張 宇，湯 揚，徐 偉

(北京理工大學 生命學院，北京 100081)

自1989年問世后，電噴霧離子化(ESI)技術便與質(zhì)譜聯(lián)用并廣泛應用于蛋白質(zhì)及其復合物的鑒定和解析[1]。隨著質(zhì)譜技術的不斷發(fā)展，非變性質(zhì)譜作為一項新興技術應運而生。非變性質(zhì)譜的研究重點是蛋白質(zhì)復合物的結構、相互作用和動力學，其為結構生物學研究也提供了另一種可能。在非變性質(zhì)譜分析前，通常需使用透析[2]、滲濾[3]或離子色譜[4]等方法從溶液中去除非揮發(fā)性鹽，以提高質(zhì)譜分析的靈敏度。然而，非揮發(fā)性高鹽溶液是維持許多蛋白質(zhì)結構和功能必不可少的條件，在生理環(huán)境條件下解析蛋白結構是大勢所趨。目前一般是將蛋白質(zhì)溶于乙酸銨等緩沖體系中開展分析。最新的研究證實，與傳統(tǒng)的Theta噴針相比，亞微米噴針不僅能夠?qū)崿F(xiàn)溶液的快速混合，還具有納升電噴霧電離(nanoESI)的其他特性，其中降低蛋白質(zhì)的鹽離子加合現(xiàn)象對蛋白質(zhì)解析具有很大的優(yōu)勢[5-6]。本文結合前期的研究工作，總結了亞微米電噴霧噴針的特性，詳細闡述其在蛋白質(zhì)非變性質(zhì)譜分析和寡核苷酸分析等領域的應用，并對該技術的未來發(fā)展趨勢進行展望。

圖1 亞微米噴針表面-蛋白相互作用誘導蛋白展開的示意圖[8]Fig.1 Schematic graph of surface-induced protein unfolding in submicron electrospray emitters[8]

1 亞微米電噴霧噴針的特性

1.1 蛋白質(zhì)電荷分布的改變

電荷態(tài)的分布情況是質(zhì)譜解析蛋白結構的重要依據(jù)，近年研究表明蛋白離子電荷態(tài)的分布與其在溶液中呈現(xiàn)的結構具有強烈的依賴性[7]。nanoESI噴針的材質(zhì)是硼硅酸鹽玻璃，其表面在水溶液中帶負電荷。帶正電荷的蛋白質(zhì)與帶負電荷的玻璃表面之間的庫侖力可能會誘導蛋白質(zhì)結構的不穩(wěn)定(圖1)。相較于傳統(tǒng)尺寸的電噴霧尖端，亞微米尖端具有更高的比表面積，庫侖力作用也更為明顯，進而可誘導蛋白質(zhì)結構的展開和電荷態(tài)分布的變化。Williams等[8]對比了尖端外徑在250 nm～1.5 μm之間的nanoESI噴針形成的蛋白離子的帶電狀態(tài)，對于在溶液中呈正電荷的蛋白質(zhì)，使用較小尺寸的尖端可以誘導其加權平均電荷態(tài)向高電荷態(tài)轉移，而帶負電荷的蛋白質(zhì)則無此現(xiàn)象。肌紅蛋白在尺寸為305 nm的噴針尖端下產(chǎn)生較高的電荷態(tài)，并伴隨有珠蛋白的譜圖出現(xiàn)(歸因于血紅素的丟失)，這雙向驗證了較小尖端具有誘導蛋白質(zhì)結構變化進而改變電荷態(tài)分布的特性。

相較于常規(guī)電噴霧噴針，亞微米噴針在電噴霧過程中產(chǎn)生的初始液滴較小，其液滴壽命也隨之變短。Mirza等[9]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)從大氣壓轉移至質(zhì)譜儀真空腔內(nèi)的過程中，對電噴霧液滴施加高溫很難誘導蛋白質(zhì)電荷態(tài)的變化；但較高溫度的金屬傳輸管會誘導蛋白形成更高的電荷態(tài)。因此，縮短液滴壽命，使氣態(tài)離子在質(zhì)譜儀的大氣界面處形成，在一定程度上可以預防蛋白結構的展開和高電荷態(tài)的形成。亞微米噴針從表面帶電性質(zhì)和液滴壽命兩個方面影響蛋白質(zhì)電荷態(tài)的分布，帶負電荷的噴針表面可誘導帶正電荷蛋白質(zhì)結構的展開，短暫的噴霧液滴壽命可防止蛋白高電荷態(tài)的形成，故而經(jīng)涂層處理的亞微米噴針可用于解析蛋白質(zhì)的天然構象。

