楊延慶，王煥煥*，謝坤霞，李 健

0 引言

垂體瘤是存在于腦垂體中的一種腫瘤，大多數(shù)是良性腫瘤，部分會(huì)發(fā)展成惡性腫瘤[1]。目前，對(duì)于垂體瘤的治療方法，主要包括手術(shù)治療、藥物治療和放射治療，手術(shù)治療會(huì)引起一系列的后遺癥和并發(fā)癥，藥物治療具有一定的局限性，放射治療對(duì)垂體的功能有很大的損傷性[2]。MAPK/ERK通路是多種信號(hào)通路的核心，此通路在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用，已經(jīng)被作為抗炎、抗癌藥物的靶點(diǎn)[3-6]。目前，MAPK/ERK通路在垂體瘤細(xì)胞的發(fā)生過程中的作用尚未闡明。有報(bào)道，纖維蛋白在腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤(rùn)以及向遠(yuǎn)端組織轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用[7]。吳丹榮等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在垂體瘤的增殖和遷移中，其作用機(jī)制與NF-κB通路的活化有關(guān)。

本研究通過SB203580(MAPK/ERK抑制劑)處理垂體瘤細(xì)胞后，檢測(cè)SB203580在垂體瘤細(xì)胞纖維蛋白A以及垂體瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移以及NF-κB/MMP-9/VEGF通路中的影響，以期為研究治療垂體瘤的方法提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；Trizol、氯仿購(gòu)自Takara公司；FastKing RT kit購(gòu)自北京天根生化公司；0.25%胰酶溶液、PBS溶液、結(jié)晶紫溶液、細(xì)胞固定液、RIPA強(qiáng)蛋白裂解液購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；CCK-8試劑盒、MAPK/ERK抑制劑(SB203580)、Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天有限公司；CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax、細(xì)胞纖維蛋白A磷酸化、NF-κB、MMP-9、VEGF、β-actin和山羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millpore公司；梯度PCR儀、核酸電泳儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自Nikon公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人的垂體瘤細(xì)胞株購(gòu)自北京細(xì)胞庫(kù)(AtT20細(xì)胞株)，取出冷凍的細(xì)胞，在37 ℃的水浴鍋內(nèi)快速解凍，爭(zhēng)取在1 min內(nèi)完成，離心3 min(1 000 r/min)，在超凈臺(tái)內(nèi)棄掉細(xì)胞上清，用含有血清濃度為10%的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀至25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 SB203580最佳安全濃度的確定 待垂體瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿，用0.25%胰酶溶液消化后，將其接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待垂體瘤細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，分別加入濃度為10 mmol/L的SB203580，使其最終濃度變成5、15、20、30、40、55、65、80、100、120、140 μmol/L (每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照)，細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)48 h后，加入合適劑量的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱孵育2 h后，在酶標(biāo)儀中于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，進(jìn)行分析。

1.4 細(xì)胞增殖率的檢測(cè) 確定SB203580最佳安全濃度后，將垂體瘤細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待垂體瘤細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，加入SB203580，培養(yǎng)48 h后，加入合適劑量的CCK-8溶液，設(shè)置空白細(xì)胞作對(duì)照，在培養(yǎng)箱孵育2 h后，在酶標(biāo)儀中于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，分析細(xì)胞的增殖情況。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)垂體瘤細(xì)胞的凋亡 待垂體瘤細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，加入SB203580，設(shè)置空白細(xì)胞作對(duì)照，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)48 h后，棄掉上清，0.25%胰酶溶液消化細(xì)胞后用PBS收集細(xì)胞懸液，800 r/min離心3 min棄掉上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，重新收集細(xì)胞沉淀，加入適量的1×Binding buffer將細(xì)胞數(shù)目調(diào)至1×106個(gè)/ml，取上述適量的細(xì)胞懸液(包含細(xì)胞數(shù)目為1×105個(gè)/ml)，加入200 μl Annexin V-PE結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，混勻后避光孵育20 min，置于冰浴中，最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 RT-PCR檢測(cè)CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá) 待垂體瘤細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，加入SB203580，設(shè)置空白細(xì)胞作對(duì)照，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)48 h后，棄掉上清，0.25%胰酶消化細(xì)胞后收集細(xì)胞沉淀，加入Trizol裂解細(xì)胞沉淀，提取細(xì)胞的總RNA，用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板，β-actin作內(nèi)參，通過RT-PCR檢測(cè)不同樣品中CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)情況。反應(yīng)體系包括cDNA 0.4 μl，2×Fast qPCR Master Mixture(Green) 10 μl，上下游引物各0.4 μl，ddH2O 3.8 μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算。引物序列見表1。

