程 韜 王影超 陳韋佳 萇 玲 舒 柯*

1.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550025

藜蘆在2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中系指藜蘆VeratrumnigrumL.、黑紫藜蘆Veratrumjaponicum(Baker)Loes.f.、蒙自藜蘆VeratrummengtzeanumLoes.f.及狹葉藜蘆VeratrumstenophyllumDiels的干燥根或根莖。秋季采挖，洗凈，曬干，可催吐、祛痰、殺蟲，用于中風(fēng)痰涌、風(fēng)癇癲疾、疥癬、惡瘡[1]。本次實(shí)驗(yàn)研究的藜蘆為藜蘆VeratrumnigrumL.，由貴州省食品藥品檢驗(yàn)所李楊老師鑒定，藜蘆中含有虎杖苷和白藜蘆醇，虎杖苷具有較強(qiáng)的生物活性，對(duì)心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、抗血小板聚集、改善微循環(huán)等有顯著作用，此外還能減輕多種因素造成的組織器官損傷，具有保護(hù)肝細(xì)胞，降血脂及抗脂質(zhì)過氧化等作用[2]。白藜蘆醇具有抗癌、抗菌、抗炎、抗心血管疾病、抗衰老和抗神經(jīng)退行性疾病等藥理作用[3]，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有顯微鑒別和理化鑒別，故增加TLC鑒別及虎杖苷和白藜蘆醇的含量測(cè)定對(duì)完善藜蘆的質(zhì)量控制提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器材料

1.1 儀器 ThermoFisher UItimate 3000高效液相色譜儀；梅特勒托勒多 MS202TS型電子天平(十萬分之一)；梅特勒托勒多 XP26型電子天平(百萬分之一)；KQ-500DB型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；millipore超純水機(jī)。

1.2 材料 虎杖苷對(duì)照品(111575-200502)、白藜蘆醇對(duì)照品(111535-201703)均來自中國(guó)食品藥品檢定研究院；藜蘆(批號(hào)301)采自安順市關(guān)嶺縣、藜蘆(批號(hào)302)采自安順市關(guān)嶺縣、藜蘆(批號(hào)303)采自安順市紫云縣、對(duì)照藥材由貴州省食品藥品檢驗(yàn)所李楊老師鑒定為藜蘆VeratrumnigrumL.。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純，青島海洋化工硅膠G薄層板。

2 方法與結(jié)果

2.1 藜蘆的薄層色譜鑒別方法[4]取本品粉末 1 g，加濃氨試液1.5 mL使浸潤(rùn)，放置30 min，加二氯甲烷30 mL加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取藜蘆對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5～l0 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(5∶3∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2 藜蘆的薄層色譜鑒別結(jié)果 經(jīng)過薄層色譜對(duì)溫度、濕度的方法學(xué)驗(yàn)證，圖1表明此鑒別方法分離度良好，斑點(diǎn)清晰，信息全面，用于藜蘆的薄層鑒別方法可行。

2.3 HPLC同時(shí)測(cè)定虎杖苷和白藜蘆醇的方法[5-7]

2.3.1 波長(zhǎng)選擇 分別取虎杖苷、白藜蘆醇對(duì)照品在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外波長(zhǎng)掃描，虎杖苷和白藜蘆醇均在306 nm處有較大吸收，又結(jié)合HPLC-DAD光譜圖對(duì)比，確定306 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。光譜圖如圖2所示。

2.3.2 色譜條件 色譜柱Thermo C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取虎杖苷、白藜蘆醇對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含虎杖苷10 μg、白藜蘆醇20 μg的混合溶液，搖勻，即得。

2.3.4 供試品溶液的制備 取過三號(hào)篩的粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失去重量，搖勻，0.45 μm微孔濾過，即得(實(shí)驗(yàn)全程需避光操作)。

2.3.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液注入液相色譜儀，供試品色譜中呈現(xiàn)與虎杖苷對(duì)照品、白藜蘆醇對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰。色譜圖如圖3所示。

