曹丙蕾，張 群，劉 敏，王 群，尹偉力

（1.濟(jì)南海關(guān)技術(shù)中心，山東 濟(jì)南 250014；2.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東 青島 264001）

豬繁殖與呼吸綜合征又稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種急性高度傳染性疾病，主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙和仔豬呼吸障礙[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，豬高熱病主要是由高致病性PRRSV 引起的，及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)PRRSV 是豬藍(lán)耳病診斷和防控的重要前提[2-4]。

焦磷酸測(cè)序技術(shù)是一種短鏈測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)可以簡(jiǎn)便即時(shí)高效地進(jìn)行短DNA 序列分析，檢測(cè)通量高，可同時(shí)對(duì)多達(dá)96 個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序，無(wú)需對(duì)DNA 片段進(jìn)行電泳和熒光標(biāo)記，有效保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠[5]。本研究針對(duì)PRRSV 的N 蛋白基因序列，建立了一種可直接確定基因序列的焦磷酸測(cè)序技術(shù)。通過(guò)測(cè)序結(jié)果，直接在基因序列水平對(duì)PRRSV 進(jìn)行鑒別診斷，避免存在假陽(yáng)性結(jié)果，提高了陽(yáng)性檢出率，在基因水平上準(zhǔn)確鑒定PRRSV。

1 材料與方法

1.1 材料

PRRSV、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）等病毒樣本由本實(shí)驗(yàn)室保存。M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、PrimeScript One Step RT-PCR Kit、100bp DNA Ladder Marker 及相關(guān)試劑等購(gòu)自Takara 公司；PyroMarkTM ID System、Vacuum Prep Tool、鏈霉親和素包被磁珠、PyroGold SQA Reagents 1×96 DNA 序列分析試劑盒及相關(guān)試劑均為Gene 公司產(chǎn)品。核酸提取儀及配套的核酸提取試劑盒由天根科技提供。

1.2 方法

1.2.1 焦磷酸測(cè)序引物的設(shè)計(jì)

從GenBank 上篩選出PRRSV N 蛋白基因（ORF7 基因）的保守序列，利用焦磷酸測(cè)序分析軟件設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物N-F和N-R 及測(cè)序引物N-S，見(jiàn)表1，引物N-R 5’端加入生物素標(biāo)記，預(yù)期片段大小為239bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 PRRSV的擴(kuò)增引物及測(cè)序引物Tab.1 The amplification primers and sequencing primers of PRRSV

1.2.2 病毒核酸的提取

收集PRRSV、PEDV、TGEV 等病毒材料采用磁珠法核酸提取原理進(jìn)行核酸提取，使用專用核酸提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取的核酸立即使用或-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR反應(yīng)

按照一步法RT-PCR 試劑盒說(shuō)明配置50 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：50℃30 min；94℃2 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃7 min，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，一部分產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，其余擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)入下一步焦磷酸測(cè)序。

1.2.4 焦磷酸測(cè)序反應(yīng)

制備測(cè)序單鏈模板。依據(jù)儀器操作說(shuō)明制備測(cè)序單鏈模板，將含有鏈霉親和素包被磁珠的結(jié)合緩沖液與PCR 產(chǎn)物振蕩混勻10min，用超純水沖洗vacuum prep tool 30 s，抓取結(jié)合PCR 產(chǎn)物的磁珠，再接著用70%乙醇洗滌5 s，Denatureation buffer 洗滌5 s，Washing buffer 中清洗10 s，將vacuum prep tool放入含有測(cè)序引物的PSQ 96孔板中，搖晃釋放磁珠，將反應(yīng)板置于基因擴(kuò)增儀上80℃恒溫2 min，自然冷卻。

測(cè)序反應(yīng)。根據(jù)儀器設(shè)定的程序和試劑用量，將酶混合物（DNA 聚合酶、ATP 硫酸酯酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶）、底物APS 和dNTP 加入試劑艙對(duì)應(yīng)孔位，將試劑艙和96 孔測(cè)序板移入儀器反應(yīng)艙中，運(yùn)行儀器程序，反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)出具測(cè)序結(jié)果，通過(guò)在線BLAST分析即可得知結(jié)果并比較其序列特異性。

1.2.5 特異性試驗(yàn)

以PRRSV、TGEV、PEDV 和PRV 等核酸為模板進(jìn)行RTPCR 擴(kuò)增，按照上述1.2.4 進(jìn)行焦磷酸測(cè)序檢測(cè)，結(jié)果直接顯示基因序列，通過(guò)BLAST分析確定反應(yīng)特異性。并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，鑒定引物的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗(yàn)

對(duì)PRRSV 核酸（60ng/μL）依次進(jìn)行梯度稀釋后，各個(gè)稀釋度分別作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶，并確定用于焦磷酸測(cè)序中RT-PCR 的最低檢測(cè)限，同時(shí)也對(duì)各個(gè)稀釋度的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)同一份擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3 次焦磷酸測(cè)序，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)，對(duì)同份核酸進(jìn)行3 次擴(kuò)增并進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，確定方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.8 在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用

