張曉南 何雨桐 游 燕 曹紅云 普冰清 李東嫻 王京昆*

1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南 昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111；4.云南省藥品和醫(yī)療器械評(píng)審中心，云南 昆明 650106

珊瑚通竅丸是迪慶州藏醫(yī)院的院內(nèi)制劑，為傳統(tǒng)藏族驗(yàn)方，目前現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，僅有性狀、薄層鑒別、烏頭堿限量檢查以及丸劑的制劑通則檢查項(xiàng)。為提高其質(zhì)量控制水平，為其進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高進(jìn)行了探索性研究。

珊瑚通竅丸由珊瑚、柯子、獐牙菜、紅花等二十六味藥材組成，原標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有收載含量測(cè)定項(xiàng)，因此本次研究的重點(diǎn)是珊瑚通竅丸的指標(biāo)性成分含量控制研究。紅花收載于2015版《中國(guó)藥典》，味辛、微苦，性溫，歸心、肝經(jīng)。具有通經(jīng)活血、止痛散瘀之功效；可用于痛經(jīng)、經(jīng)閉、惡露不行、癥瘕痞塊、心痛胸痹、瘀滯腹痛、胸脅刺痛、跌打損傷、瘡瘍腫痛[1]。其功效與珊瑚通竅丸開(kāi)竅、通絡(luò)、止痛相通，主治與珊瑚通竅丸用于“白脈病”：神志不清，身體麻木，頭昏目眩，腦部疼痛，血壓不調(diào)，頭痛，癲癇及各種神經(jīng)性疼痛也有眾多相似之處，可以認(rèn)為紅花是珊瑚通竅丸的主要作用成分，因此選擇紅花作為指標(biāo)性成分含量控制的主要對(duì)象。

羥基紅花黃色素A是紅花黃色素中的主要成分[2]，臨床研究表明其具有抗凝血、抗氧化、預(yù)防腦缺血、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)等作用[3-4]，其可能是珊瑚通竅丸的重要有效成分，此次研究依據(jù)藥典紅花項(xiàng)下含量測(cè)定對(duì)其含量測(cè)定方法進(jìn)行探討，以期為進(jìn)一步珊瑚通竅丸功效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供前期基礎(chǔ)。

1 供試品、儀器、藥品與試藥

1.1 供試品 珊瑚通竅丸(迪慶州藏醫(yī)院制，201705-1、201705-2、201705-3)。

1.2 儀器 美國(guó)Agilent 1260高效液相色譜儀；SK8200HP型超聲波儀(上?？茖?dǎo))；AG285型電子天平(梅特勒-托利多)。

1.3 藥品與試藥 對(duì)照品羥基紅花黃色素A(批號(hào)：111637-201810，純度93.1%)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；西紅花苷-Ⅰ(批號(hào)：111588-201704 純度88.4%)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；所用流動(dòng)相乙腈、甲醇為色譜純，處理樣品的甲醇、乙醇、磷酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agela Venusil MP C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：以甲醇-乙腈-0.7%磷酸(23∶5∶72)等度洗脫，流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：403 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液的制備:取對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解成每1 mL中含羥基紅花黃色素A 0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備:取本品粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密量取25%甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min(功率300 W，頻率 40 kHz)，放冷，再稱重，以25%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.1.3 專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性 試驗(yàn)按2.1.2溶液制備方法制備供試品溶液和陰性供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣對(duì)照品、供試品、陰性供試品各10 μL。結(jié)果如圖1所示。由色譜圖可以看出供試品溶液色譜中與對(duì)照品溶液色譜中有保留時(shí)間一致的色譜峰出現(xiàn)。

2.1.4 線性關(guān)系考察精密 稱取羥基紅花黃色素A(批號(hào)：111637-201810，純度93.1%)22.52 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得對(duì)照品儲(chǔ)備液(其中羥基紅花黃色素A 0.8386 mg/ml)，精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液，稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量 10 μL，記錄峰面積，測(cè)得結(jié)果見(jiàn)表1。以含量(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=3722.39X-35.15，相關(guān)系數(shù)r=0.9995。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，羥基紅花黃色素A在0.02328～2.348 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果

