郭勇，莫緩椰，魯葉，劉潤(rùn)坤，劉青光

（1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，陜西 西安 710061；2.陜西省商洛市中心醫(yī)院 胃腸外科，陜西 商洛 726000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡(jiǎn)稱肝癌）是最常見的原發(fā)性肝癌，是全球第六大常見癌癥，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。近年來隨著經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展，人們生活方式的改變，每年約有84萬(wàn)例肝癌新發(fā)病例和78萬(wàn)例肝癌相關(guān)死亡病例，其中我國(guó)約占50%[2-3]。盡管肝癌的治療技術(shù)與手段日新月異，但晚期肝癌的治療選擇仍非常有限。因此開發(fā)肝癌早期診斷標(biāo)志物與探尋新的治療靶標(biāo)分子迫在眉睫。

G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白2（G-protein-signaling modulator 2，GPSM2），也稱LGN，是一種可以調(diào)節(jié)G蛋白活性的蛋白，在有絲分裂中發(fā)揮重要作用[4-6]。GPSM2的異常表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)沉默GPSM2通過誘導(dǎo)Snail表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移[7]。而在乳腺癌細(xì)胞中，GPSM2通過PSD-95/Dlg/ZO-1結(jié)合激酶（PSD-95/Dlg/ZO-1 binding kinase，PBK）影響癌細(xì)胞的分化，在侵襲性乳腺癌細(xì)胞核中檢測(cè)到GPSM2表達(dá)，則提示患者不良預(yù)后[8-9]。在胰腺癌中過表達(dá)GPSM2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移能力[10]。由此可見，GPSM2在人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究旨在分析GPSM2在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)差異及其與患者臨床病理特征和生存率的相關(guān)性，通過體外試驗(yàn)驗(yàn)證GPSM2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和糖酵解的影響，并初步探索其潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

80例肝癌及對(duì)應(yīng)的癌旁（距離腫瘤邊緣2 cm）非腫瘤組織來源于2017年1月—2018年12月我院手術(shù)切除并病理確診的標(biāo)本。所有組織標(biāo)本離體后液氮快速冷凍，然后長(zhǎng)期保存在-80 ℃冰箱。所有患者均簽署了書面知情同意書。本研究由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要材料

肝癌細(xì)胞系Huh7購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，由本實(shí)驗(yàn)室保存。Dulbecco的改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM）（Hyclone)，胰酶及胎牛血清（Gibco），雙抗（Hyclone)，X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent（Roche），GPSM2抗體（Proteintech），RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、5×蛋白示蹤緩沖液（中輝赫彩），TRIzol（Life technologies），SYBR Premix Ex Taq? II Kit (Takara)，己糖激酶-2（hexokinase 2，HK2）、肝臟磷酸果糖激酶（phosphofructokinase, liver type，PFKL）、丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）抗體（Cell Signaling Technology）, 缺氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）抗體 (Abcam)，聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF） 膜、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescent，ECL） 試劑（Millipore），GPSM2、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）引物（擎科），葡萄糖消耗檢測(cè)試劑盒、乳酸生成檢測(cè)試劑盒（Abcam），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8） （Dojindo）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞Huh7培養(yǎng)于含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并放置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱或1%O2、37℃培養(yǎng)箱中。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)期的Huh7細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Huh7細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×106個(gè)細(xì)胞/孔種于六孔板，待細(xì)胞貼壁且細(xì)胞融合度約30%～50%后，按照X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent的 使用 說 明 書，取X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent（μL）與siRNA（μg）比 值 為10:2，使用不含血清的DMEM稀釋X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent和 siRNA復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。siRNA購(gòu)于百奧邁科生物技術(shù)有限公司。GPSM2 siRNA：正義鏈5'-AGU UCA AGU UGG AAC UGA AdTdT-3'，反 義 鏈5'-UUC AGU UCC AAC UUG AAC UdTdT-3'。對(duì) 照siRNA：正 義 鏈5'-UGC UGA CUC CAA AGC UCU GdTdT-3'，反 義 鏈5'-CAG AGC UUU GGA GUC AGC AdTdT-3'。