從20 個(gè)疑似PRRSV 的臨床樣本中提取核酸，經(jīng)擴(kuò)增后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)兩者結(jié)果比對(duì)，確定該焦磷酸測(cè)序技術(shù)的高效性和實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

PRRSV 核酸擴(kuò)增片段大小為239 bp，與預(yù)期目的片段大小一致。測(cè)序結(jié)果表明目的條帶與PRRSV N 蛋白基因片段具有100%的同源性。

2.2 焦磷酸測(cè)序技術(shù)

焦磷酸測(cè)序儀出具的PRRSV 短序列為：CTAGCGACTGAAGATGATGTCAGAC ATCACTTTACCCC，焦磷酸測(cè)序結(jié)果與普通測(cè)序結(jié)果相比，符合率為100%，無(wú)序列差異，且該序列進(jìn)行BLAST分析后發(fā)現(xiàn)，該序列結(jié)果屬于PRRSV N蛋白基因的特異性序列，以此為準(zhǔn)可直接進(jìn)行PRRSV 的確診，避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，且在35 min左右即可完成焦磷酸測(cè)序，與外送測(cè)序相比，大大提高了工作效率。

2.3 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，只有PRRSV獲得了焦磷酸測(cè)序的序列結(jié)果，通過(guò)BLAST 分析，該結(jié)果與目的片段符合率為100%，其他無(wú)關(guān)核酸樣品無(wú)序列結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，只有PRRSV擴(kuò)增出了目的片段，其余未見(jiàn)有條帶出現(xiàn)，所建立的焦磷酸測(cè)序技術(shù)具有較好的特異性。

2.4 靈敏度試驗(yàn)

從RT-PCR 的結(jié)果分析來(lái)看，RT-PCR 擴(kuò)增的最低核酸檢測(cè)限為0.1pg/test，由于要達(dá)到焦磷酸測(cè)序所要求的條件，故在焦磷酸測(cè)序中最低核酸檢測(cè)限為10 pg/test。

2.5 重復(fù)性結(jié)果

經(jīng)多次重復(fù)性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均保持一致，所建立的焦磷酸測(cè)序技術(shù)具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.6 樣品檢測(cè)

經(jīng)臨床樣本檢測(cè)，陽(yáng)性15 例，陰性5 例，測(cè)序結(jié)果與焦磷酸鹽測(cè)序結(jié)果和普通測(cè)序結(jié)果一致，符合率為100%，且與普通測(cè)序相比，明顯提高了檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。

3 討論

實(shí)驗(yàn)室常用的動(dòng)物疫病病原診斷方法有很多，包括病毒分離鑒定、RT-PCR 和熒光RT-PCR 等，這些都有一定的特異性和敏感性，在動(dòng)物疫病的篩查診斷中發(fā)揮了很大的作用，但是無(wú)法立馬得知分子診斷的基因序列，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，無(wú)法獲知準(zhǔn)確結(jié)果，即便進(jìn)行目的片段測(cè)序，也需要再采用Sanger 測(cè)序法進(jìn)行，這無(wú)疑將檢測(cè)時(shí)限延長(zhǎng)了，無(wú)法立即判定準(zhǔn)確結(jié)果，耗時(shí)耗力。

焦磷酸測(cè)序是一種全新的短序列測(cè)序檢測(cè)技術(shù)，可通過(guò)短序列片段的基因序列即時(shí)判定結(jié)果，具有直觀、快速、靈敏等特點(diǎn)，且省去了Sanger 測(cè)序或外送測(cè)序公司測(cè)序確診的步驟，基因序列結(jié)果可直觀地通過(guò)焦磷酸測(cè)序展現(xiàn)出來(lái)，減少假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，提高了動(dòng)物疫病診斷效率，且焦磷酸測(cè)序檢測(cè)時(shí)限短，縮短了檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，提高了確診工作效率，為動(dòng)物疫病防控提供了高效的檢測(cè)手段。

目前，豬藍(lán)耳病仍是引起豬群重大動(dòng)物流行病的主要疾病之一，有歐洲型和美洲型2 種基因型。PRRSV 有多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其中以編碼核衣殼蛋白（N）的ORF 7基因最為保守，該蛋白是免疫原性最強(qiáng)的蛋白，能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，因此，蛋白基因也是各個(gè)學(xué)者及研究機(jī)構(gòu)研究PRRSV 的首選研究對(duì)象[2，4]。

本研究選用PRRSV N蛋白基因?yàn)檠芯繉?duì)象，設(shè)計(jì)了焦磷酸測(cè)序技術(shù)的擴(kuò)增引物及測(cè)序引物，經(jīng)擴(kuò)增后將產(chǎn)物直接進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，獲得一段特異性的基因序列，該短序列可作為PRRSV 鑒定的靶序列，直接從基因序列中確定PRRSV。鑒于焦磷酸測(cè)序可以直接獲取序列結(jié)果，下一步研究方向主要是利用這一技術(shù)特點(diǎn)來(lái)研究PRRSV的變異情況，直接從基因序列的突變、缺失、插入等情況來(lái)判定目前豬繁殖與呼吸綜合征的流行趨勢(shì)，便于更好地進(jìn)行疫病監(jiān)控與追蹤。