胡莉莉，何芷晴，吳春梅，賈珊珊，楊玉磊，張 玫*，雷海民*

(1.北京市北分儀器技術有限責任公司，北京 100095；2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000； 3.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488)

質譜(Mass spectrometry,MS)技術具有靈敏度高、分辨率高、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)勢，目前在各個領域均有廣泛應用[1-4]。離子源是質譜的重要組成部件，2004年出現(xiàn)的敞開式離子化質譜(Ambient ionization mass spectrometry,AI-MS)是離子化技術領域的重大突破。AI-MS技術可在大氣壓環(huán)境中直接對樣品或樣品表面物質進行分析，無需或只需很少樣品前處理步驟，具有實時、簡便、快速、高通量等諸多優(yōu)點。隨著AI-MS技術的不斷發(fā)展，其檢測靈敏度已逐漸可與傳統(tǒng)MS相媲美。目前，AI-MS已經(jīng)在食品藥品檢測、環(huán)境監(jiān)測、爆炸物檢測、分子成像等諸多領域得到了廣泛應用[5-6]。本文將重點介紹目前使用較為廣泛的AI-MS離子源及其在微生物分析中的應用。

1 敞開式離子源的技術分類與原理特點

根據(jù)離子化原理與方法不同，AI-MS技術大體可分為噴霧型、放電型和以氣、熱等輔助激光解吸的復合型3類。下面對3類AI-MS技術裝置和原理的特點進行介紹：

1.1 噴霧型敞開式離子化技術

噴霧型敞開式離子化技術通過溶劑蒸發(fā)和尖端效應生成離子。Cooks團隊發(fā)明的解吸電噴霧離子化(Desorption electrospray ionization,DESI)方法是噴霧型AI-MS技術的典型代表[7]，納噴解吸電噴霧離子化(Nanospray desorption electrospray ionization,nano-DESI)技術則具有更佳的檢測靈敏度。Prosolia公司于2005年將DESI商品化，如今已迭至第二代DESI 2D,并推出了Flowprobe對待測物質進行高效微萃取，現(xiàn)已成功應用于疾病篩查與微生物分析。陳煥文教授提出了萃取電噴霧離子化(Extractive electrospray ionization,EESI)技術[8]，隨后又開發(fā)了中性萃取電噴霧離子化[9]技術，可分別實現(xiàn)復雜液體樣品和固體樣本的高時效性分析。目前DESI和EESI均已被應用于微生物研究[10]，同時已基于EESI實現(xiàn)了多種技術延伸，比如小型化[11]和內(nèi)部萃取電噴霧離子化技術[12]的開發(fā)等。

Haddad提出的解吸聲波噴霧離子化(Desorption sonic-spray ionization,DeSSI)技術，即后來的簡易聲波噴霧離子化(Easy ambient sonic-spray ionization,EASI)[13]的裝置，與DESI類似但無需高溫高壓。類似的還有文丘里-簡易聲波噴霧離子化[14]和精簡型-簡易聲波噴霧離子化[15]。EASI類離子源不依賴于電子、輻射、光、熱組件，降低了儀器硬件成本，目前在多個領域均有應用。紙噴霧離子化(Paper spray ionization,PSI)是最為簡易的常壓質譜技術之一，歐陽證教授團隊對紙基進行了二氧化硅修飾[16]；本課題組采用商品化半透膜或合成的分子印跡膜代替原有的紙基發(fā)展出的膜噴霧(Membrane electrospray ionization,MESI)[17]和印跡膜噴霧(Molecularly imprinted membrane electrospray ionization,MIM-ESI)[18]，以及融入了納米技術的紙基修飾都進一步提升了紙噴霧的分析能力[19-20]。目前基于紙噴霧、膜噴霧，已成功實現(xiàn)了細菌種屬鑒別、細菌耐藥性快速檢測、細菌毒素快速檢測等多項微生物相關應用[21-22]。