圖2 亞微米噴針在電噴霧電離中的離子脫鹽效應[12]Fig.2 Ion desalting in electrospray ionization with submicron emitters[12]

圖3 分步電壓納米電噴霧方法分離分析物與基質(zhì)的示意圖[13]Fig.3 Schematic graph of step-voltage nanoelectrospray for the separation of matrices and analyte[13]

1.2 脫鹽效應

特定的鹽離子通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間的相互作用以及蛋白質(zhì)與配體和輔助因子的結合來影響蛋白質(zhì)的結構和功能[10-11]。然而，鹽離子的加合會嚴重降低非變性質(zhì)譜的性能，增強化學噪聲并引起離子抑制，從而降低靈敏度。與傳統(tǒng)尺寸尖端形成的具有1個以上蛋白質(zhì)的較大液滴相比，亞微米噴針形成較小的初始液滴中含有的蛋白質(zhì)數(shù)目不多于1個，其較低的鹽與蛋白質(zhì)比率會降低去溶劑化的蛋白質(zhì)離子的鹽加合現(xiàn)象，從而提高非變性質(zhì)譜分析的準確度[12]。Williams等[12]進一步研究發(fā)現(xiàn)，亞微米噴針具有使蛋白質(zhì)離子脫鹽的特性，實驗使用0.5 μm的尖端較好地解析了150 mmol/L KCl和25 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)緩沖溶液中的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復合物離子。相較于尖端直徑大于1 μm的電噴霧噴針，亞微米噴針形成的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復合物離子的信噪比和分離度得到顯著提高(圖2)。

此外，電噴霧噴針尖端的電場強度隨著尖端尺寸的減小而增加，因此亞微米噴針尖端處的電場強度更高。研究證明，噴針尖端的強電場作用可以降低鹽離子的加合，進而提高信噪比。Wei等[13]開發(fā)了分步電壓納米電噴霧方法以消除基質(zhì)對微量樣品分析造成的干擾。在尖端處的強電場作用下，基質(zhì)中的陽離子和陰離子以相反的方向快速遷移，形成前導帶和拖尾帶；而目標蛋白質(zhì)由于低遷移率保留在中帶區(qū)，從而實現(xiàn)了分析物與鹽基質(zhì)的分離(圖3)。因此，亞微米噴針可從兩方面降低鹽離子的加合作用：產(chǎn)生低鹽含量的初始液滴和于尖端處形成高電場強度。亞微米噴針的離子脫鹽特性使其可直接從各種常用的高濃度非揮發(fā)性鹽的緩沖液中進行蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復合物的分析，省去了脫鹽等樣品預處理步驟。

1.3 蛋白信號的時間依賴性

相較于傳統(tǒng)的噴針，亞微米噴針具有較小的擴散距離和極低的流速，這使得大多數(shù)的蛋白質(zhì)能與其表面相互作用。當溶液流過噴針尖端時，溶液中的某些蛋白質(zhì)全部吸附在尖端表面，直至尖端的吸附位點被全部占滿且Zeta電位顯著降低才會出現(xiàn)蛋白信號。因此，不同蛋白質(zhì)的信號出現(xiàn)具有時間依賴性，這完全由蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)決定。

Williams等[14]以4種常見蛋白質(zhì)(泛素、溶菌酶、細胞色素c和還原性溶菌酶)為研究對象，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與噴針表面的作用強度與蛋白信號出現(xiàn)的時間順序具有一定的相關性(圖4)。噴針表面與不同蛋白質(zhì)之間的結合親和力不僅取決于蛋白質(zhì)的凈電荷和大小，還取決于帶電氨基酸殘基的暴露度。因此，在分析蛋白混合溶液時，目標信號的出現(xiàn)時間會根據(jù)蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)不同而產(chǎn)生差異。這也表明在實驗中使用此類小尖端時必須考慮表面效應，或者應考慮在噴針表面進行涂層處理以防止吸附。

圖4 還原性溶菌酶、溶菌酶、細胞色素c和泛素的蛋白質(zhì)構象與電荷分布示意圖[14]Fig.4 A schematic illustration of protein conformation and the distribution of charges of reduced lysozyme,lysozyme,cytochrome c and ubiquitin[14]