表1 RT-PCR的定量引物

1.7 Western blot檢測(cè)CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax、纖維蛋白A的磷酸化水平以及NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白的表達(dá) 待垂體瘤細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，加入SB203580，設(shè)置空白細(xì)胞作對(duì)照，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)48 h后，棄掉上清，收集細(xì)胞沉淀，加入RIPA裂解液(含有PMSF)裂解細(xì)胞蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作步驟根據(jù)說明書進(jìn)行。在蛋白樣品中加入5×loading buffer于沸水中煮沸10 min后，取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，將CyclinD1、CyclinE1、p21、Bcl-2、Bax、caspase3、纖維蛋白A的磷酸化、NF-κB、MMP-9、VEGF的抗體(1∶2 000)作為一抗進(jìn)行過夜4 ℃孵育，用TBST洗膜5 min，洗3次后，用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，用TBST洗膜5 min，洗3次后，加入ECL顯色液，于凝膠成像儀中曝光拍照。

1.8 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 待垂體瘤細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，加入SB203580，設(shè)置空白細(xì)胞作對(duì)照，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)48 h后，棄掉上清，收集不同處理的細(xì)胞沉淀，用空的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，使其細(xì)胞數(shù)目變成1×103個(gè)/ml，向包含基質(zhì)膠的TranswellTM上室中接種100 μl左右的細(xì)胞懸液，上下室中加入1 ml含有血清濃度為10%的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h后，取出Transwell，甲醛固定20 min后，用結(jié)晶紫染色20 min后，PBS洗滌3次，最后于顯微鏡下進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 SB203580最佳安全濃度的確定及SB203580抑制垂體瘤細(xì)胞中纖維蛋白A的磷酸化 CCK-8法確定SB203580的最佳安全濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)SB203580濃度為55 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的活性和空細(xì)胞的活性接近，最后確定SB203580的使用濃度為55 μmol/L(圖1A)。通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SB203580處理垂體瘤細(xì)胞后，纖維蛋白A的磷酸化水平，結(jié)果顯示，SB203580組和空白組相比較，纖維蛋白A的磷酸化水平顯著下降(圖1B)，表明MAPK/ERK能夠誘導(dǎo)垂體瘤細(xì)胞的纖維蛋白A的磷酸化。

圖1 SB203580對(duì)纖維蛋白A磷酸化水平的影響注：A.CCK-8法檢測(cè)SB203580的最佳濃度；B.Western blot檢測(cè)SB203580組細(xì)胞中纖維蛋白A磷酸化的表達(dá)水平

2.2 SB203580促進(jìn)垂體瘤細(xì)胞的增殖 CCK-8法檢測(cè)垂體瘤細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，SB203580組細(xì)胞增殖情況顯著高于空白組(P<0.01)，見圖1。RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SB203580組垂體瘤細(xì)胞中CyclinD1、CyclinE1 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著高于空白組(P<0.01)，p21 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著低于空白組(P<0.01)。見圖2。

圖2 SB203580對(duì)垂體瘤細(xì)胞增殖的影響注：A.CCK-8法檢測(cè)SB203580對(duì)垂體瘤細(xì)胞增殖的影響；B.RT-PCR檢測(cè)CyclinD1、CyclinE1、p21 mRNA相對(duì)表達(dá)量；C.Western blot檢測(cè)CyclinD1、CyclinE1、p21蛋白表達(dá)。***與空白組比較，P<0.01

2.3 SB203580促進(jìn)垂體瘤細(xì)胞的凋亡 SB203580處理細(xì)胞后，首先通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)垂體瘤細(xì)胞的凋亡百分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示，SB203580組細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)顯著高于空白組(P<0.01)。RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SB203580組垂體瘤細(xì)胞中Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著低于空白組(P<0.001)，Bax mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著高于空白組(P<0.01)。見圖3。