2.1.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

2.1.5.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取羥基紅花黃色素A(批號(hào)：111637-201810，純度93.1%)22.52 mg 至25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為羥基紅花黃色素A 0.8386 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.5.2 加樣回收方法 精密稱取6樣品(批號(hào)：201705-1，已測(cè)羥基紅花紅色素A含量為0.088%)，每份約0.5 g，分別加入以上對(duì)照品溶液(加入量見(jiàn)表2)，按2.1.2方法同法處理，所得溶液作為供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。羥基紅花黃色素A回收率為90.67%～92.70%，能滿足要求(要求為90%～108%)[1]，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度良好。

表2 加樣回收測(cè)定結(jié)果

2.1.6 精密度試驗(yàn)

2.1.6.1 儀器精密度 取配制好的對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 L，連續(xù)進(jìn)樣6針，保留時(shí)間及峰面積的RSD值均小于2%，結(jié)果表明本法具有良好的儀器精密度。

2.1.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)(批號(hào)：201705-1)的樣品6份，按2.1.2方法制備，并按2.1.1方法測(cè)定。測(cè)得羥基紅花黃色素A平均含量為0.088%，RSD為0.71%，表明本法具有良好的重復(fù)性。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液按照2.1.1方法測(cè)定，分別于0、4、7、10、24 h進(jìn)樣，計(jì)算羥基紅花黃色素A含量，結(jié)果RSD均小于3%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.1.8 樣品測(cè)定 測(cè)定3個(gè)不同批次的樣品中的羥基紅花黃色素A含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果表

2.2 西紅花皂苷Ⅰ的含量測(cè)定

2.2.1 方法 珊瑚通竅丸的處方中含有貴細(xì)藥材西紅花，為進(jìn)一步加強(qiáng)其質(zhì)量的可控性，本次研究依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版一部 二十五味珍珠丸項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，測(cè)定了其標(biāo)志性成分西紅花皂苷Ⅰ[1]。測(cè)定方法和藥典一致，高效液相色譜儀為美國(guó)Agilent 1100型，色譜柱為：Agela Venusil MP C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)。

2.2.2 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)所得色譜圖顯示：珊瑚通竅丸中的西紅花皂苷Ⅰ在此方法下能得出分離度達(dá)到1.5，理論塔板數(shù)不低于3000的色譜峰，且陰性樣品無(wú)干擾，初步確定能滿足含量測(cè)定的要求。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表4。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果表

3 討論

藏藥制劑處方藥味常常達(dá)到20味以上，且其中含有眾多礦物藥、動(dòng)物藥和民族民間藥材的情況，含量測(cè)定指標(biāo)性成分的選擇，應(yīng)盡量與全方的功效相呼應(yīng)，優(yōu)先選擇藥理作用與處方功效接近的成分作為定量的目標(biāo)，才最有利于質(zhì)量控制手段發(fā)揮最大的實(shí)際控制作用。如何選擇含量測(cè)定的指標(biāo)性成分、所選成分和處方的功效對(duì)應(yīng)性研究成為了質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提高性研究的難點(diǎn)和重點(diǎn)，亟待加強(qiáng)研究。

在此次研究中，將羥基紅花黃色素A作為質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分就是針對(duì)以上問(wèn)題的有益嘗試，但羥基紅花黃色素A與全處方功效的對(duì)應(yīng)性推斷是基于已有文獻(xiàn)[1,3-4]，而未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，這是本次研究的一大遺憾之處，在將來(lái)的工作中會(huì)盡力完善。

由本次研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出結(jié)論：珊瑚通竅丸中的羥基紅花黃色素A能被以簡(jiǎn)便可行的方法定量測(cè)定，且陰性樣品不出現(xiàn)相應(yīng)的色譜峰，已測(cè)定的3個(gè)批次中的羥基紅花黃色素A含量基本持平，能夠反映紅花藥材投料與否和投料量的一致性，羥基紅花黃色素A可以收載為珊瑚通竅丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的含量測(cè)定項(xiàng)。

此次研究還進(jìn)行了含量測(cè)定的另一成分西紅花皂苷Ⅰ是處方中貴細(xì)藥材西紅花的標(biāo)志性成分，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)是為了防止出現(xiàn)惡意減投或不投料，可將其列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢查項(xiàng)，分析方法學(xué)驗(yàn)證研究在將來(lái)的工作中會(huì)進(jìn)一步完善。為使檢查項(xiàng)更加全面，本次研究還進(jìn)行了黃曲霉毒素的含量測(cè)定和微生物限度檢查，結(jié)果都能滿足規(guī)定。