1.4 氣態(tài)離子形成位置的改變

液滴壽命影響電噴霧電離中離子的形成位置，許多研究表明，去溶劑化的離子在質(zhì)譜儀的大氣界面處或內(nèi)部形成[9,15-16]。液滴壽命取決于溶液的流速，其可通過改變噴針尖端直徑或施加的電壓強度來調(diào)節(jié)。Williams等[17]研究發(fā)現(xiàn)，使用亞微米級尖端(317 nm)產(chǎn)生的液滴壽命約1 μs，短暫的存活時間導致液滴無法進入離子源入口，因此其氣態(tài)離子在質(zhì)譜儀外部形成，故在乙酸銨或碳酸氫銨的緩沖體系下僅能觀察到處于低電荷態(tài)的β-乳球蛋白離子。相反，由微米噴針形成的壽命≥10 μs的較大液滴可進入質(zhì)譜儀，故其氣態(tài)離子在質(zhì)譜儀的內(nèi)部形成。這表明在非變性質(zhì)譜分析中使用亞微米噴針具有重大優(yōu)勢，它既消除了離子源溫度對形成氣態(tài)離子的影響，也消除了微米噴針形成的較大液滴中存在多個蛋白質(zhì)分子時可能會發(fā)生的二聚化或聚集效應。

2 亞微米電噴霧噴針在質(zhì)譜分析中的應用

2.1 模擬細胞環(huán)境下蛋白質(zhì)的非變性質(zhì)譜分析

在生物化學中，含有非揮發(fā)性鹽的緩沖溶液常用于模擬細胞外和細胞內(nèi)環(huán)境，其離子強度為150～200 mmol/L[18]。許多蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復合物結構和功能的維持依賴非揮發(fā)性鹽溶液，利用亞微米噴針的脫鹽效應可在模擬細胞外和細胞內(nèi)環(huán)境條件下解析蛋白質(zhì)。Williams等[12]用制備蛋白質(zhì)樣品常用的緩沖溶液(150 mmol/L KCl和25 mmol/L Tris-HCl) 模擬細胞內(nèi)環(huán)境，分別使用尖端尺寸為0.5 μm和1.6 μm的噴針進行蛋白質(zhì)分析，使用1.6 μm噴針得到的譜圖幾乎全是鹽簇離子峰，相比之下，尖端尺寸為0.5 μm的噴針則可直接解析高鹽緩沖溶液中蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復合物的電荷態(tài)分布(圖2)。此外，Williams等[19]利用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)模擬細胞的外環(huán)境，使用亞微米噴針解析得到的蛋白質(zhì)電荷態(tài)分布與在乙酸銨條件下使用微米噴針得到的結果極為相似，證實了亞微米噴針具有顯著的離子脫鹽優(yōu)勢。亞微米ESI尖端可直接從各種含非揮發(fā)性鹽的緩沖溶液中分析蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復合物，無需任何額外的樣品前期準備工作，例如將緩沖溶液替換成銨鹽溶液。該方法有望應用于無需樣品制備或凈化的條件下直接通過質(zhì)譜監(jiān)測細胞外液。

2.2 解析膜蛋白的電荷態(tài)分布

膜蛋白是目前最重要的藥物靶標蛋白[20-21]，全面解析膜蛋白結構和功能是新藥研發(fā)的基礎。由于膜蛋白的疏水性，它們一般通過封裝在非離子或兩性離子表面活性劑膠束中進行溶解，然后利用非變性質(zhì)譜進行分析[22]。但這些表面活性劑會導致質(zhì)譜峰加寬，并降低膜蛋白離子的信噪比[23]。Williams等[24]利用尖端尺寸為0.5 μm的亞微米噴針從150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl和1.1%辛基葡萄糖苷溶液中解析膜蛋白離子的電荷態(tài)分布。離子表面活性劑通常比非離子表面活性劑能更有效地溶解膜蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，亞微米ESI噴針尖端可同時用于非離子和離子表面活性劑溶液中膜蛋白的非變性質(zhì)譜分析。與傳統(tǒng)的nanoESI噴針相比，亞微米噴針尖端顯著降低了高m/z區(qū)域的NaCl和表面活性劑簇離子的相對豐度，降低了化學噪聲，從而為生物學家利用非變性質(zhì)譜研究膜蛋白的結構、功能和動力學提供了可能。