1.3.3 Western blot用RIPA緩沖液在4℃條件下充分裂解細(xì)胞，提取總蛋白質(zhì)。用BCA法定量蛋白濃度，取適量總蛋白加入5×上樣緩沖液后95℃煮沸5 min變性蛋白。將變性的蛋白質(zhì)在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜用10%脫脂牛奶在室溫封閉2 h后，膜與一抗（GPSM2：1:500；β-actin：1:1 000；HK2：1:1 000；PKM2：1:2 000；PFKL：1:1 000；HIF-1α：1:1 000）4℃孵育過夜，將膜與二抗（1:1 000）室溫孵育2 h，用ECL發(fā)光液顯影，最后應(yīng)用Amersham? Imager 680凝膠成像儀拍照。

1.3.4 RNA提取及qRT-PCR將TRIzol加入細(xì)胞中或者破碎的組織中以提取總RNA，用nanodrop測(cè)定RNA濃度后，取1 μg總RNA按PrimeScript RT試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取3 μL cDNA按照SYBR Premix Ex Taq? II Kit說明書加入引物進(jìn)行qRT-PCR。反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR在BIO-RAD CFX96上進(jìn)行。GPSM2正向：5'-AGG CAG CCG TGG ATT TTT ATG A-3'；反向：5'-CAC CAC TTT TAT CCC CAA CCT CTC-3'。β-actin正向：5'-GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG-3'反向：5'-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3'。

1.3.5 肝癌組織中GPSM2表達(dá)的預(yù)后意義在GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php）網(wǎng)站平臺(tái)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中GPSM2 mRNA表達(dá)與肝癌患者總體生存率和無病生存率的相關(guān)性。

1.3.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以1×103個(gè)/100 μL培養(yǎng)基加入96孔板中，在含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培育24、48、72 h后，加入CCK-8試劑10 μL/孔，37℃孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度。

1.3.7 葡萄糖消耗與乳酸生成實(shí)驗(yàn)葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以2×104個(gè)/孔種在6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入2 mL 無血清培養(yǎng)使細(xì)胞饑餓過夜。使用PBS 洗3次后，加入2-脫氧葡萄糖。按照葡萄糖消耗檢測(cè)試劑盒說明書制備樣品，并測(cè)量樣品在412 nm 的吸光度。乳酸生成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以3×104個(gè)/ 孔種在6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入2 mL 無血清培養(yǎng)，收集24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)基，離心除去細(xì)胞碎片，按照乳酸生成檢測(cè)試劑盒的說明書加入反應(yīng)液，檢測(cè)樣品在450 nm處的吸光度。

1.3.8 缺氧模型的建立將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Huh7 細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×106個(gè)細(xì)胞種于皿中，培養(yǎng)基為DMEM 高糖培養(yǎng)基加入10% 胎牛血清和1%雙抗，將細(xì)胞放入常氧培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼壁后放入缺氧培養(yǎng)箱，48 h后取出進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行分析，兩組計(jì)量資料采用非參數(shù)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各組間比較采用方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GPSM2 在肝癌和癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)

提取80例肝癌組織和癌旁非腫瘤組織總RNA進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果顯示肝癌組織中GPSM2m RNA表達(dá)相較于癌旁非腫瘤組織明顯升高（P＜0.0001）（圖1）。另外，隨機(jī)選取20例肝癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果提示GPSM2蛋白水平在肝癌組織中也明顯高于癌旁組織（P＜0.0001）（圖2）。

圖1 GPSM2 mRNA 在肝癌及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)Figure1 The expression of GPSM2 mRNA in HCC and adjacent non-tumor tissues

圖2 GPSM2 蛋白在肝癌及癌旁非腫瘤組織中的表達(dá)Figure2 The GPSM2 protein levels in HCC and adjacent non-tumor tissues