1.2 放電型敞開式離子化技術

放電型敞開式離子源的離子化機理主要包含“質子轉移”和“電子轉移”等離子分子反應過程。Cody團隊提出的實時直接分析(Direct analysis in real time,DART)離子化技術是該類型的典型代表[23]。目前DART已實現(xiàn)商品化，在微生物鑒定方面顯示出快速、簡便、高通量的特征[24-25]。Cooks教授開發(fā)的低溫等離子體探針(Low temperature plasma,LTP)技術，可直接將固體基質表面樣品分子解吸并電離進行質譜檢測[26]，并可應用于mini-MS[27]。低溫等離子體對樣品損傷小，便于樣品表面的準確定位，在質譜成像和生物活體原位研究等領域具有重要價值?？焖僬舭l(fā)離子化質譜技術(Rapid evaporative ionization mass spectrometry,REIMS)為生物組織實時體內(nèi)分析而設計[28]，有兩支鑷子形手持電極探針，可將微量細菌置于射頻電流下獲得微生物質譜指紋圖譜。在REIMS基礎上發(fā)展而來的環(huán)境激光解吸離子化(Ambient laser desorption ionization,ALDI)技術在形態(tài)精度和分析通量上均得到了提高[29]。

1.3 以氣、熱等輔助激光解吸的復合型離子化技術

Shiea等[30]提出的電噴霧激光解吸離子化(Electrospray laser desorption ionization,ELDI)技術，是將激光解吸附和電噴霧相結合的電離策略，首次實現(xiàn)了無需基質輔助僅利用激光解吸進行完整的蛋白質譜分析。Rezenom等[31]提出的紅外激光輔助解吸電噴霧離子化(Infrared laser-assisted desorption electrospray ionization,IR-LADESI)技術，多用于對生物液體樣品的分析。此外還有Sampson等[32]提出的具有更高靈敏度的基質輔助激光解吸電噴霧離子化(Matrix-assisted laser-desorption electrospray ionization,MALDESI)技術，可同時滿足液體和固體樣品的檢測需求[33]，以及Nemes等[34]提出的采用不同激光源的激光消融電噴霧離子化(Laser ablation electrospray ionization,LAESI)技術等?；|是一類對微生物生理生化等生物學過程影響很大的化學物質，無需基質輔助的質譜離子化技術將大幅度擴展質譜技術在微生物領域的研究應用。

2 敞開式離子化技術在微生物領域的應用

近年來基質輔助激光解吸離子化-飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)已成功應用于微生物鑒定[35]，然而尚無法實現(xiàn)快速分析，也缺乏菌株分型能力。隨著AI-MS的興起，其操作簡便、快速檢測的優(yōu)勢越發(fā)受到人們青睞，在微生物領域的應用不斷得到拓展，表1～3總結了目前已報道的應用于微生物檢測的敞開式離子化方法。下面逐一詳細介紹。

2.1 微生物鑒定與分型

細菌的鑒定分型在臨床診斷、公共衛(wèi)生、環(huán)境檢測、藥學、食品等諸多領域具有重要意義。在噴霧型AI-MS技術中，DESI可在環(huán)境條件下從完整微生物中快速獲得細菌種屬鑒定結果實現(xiàn)亞種分類[36]。Hamid等[37-38]采用PSI-MS結合統(tǒng)計學算法在無需樣品制備的情況下，對細菌、真菌進行了鑒定分類。Cooks課題組建立的接觸噴霧離子化(Touch-spray ionization,TSI)質譜[39-40]、本課題組研發(fā)的注射器噴霧質譜(Syringe spray mass spectrometry,SS-MS)方法[41]，均可實現(xiàn)細菌種屬分類鑒定。SS-MS還可監(jiān)測細菌對外界刺激反應的動態(tài)過程，直接分析細菌對外界刺激做出的反應。捕獲微生物對環(huán)境變化和刺激的動態(tài)響應對于理解微生物的適應性和進化非常重要，對于抗生素藥物開發(fā)和微生物組學研究具有實際意義。