2.3.6 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 精密吸取虎杖苷對(duì)照品(0.2004 mg/mL)和白藜蘆醇對(duì)照品(0.4056 mg/mL)各1 mL、2.5 mL、5 mL、7.5 mL、10 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得虎杖苷濃度分別為20.04 μg/mL、50.10 μg/mL、100.2 μg/mL、150.3 μg/mL、200.4 μg/mL；白藜蘆醇濃度分別為40.56 μg/mL、101.4 μg/mL、202.8 μg/mL、304.2 μg/mL、405.6 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL，按2.3.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制工作曲線，進(jìn)行回歸處理，虎杖苷回歸方程為y=462.8668x+2159.6973(r=0.9998)，白藜蘆醇回歸方程為y=525.4858x-302.5944(r=0.9999)，結(jié)果表明虎杖苷在0.2004～2.004 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，白藜蘆醇在0.4056～4.0560μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.7 精密度實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)混合照品溶液10 μL，在同一色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，虎杖苷對(duì)照品峰面積RSD%為1.0%，白藜蘆醇對(duì)照品峰面積RSD%為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取一份樣品，按2.3.4制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，分別于配制后0、3、6、18、24 h，按2.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定虎杖苷峰面積RSD%為1.7%，白藜蘆醇峰面積RSD%為1.3%，結(jié)果表明供試品溶液中虎杖苷和白藜蘆醇在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)樣品6份，按2.3.4方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，按2.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，虎杖苷平均含量為0.3701 mg/g,RSD=0.5%，白藜蘆醇平均含量0.8781 mg/g，RSD=0.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.10 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定已知含有量的樣品(虎杖苷平均含量0.3701 mg/g、白藜蘆醇平均含量0.8781 mg/g)6份，精密加入對(duì)照品虎杖苷0.240 mg，白藜蘆醇0.483 mg，按2.3.4方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，按2.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果虎杖苷和白藜蘆醇的平均回收率分別為99.6%和100.1%,RSD(n=6)分別為1.1%和0.95%，表明實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度較高，結(jié)果見表2。

表2 虎杖苷和白藜蘆醇回收率實(shí)驗(yàn)

2.3.11 耐用性試驗(yàn) 分別采用3支不同品牌的C18色譜柱waters xbridge(4.6 mm×250 mm，5 μm)、迪馬(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Thermo(4.6 mm×250 mm，5 μm)在戴安U3000高效液相色譜儀上對(duì)同一批藜蘆樣品進(jìn)行測(cè)定，精密吸取供試品溶液10 μL，按2.3.2色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果虎杖苷和白藜蘆醇的RSD%分別為2.2%、2.0%。

2.4 樣品含量測(cè)定結(jié)果 取上述3批藜蘆藥材，按2.3.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算藜蘆藥材虎杖苷和白藜蘆醇的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

根據(jù)參考文獻(xiàn)，選擇甲醇-水、乙腈-水流動(dòng)相按表1梯度洗脫表進(jìn)行洗脫，結(jié)果乙腈-水在表1梯度洗脫條件下可以使供試品目標(biāo)化合物有效分離，再選擇乙腈-1%磷酸溶液、乙腈-2%磷酸溶液、乙腈-4%磷酸溶液照表1梯度洗脫表進(jìn)行比較，結(jié)果上述各系統(tǒng)均可以使供試品目標(biāo)化合物有效分離，峰型也較理想，但因乙腈-水系統(tǒng)配制方便，成本低，毒性低，故最終選擇乙腈-水為最佳流動(dòng)相系統(tǒng)。

虎杖苷和白藜蘆醇對(duì)光照不穩(wěn)定，在進(jìn)行虎杖苷和白藜蘆醇含量測(cè)定操作時(shí)均要避光操作，如不避光操作，對(duì)照品色譜圖中會(huì)出現(xiàn)雜峰，疑為對(duì)照品在光照條件下被降解轉(zhuǎn)化為其他化合物，后續(xù)會(huì)對(duì)供試品中化合物的光照降解途徑進(jìn)行進(jìn)一步研究。

用甲醇、乙醇超聲提取1 h，甲醇效果較好；再用25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇提取，結(jié)果用50%甲醇提取溶劑提取所測(cè)得的虎杖苷和白藜蘆醇峰面積最高，含量較高，甲醇提取次之；但是在50%甲醇提取溶劑下反復(fù)進(jìn)行準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，虎杖苷的回收率滿足要求，白藜蘆醇的回收率僅為50%～60%，選用甲醇作為提取溶劑進(jìn)行準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，虎杖苷和白藜蘆醇的回收率均能達(dá)到藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)藜蘆VeratrumnigrumL.的TLC鑒別及HPLC含量測(cè)定的研究，方法可靠穩(wěn)定，簡(jiǎn)便易行，可較全面、可靠地控制藜蘆的質(zhì)量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升制定提供可靠依據(jù)。