彩認(rèn)為對(duì)于COVID-19寒濕兼燥者，當(dāng)以麻黃加術(shù)湯去寒濕，合用杏蘇散治涼燥，故自擬散寒除濕抗毒方用于治療寒濕兼燥的新冠肺炎[7]，現(xiàn)已被納入到江西方案中作為推薦方，為新冠肺炎治療提供了江西方案。

本研究共篩選出散寒除濕抗毒方治療COVID-19的148個(gè)成分，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2通過(guò)中位Degree值篩選得到7個(gè)主要潛在成分，其中6種為黃酮類化合物，分別為槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、山柰酚、川陳皮素，另1種為黃烷衍生物(+)兒茶素。散寒除濕抗毒方與COVID-19有59個(gè)交集靶點(diǎn)，通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)與“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)”相映射發(fā)現(xiàn)本方可能主要通過(guò)作用于IL6、TNF、CASP3、MAPK、PPARG等潛在核心靶點(diǎn)，改善新冠肺炎患者臨床癥狀，從而達(dá)到干預(yù)COVID-19的效果。

3.1 散寒除濕抗毒方通過(guò)調(diào)節(jié)免疫-炎癥反應(yīng)干預(yù)COVID-19 COVID-19入侵人體后可誘導(dǎo)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致彌漫性肺損傷、ARDS、多器官衰竭甚至死亡。因此，調(diào)控免疫-炎癥反應(yīng)是治療COVID-19，改善臨床癥狀的途徑之一[8]；涉及的化合物有：槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、山柰酚、川陳皮素；涉及的靶點(diǎn)有：PTGS2、TNF、IL6、IL-10。

有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能抑制巨噬細(xì)胞分泌PTGS2，刺激巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟，成為活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)吞噬功能，從而調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)[9]；又有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以抑制單純皰疹病毒1型感染誘導(dǎo)的IRF-3和NF-JB的激活，減少RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子：腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[10]。β-谷甾醇可通過(guò)下調(diào)IL6和TNF-α水平，改善炎癥反應(yīng)[11]；柚皮素能通過(guò)抑制環(huán)氧合酶(COX)，減少前列腺素PGE2的合成，減少炎性因子的釋放，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)[12]；山柰酚可減少促炎細(xì)胞因子(IL-12和TNF-α)的釋放，并通過(guò)抑制IKK的磷酸化和IKBα的降解來(lái)調(diào)節(jié)NF-KB的水平，從而改善CPL介導(dǎo)的炎癥[13]；川陳皮素能抑制腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1炎癥因子MCP-1和IL6的表達(dá)水平，減輕炎癥反應(yīng)[14]；(+)兒茶素中所含的要表沒(méi)食子兒茶酚沒(méi)食子酸(EGCG)及表沒(méi)食子兒茶酚(EGC)在MDCK細(xì)胞中對(duì)流感病毒的復(fù)制具有抑制活性，其中EGCG可能與病毒粘合，防止病毒入侵MDCK細(xì)胞，間接減輕炎癥反應(yīng)[15]。

3.2 散寒除濕抗毒方可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡干預(yù)COVID-19 細(xì)胞凋亡主要有三種途徑：線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。冠狀病毒主要通過(guò)外在途徑(死亡受體通路)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。散寒除濕抗毒方可通過(guò)PARP1、CASP3、CASP8、MAPK1、MAPK3、MAPK8、TNF、TP53等靶點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)：SADS-CoV感染時(shí)細(xì)胞可出現(xiàn)明顯的CPE，顯微鏡下可見(jiàn)凋亡細(xì)胞胞質(zhì)固縮和細(xì)胞膜融合、染色質(zhì)凝縮并附在核膜周邊，形成凋亡小體[16]。Fas/CD95 是細(xì)胞膜上主要的死亡受體，許多冠狀病毒的S蛋白可誘導(dǎo)激活細(xì)胞膜死亡受體，最終引起由 Caspase 級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[17]。SARS-CoV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡依賴于Caspase家族，Caspase抑制劑過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡[18]。木犀草素既能通過(guò)調(diào)控CASP8、CASP3的表達(dá)干預(yù)流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18]，又能通過(guò)降低過(guò)氧化物酶活性、TNF-α和IL6水平，以及提高IL-4和IL-10水平，抑制NF-KB，從而抑制細(xì)胞凋亡途徑[18]；新冠患者心肌細(xì)胞或激活后白細(xì)胞釋放的TNF、IL6具有啟動(dòng)凋亡程序的作用[23]。散寒除濕抗毒方可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程，進(jìn)而對(duì)COVID-19進(jìn)行干預(yù)。

3.3 散寒除濕抗毒方可能通過(guò)鞘脂類信號(hào)通路干預(yù)COVID-19 鞘脂類通路激活,可使血管通透性增加,表面活性劑鈍化,肺泡上皮細(xì)胞凋亡,誘發(fā)肺水腫[24]。散寒除濕抗毒方可通過(guò)靶點(diǎn)：BAX、BCL2、MAPK14、NOS3、PRKCA、PRKCB、MAPK1、MAPK3、MAPK8、RELA、TNF、TP53調(diào)節(jié)鞘脂類信號(hào)通路，緩解肺水腫及肺組織損傷。

國(guó)內(nèi)第一例新冠尸體解剖發(fā)現(xiàn)：右肺嚴(yán)重淤血，肺水腫，心外膜水腫。故調(diào)節(jié)血管屏障對(duì)新冠肺炎的治療具有重要的臨床意義[25-26]。而鞘脂類物質(zhì)是一種極其重要的血管生成因子和具有強(qiáng)大的血管屏障調(diào)節(jié)特性的信號(hào)介質(zhì)。鞘氨醇1-磷酸(S1P)是神經(jīng)鞘磷脂代謝產(chǎn)生的一種有生物活性的脂類，由神經(jīng)酰胺代謝產(chǎn)生，S1P已在體外被證實(shí)了具有增強(qiáng)肺血管屏障的功能[27-29]；血小板一直被認(rèn)為可以降低血管內(nèi)皮通透性，研究發(fā)現(xiàn)，S1P是人類血小板產(chǎn)生的關(guān)鍵屏障保護(hù)性介質(zhì)[30]；S1PR4和S1PR5可與Giand G12/13偶聯(lián)，通過(guò)G12/13的信號(hào)可以抑制遷移，降低內(nèi)皮屏障功能，并通過(guò)促進(jìn)GTPase Rho和Rho相關(guān)激酶(ROCK)的激活來(lái)誘導(dǎo)血管收縮；S1P還能有效減輕NOS2刺激的肺損傷[30]。散寒除濕抗毒方中的化合物山奈酚、槲皮素、木犀草素都具有調(diào)控鞘脂類信號(hào)通路的作用。

綜上可知，散寒除濕抗毒方可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫-炎癥反應(yīng)，以及通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡及鞘脂類信號(hào)通路，對(duì)COVID-19進(jìn)行干預(yù)。散寒除濕抗毒方作為國(guó)醫(yī)大師伍炳彩的自擬方，被選入“江西方案”中作為推薦方，其對(duì)于新冠肺炎的治療效果在臨床中也已經(jīng)得以證實(shí)。本研究通過(guò)對(duì)散寒除濕抗毒方的藥物潛在有效成分、潛在作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)散寒除濕抗毒方治療COVID-19的潛在作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療COVID-19提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，為后續(xù)研究及開(kāi)發(fā)院內(nèi)制劑提供參考。