2.2 肝癌組織中GPSM2 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)肝癌組織中GPSM2 mRNA表達(dá)中位數(shù)（5.48）把所有病例分為低表達(dá)組（＜5.48，n=40）和高表達(dá)組（≥5.48，n=40）。如表1所示，GPSM2 mRNA表達(dá)與肝癌患者腫瘤大?。≒=0.003）、Edmondson-Steiner分級(jí)（P=0.025）和TNM分期（P=0.045）有關(guān)，而與年齡、性別、HBV感染、血清AFP水平、腫瘤數(shù)、血管侵犯無關(guān)（均P＞0.05）。

2.3 肝癌組織中GPSM2 mRNA表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

在GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php）網(wǎng)站平臺(tái)基于TCGA數(shù)據(jù)分析肝癌組織中GPSM2 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示GPSM2 mRNA高表達(dá)的肝癌患者總生存率和無病生存率均明顯低于GPSM2 mRNA低表達(dá)肝癌患者（均P＜0.0001）（圖3）。

表1 GPSM2 mRNA 表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n=40，n（%）]Table1 Relations of GPSM2 mRNA expression with clinicopathologic features of HCC patients [n=40,n (%)]

圖3 GPSM2 mRNA 高表達(dá)與低表達(dá)肝癌患者生存分析 A：總生存率曲線；B：無病生存率曲線Figure3 Survival analysis of HCC patients with high or low expression of GPSM2 mRNA A:Overall survival curves;B:Disease-free survival curves

2.4 干擾GPSM2 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和糖酵解的影響

在Huh7細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GPSM2 siRNA和對(duì)照組siRNA，轉(zhuǎn)染48 h后Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾組GPSM2蛋白水平明顯降低（P＜0.05）（圖4）。應(yīng)用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力變化，結(jié)果顯示干擾GPSM2明顯抑制Huh7細(xì)胞增殖能力（P＜0.05）（圖5）。另外，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾GPSM2明顯抑制Huh7細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸生成（P＜0.05）（圖6）。

圖4 GPSM2 siRNA 在Huh7 細(xì)胞中的干擾效果Figure4 The knockdown efficiency of GPSM2 siRNA in Huh7 cells

圖5 干擾GPSM2 對(duì)Huh7 細(xì)胞增殖能力的影響Figure5 Effect of GPSM2 silencing on the proliferation of Huh7 cells

圖6 干擾GPSM2 對(duì)Huh7 細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影響Figure6 Effects of GPSM2 silencing on the glucose consumption and lactate production of Huh7 cells

2.5 干擾GPSM2 對(duì)肝癌細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵限速酶蛋白水平的影響

圖7 干擾GPSM2 對(duì)Huh7 細(xì)胞中HK2、PFKL 和PKM2 蛋白表達(dá)的影響Figure7 Effects of GPSM2 silencing on HK2,PFKL,and PKM2 protein expressions in Huh7 cells

糖酵解過程受到3個(gè)關(guān)鍵限速酶調(diào)控，包括HK2、PFKL和PKM2。應(yīng)用Western blot檢測(cè)干擾GPSM2對(duì)Huh7細(xì)胞中HK2、PFKL和PKM2蛋白水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾GPSM2明顯減少HK2蛋白水平（P＜0.05），而不影響PFKL和PKM2蛋白水平（圖7）。

2.6 缺氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中GPSM2表達(dá)

缺氧微環(huán)境是肝癌細(xì)胞糖酵解的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，故進(jìn)一步研究缺氧是否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中GPSM2表達(dá)。將Huh7細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，Western blot檢測(cè)HIF-1α和GPSM2蛋白水平。結(jié)果顯示缺氧導(dǎo)致Huh7細(xì)胞中HIF-1α蛋白明顯蓄積，同時(shí)缺氧導(dǎo)致GPSM2蛋白水平明顯上調(diào)（P＜0.05）（圖8）。

圖8 缺氧對(duì)Huh7 細(xì)胞中HIF-1α 和GPSM2 蛋白表達(dá)的影響Figure8 Effects of hypoxia on HIF-1α and GPSM2 protein expression in Huh7 cells