細菌脂肪酸分析常被用于細菌鑒定[42]，敞開式離子化質譜可分析細菌脂肪酸，無需樣本前處理。在放電型AI-MS技術中，Pierce等[43]采用DART-TOF MS對完整的細菌細胞進行了脂肪酸甲酯(Fatty acid methyl esters,FAME)離子化的研究；Cody[44]通過DART-TOF MS技術對17種不同的干酵母菌株進行了區(qū)分。Musah等[45]利用DART-MS衍生指紋圖譜結合化學計量學進行數(shù)據(jù)處理實現(xiàn)了物種識別和分類，僅根據(jù)微生物的代謝產(chǎn)物即可判斷物種間的相似性和差異性。Cooks課題組[46]通過采用LTP-MS直接檢測細菌樣品中的脂肪酸乙酯(Fatty acid ethyl esters,FAEE)，成功區(qū)分了16種不同細菌。Strittmatter等[47]就REIMS作為細菌和真菌通用鑒定系統(tǒng)的適用性進行了研究，Cameron等[48]使用自動化、高通量的REIMS智能平臺直接分析人類糞便樣本，鑒定到可能來自細菌的磷脂分子。

表1 用于微生物鑒定與分型的敞開式離子化方法Table 1 Ambient ionization methods for microbial classification and identification

2.2 微生物代謝物與生物膜分析

微生物代謝產(chǎn)物研究可助力藥物發(fā)現(xiàn)，目前基于DESI-MS開發(fā)了諸多應用，例如：Cooks課題組成功鑒定到枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抗生素環(huán)脂肽Surfacetin[49]；Pruski等[50]用棉簽拭子進行了粘膜代謝組分析；Rodrigues等[51]進行了放線菌次生代謝產(chǎn)物的表征;Lanekoff等[52]對瓊脂平板上粘球菌代謝物和脂質的空間分布進行了分子水平的研究;Rath等[53]開展了細菌代謝物的非靶向分析；Nguyen等[54]使用DESI-MS/MS技術將種屬特異性分子與相關基因功能形成聯(lián)系；Zhang等[55]直接測定了不同細菌的脂類。此外，Hsu等[56]采用Flowprobe-MS對30余種微生物代謝產(chǎn)物進行檢測，成功鑒定到包括不同種屬細菌的代謝產(chǎn)物。

生物膜又稱生物被膜，是微生物學領域的前沿之一。Ravindran等[57]采用銅綠假單胞桿菌為研究模型，建立了水中有毒重金屬污染的快檢方法。Li等[58]使用DART-MS檢測了醫(yī)療器械材料的內(nèi)毒素污染情況。

2.3 微生物質譜成像

目前質譜成像技術已成為質譜研究的一大熱點。Yan等[59]使用直接生物轉化離子質譜(Direct biotransformation-ion mobility mass spectrometry,DiBT-IMMS)方法對瓊脂平板細菌菌落進行了分析。劉虎威教授團隊利用EASI-MS描述了藍藻的衰老過程[60]。Angolini等[61]采用EASI-MS和DESI-MS在培養(yǎng)物表面直接進行代謝產(chǎn)物的空間分布研究。李航等[62]采用LAESI-MS成像模擬了Kirby-Bauer實驗中微生物與抗生素的相互作用，研究了抗生素對細菌生長的抑制作用。Stopka等[63]采用LAESI-IMS-MS方法對未感染根段和完整根瘤進行了對比成像分析，揭示了關鍵代謝物在皮質和感染區(qū)域的空間分布。

表2 用于微生物代謝物和生物膜分析的敞開式離子化方法Table 2 Ambient ionization methods for bacterial metabolite analysis and biofilm analysis

表3 用于微生物質譜成像的敞開式離子化方法Table 3 Ambient ionization methods for mass spectrometry imaging of microbial

3 總結與展望

目前基于微生物自身的分子特征，研發(fā)具有針對性的新型敞開式電離技術是質譜領域的研究熱點。敞開式離子化質譜技術由于具有原位無損分析和快速便捷等諸多優(yōu)點，很大程度上契合了微生物研究的需求，展現(xiàn)出巨大的發(fā)展前景。但目前的技術多數(shù)仍受制于質譜設備的龐大體積和高昂成本?，F(xiàn)今，敞開式離子化技術結合便攜式質譜儀已成為質譜快速分析的重要發(fā)展方向，為質譜的現(xiàn)場普查篩選應用提供了可能。