圖3 SB203580對(duì)垂體瘤細(xì)胞凋亡的影響注：A～B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SB203580對(duì)垂體瘤細(xì)胞凋亡的影響；C.RT-PCR檢測(cè)SB203580組細(xì)胞凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)量；D.Western blot檢測(cè)SB203580組細(xì)胞凋亡因子Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。與空白組比較，***P<0.01

2.4 SB203580促進(jìn)垂體瘤細(xì)胞的遷移 TranswellTM實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組相比較，SB203580組細(xì)胞遷移情況和細(xì)胞遷移數(shù)顯著高于空白組(P<0.01)，見圖4。

圖4 TranswellTM遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SB203580對(duì)垂體瘤細(xì)胞的影響注：***與空白組比較，P<0.001

2.5 SB203580促進(jìn)垂體瘤細(xì)胞NF-κB/MMP-9/VEGF通路的發(fā)生 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SB203580組垂體瘤細(xì)胞中NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白的表達(dá)量顯著高于空白組，見圖5。

圖5 SB203580對(duì)垂體瘤細(xì)胞NF-κB、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)的影響

3 討論

垂體瘤是一種從垂體前葉和后葉及顱咽管上皮殘余細(xì)胞發(fā)生的腫瘤，垂體瘤通常發(fā)生于30歲左右，嚴(yán)重影響患者的日常生活能力[9]。探究能夠抑制垂體瘤細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞遷移能力的關(guān)鍵蛋白及研究促進(jìn)垂體瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制是目前研究的焦點(diǎn)。

MAPK/ERK信號(hào)通路是腫瘤發(fā)生中重要的基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，此通路與腫瘤細(xì)胞的增殖以及凋亡等過程密切相關(guān)[10]。有研究報(bào)道，MAPK/ERK相關(guān)抑制劑與一些腫瘤化學(xué)治療藥品相聯(lián)合，能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞達(dá)到一定的抑制作用，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，還可以減少藥物的毒性，最終減少對(duì)患者身體的損傷[11]。因此，本研究首先通過CCK-8法確定了SB203580的最佳安全使用濃度，然后用適宜濃度的SB203580處理垂體瘤細(xì)胞后，通過Western blot檢測(cè)到垂體瘤細(xì)胞中纖維蛋白A的磷酸化水平下降，說明MAPK/ERK能夠誘導(dǎo)纖維蛋白A的磷酸化，參與垂體瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程。其次，通過CCK-8檢測(cè)SB203580處理垂體瘤細(xì)胞后細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)抑制MAPK/ERK通路后，細(xì)胞的增殖能力升高，同時(shí)，通過RT-PCR、Western blot檢測(cè)細(xì)胞增殖的一些關(guān)鍵因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞增殖的蛋白CycinD1和CycinE1表達(dá)升高，抑制細(xì)胞增殖的蛋白p21表達(dá)下降，說明MAPK/ERK能夠抑制垂體瘤細(xì)胞的增殖。最后研究了MAPK/ERK對(duì)垂體瘤細(xì)胞凋亡和遷移的影響，抑制MAPK/ERK通路后，流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡數(shù)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下降，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)升高，細(xì)胞的遷移能力升高，說明MAPK/ERK能夠抑制垂體瘤細(xì)胞的凋亡和遷移。因此，可以確定MAPK/ERK通過誘導(dǎo)纖維蛋白A的磷酸化抑制垂體瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移。

為了進(jìn)一步研究MAPK/ERK抑制垂體瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制，本研究選擇了NF-κB/MMP-9/VEGF通路進(jìn)行研究，將SB203580處理垂體瘤細(xì)胞后，通過Western blot檢測(cè)到SB203580組中3個(gè)蛋白的表達(dá)量明顯高于空白組。有研究表明，此通路在腫瘤細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要的作用[12-13]，說明MAPK/ERK能夠抑制NF-κB/MMP-9/VEGF通路的發(fā)生，最后抑制垂體瘤細(xì)胞的增殖，與本研究結(jié)果一致。

以上結(jié)果為研制能抑制垂體瘤細(xì)胞侵襲與發(fā)生的新的藥物提供了一定的思路，為進(jìn)一步探究垂體瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。