3 討 論

肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，每年中國(guó)有超過30萬(wàn)人死于肝癌，約占全世界肝癌相關(guān)死亡人數(shù)的一半[11]。肝癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸的分子機(jī)制復(fù)雜，是目前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)[12-14]。深入研究參與肝癌惡性進(jìn)展的關(guān)鍵分子及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)探尋抗肝癌的新生物學(xué)靶點(diǎn)及靶向治療方案、提高肝癌治療效果及改善患者的預(yù)后具有重要意義。

缺氧是包括肝癌在內(nèi)的許多實(shí)體腫瘤的常見特征，與腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后密切相關(guān)[15-17]。HIF-1是由α亞基和β亞基組成的異二聚體[18]。在缺氧條件下，穩(wěn)定了HIF-1α亞基，從而在核中與HIF-1β組成穩(wěn)定的HIF-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，進(jìn)而結(jié)合到目的基因啟動(dòng)子區(qū)域缺氧反應(yīng)元件（hypoxiaresponse element，HRE），誘發(fā)基因轉(zhuǎn)錄[18]。HIF-1靶基因參與了肝癌的許多細(xì)胞過程，包括糖酵解、增殖、干性、耐藥性、免疫逃逸、血管生成和轉(zhuǎn)移[19-20]。越來越多的癌基因被證實(shí)是HIF-1的靶基因，在肝癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌中缺氧誘導(dǎo)的HIF-1通過與血管擴(kuò)張刺激磷蛋白（vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP） 啟動(dòng)子區(qū)域的HRE結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控VASP的表達(dá)，繼而VASP通過激活A(yù)kt和ERK通路促進(jìn)肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。缺氧誘導(dǎo)的TUFT1通過激活Ca2+/PI3K/Akt通路促進(jìn)肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[22]。Fibulin-5通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP-7）表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲[23]。本研究證實(shí)在缺氧條件下肝癌細(xì)胞中GPSM2蛋白表達(dá)顯著升高。在肝癌臨床樣本中，GPSM2 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁非腫瘤組織，臨床數(shù)據(jù)分析提示GPSM2 mRNA高表達(dá)與肝癌患者惡性臨床病理特征（腫瘤體積≥5 cm、高Edmondson-Steiner分級(jí)和高TNM分期）以及不良預(yù)后密切相關(guān)。以上結(jié)果表明GPSM2在肝癌進(jìn)展中可能作為癌基因發(fā)揮作用，其可能是HIF-1的潛在靶基因。

有氧糖酵解，也稱為Warburg效應(yīng)，是有別于正常細(xì)胞而存在于癌細(xì)胞中的一種葡萄糖代謝現(xiàn)象，表現(xiàn)為葡萄糖主要被加工成乳酸[24-25]。雖然在ATP生成方面效率較低，但糖酵解可以增加生物合成，抑制細(xì)胞凋亡，并產(chǎn)生信號(hào)代謝物，以增強(qiáng)癌細(xì)胞在艱難條件下的存活[26-29]。在既往的研究中發(fā)現(xiàn)GPSM2可以通過激活PI3K/AKT通路促進(jìn)肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[30]。本研究進(jìn)一步研究了GPSM2對(duì)肝癌細(xì)胞糖酵解的影響。通過siRNA干擾Huh細(xì)胞中GPSM2表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞增殖、葡萄糖消耗以及乳酸生成均顯著減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)干擾GPSM2可以降低糖酵解限速酶HK2表達(dá)，以上結(jié)果提示GPSM2可能通過調(diào)控HK2影響肝癌細(xì)胞糖酵解。既往研究[30]發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中GPSM2激活PI3K/Akt信號(hào)通路。而研究已經(jīng)證實(shí)PI3K/Akt信號(hào)通路通過調(diào)控HK2表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞糖酵解[31]。因此，筆者推測(cè)GPSM2可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)HK2表達(dá)。

綜上所述，本研究的臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)肝癌組織中GPSM 2表達(dá)上調(diào)并與不良預(yù)后相關(guān)，GPSM 2可能通過增強(qiáng)HK2表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和糖酵解。另外，本研究證實(shí)GPSM2是一個(gè)缺氧反應(yīng)基因，其可能介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞糖酵解。