2.3 實現(xiàn)寡核苷酸的質(zhì)譜分析

堿性陽離子在決定核酸的結構和功能方面起著至關重要的作用[25]。它通過中和核酸骨架上磷酸基團的負電荷，降低相對鏈之間的靜電排斥力，從而實現(xiàn)核酸的穩(wěn)定折疊[26]。此外，二價陽離子(例如Mg2+)可與遠端磷酸鹽之間形成鹽橋，以建立塑造整體拓撲結構的遠程接觸[27]。電噴霧電離質(zhì)譜(Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)已成功用于評估靶核酸的結構[28]、穩(wěn)定性[29]和結合特性[30-31]。然而，寡核苷酸的電噴霧質(zhì)譜分析受非揮發(fā)性金屬陽離子的干擾，金屬離子的加合會導致信號抑制和分辨率下降。Hu等[6]首先提出納米噴針(尺寸<1 μm，通常約為100 nm)可以大大減少肽或蛋白質(zhì)的非特異性金屬離子加合現(xiàn)象，并可以提高ESI-MS的基質(zhì)耐受性。Williams和Fabris等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在濃度高達10 mmol/L的Na+/Mg2+條件下分析19 mer寡核苷酸，與使用微米噴針相比，亞微米噴針的信噪比顯著提高，且加合物和鹽簇離子大大減少。這說明亞微米噴針的脫鹽效應不僅適用于解析蛋白質(zhì)，也可用于負離子模式下分析寡核苷酸樣品。此外，使用亞微米噴針消除了Mg2+與游離分析物的非特異性加合對實驗結果造成的干擾，為估算在溶液中形成特異性配合物所需金屬離子的數(shù)量提供了可能。

2.4 測量配體-蛋白質(zhì)的結合親和力

蛋白質(zhì)與配體之間的相互作用對于維持細胞的正常功能至關重要[33-34]。在非變性質(zhì)譜分析中，高離子強度的非揮發(fā)性鹽通常被用于穩(wěn)定配體-蛋白質(zhì)的結構，并可高靈敏度直接測量配體-蛋白質(zhì)的相對結合親和力[35-37]。ESI-MS是一種具有超高靈敏度的快速檢測小分子與蛋白質(zhì)之間相互作用的有效方法，使用亞微米電噴霧噴針替換傳統(tǒng)噴針可以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)樣品的有效脫鹽。Nguyen等[38]研究發(fā)現(xiàn)，亞微米噴針可在高濃度非揮發(fā)性鹽和常見生化緩沖液的存在下測量小分子與蛋白質(zhì)的結合親和力。亞微米噴針的脫鹽效應提高了質(zhì)譜分辨率，可在單個譜圖中同時獲得至少6個配體與單個蛋白質(zhì)靶標的結合親和力，且這些蛋白質(zhì)-配體的相對質(zhì)量差異僅為0.06%。這表明亞微米噴針能夠顯著減少鹽和非揮發(fā)性分子與蛋白質(zhì)復合物的加合現(xiàn)象，從而更準確地測量配體與蛋白質(zhì)的結合常數(shù)。此外，傳統(tǒng)生化分析方法難以研究的多種不同配體與單個蛋白質(zhì)靶標之間的協(xié)同作用也可通過非變性質(zhì)譜進行定量分析。

3 展 望

亞微米噴針在蛋白質(zhì)脫鹽和非變性質(zhì)譜解析等方面具有明顯的優(yōu)勢，已成功用于生理環(huán)境條件下膜蛋白和寡核苷酸解析等領域。亞微米噴針拓寬了非變性質(zhì)譜分析的應用范圍，未來研究將會在蛋白質(zhì)復合物、核酸和蛋白質(zhì)-核酸復合物等生物大分子結構解析中進一步評估亞微米噴針的性能。然而，在研究中必須考慮到ESI噴針尖端尺寸對溶液中蛋白質(zhì)構象的影響以及蛋白吸附效應。通過對噴針表面進行處理有助于消除噴針對蛋白質(zhì)的吸附效應。

最新研究發(fā)現(xiàn)，微米級的nanoESI源存在納米孔效應，所測分析物的幾何形狀可作為質(zhì)譜信息的補充。尖端孔徑為1.5 μm的噴針既可作為nanoESI源將樣品離子化，也可作為納米孔檢測微生物的形狀[39]。相較于傳統(tǒng)的nanoESI源，亞微米噴針的尖端尺寸更小，其納米孔效應為生物大分子(如蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復合物和核酸)的三維結構解析提供了可能。隨著亞微米噴針性能的不斷提升和優(yōu)化，其在蛋白質(zhì)復合物等生物樣品分析中的應用研究有望進一步深入和拓展。