鄭燕森，卓林剛，李大力，劉明耀

研究報(bào)告

炎性腸病易感基因在腸炎發(fā)生發(fā)展中的功能研究

鄭燕森，卓林剛，李大力，劉明耀

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生命醫(yī)學(xué)研究所，上海調(diào)控生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241

炎性腸病在全球范圍內(nèi)發(fā)生極其普遍，具有反復(fù)發(fā)作、難以治愈的特點(diǎn)，也是誘發(fā)結(jié)直腸癌的高風(fēng)險(xiǎn)因素之一。腸炎的發(fā)生與遺傳因素密切相關(guān)，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)位于基因座上的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)rs4676410、rs3749171和rs3749172與腸炎敏感性高度相關(guān)，但是基因在腸炎的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的功能及相關(guān)機(jī)制尚沒有明確結(jié)論。為了研究在腸炎中的作用，首先通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除小鼠，隨后利用DSS誘導(dǎo)的腸炎模型評價(jià)在腸炎發(fā)生中的作用，發(fā)現(xiàn)敲除小鼠在體重變化、DAI評分、腸上皮損傷以及炎性細(xì)胞浸潤等腸炎相關(guān)指標(biāo)顯著低于野生型小鼠。為了研究腸炎相關(guān)SNP突變對GPR35活性的影響，首先根據(jù)rs3749171和rs3749172SNP位點(diǎn)突變信息構(gòu)建GPR35-T108M和GPR35-S294R兩種突變型受體，其次通過多種下游信號通路活性測試，發(fā)現(xiàn)兩種突變均能夠增強(qiáng)GPR35受體活性。最后通過Western blotting分析發(fā)現(xiàn)相較于野生型小鼠，敲除小鼠腸上皮Erk1/2磷酸化水平增加，表明敲除后可能通過上調(diào)Erk1/2信號通路的方式抑制腸炎的發(fā)生發(fā)展。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)人類腸炎易感的rs3749171和rs3749172位點(diǎn)可能通過激活GPR35及下游信號通路的方式促進(jìn)腸炎的發(fā)生發(fā)展，為炎性腸病的治療提供了潛在的藥物作用靶點(diǎn)。

rs3749171；rs3749172；；腸炎；動(dòng)物模型

炎性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種全世界范圍內(nèi)高發(fā)的腸道系統(tǒng)炎癥，分為克羅恩病(Crohn disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)兩種疾病亞型，可導(dǎo)致腹瀉、直腸出血、腹痛和營養(yǎng)不良等癥狀[1]。此外，IBD是結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)的主要危險(xiǎn)因素，IBD患者的結(jié)腸癌發(fā)病率是普通人群的18倍[2~4]。鑒于全世界范圍內(nèi)IBD的發(fā)病率不斷增加并帶來巨額的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，腸炎已成為目前亟需解決的公共健康問題。因此，開展腸炎發(fā)病機(jī)制的研究及開發(fā)IBD治療藥物靶點(diǎn)對腸炎的預(yù)防及治療方面有著極其重要的意義。

目前研究已發(fā)現(xiàn)，腸炎發(fā)病主要是由于吸煙、肥胖、飲食習(xí)慣等外界環(huán)境因素及腸炎易感基因和等遺傳因素導(dǎo)致腸內(nèi)微生物穩(wěn)態(tài)破壞，腸上皮屏障功能缺失以及先天/適應(yīng)性免疫系統(tǒng)功能紊亂等功能障礙，最終導(dǎo)致腸炎的發(fā)生發(fā)展[5~7]。鑒于基因突變在腸炎發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用，全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies, GWAS)已被應(yīng)用于腸炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測及機(jī)制研究中[8]。通過對與炎性腸病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)調(diào)研，本課題組前期發(fā)現(xiàn)3個(gè)獨(dú)立的報(bào)導(dǎo)均表明位于基因座的SNP位點(diǎn)與腸炎高度相關(guān)，但是并未研究清楚是否發(fā)生活性突變及表達(dá)水平變化[9~11]。在dbSNP數(shù)據(jù)庫分析上述SNP位點(diǎn)可以發(fā)現(xiàn)：rs4676410和rs3749172位點(diǎn)在亞洲群體出現(xiàn)頻率較高，GWAS統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)頻率分別為30.6% (樣本量124)及74.1% (樣本量324)，而對應(yīng)的歐美群體中為19.5% (樣本量97104)及54.6% (樣本量123608)；而rs3749171位點(diǎn)在歐美群體中GWAS統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)頻率16.8% (樣本量95590)高于亞洲群體相關(guān)位點(diǎn)出現(xiàn)頻率4.3% (樣本量140)[12]。其中rs4676410位于內(nèi)含子區(qū)域，可能通過影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方式影響目的基因的表達(dá)[9]；而rs3749171和rs3749172位于編碼區(qū)，導(dǎo)致GPR35發(fā)生T305M和S294R位點(diǎn)氨基酸突變，可能會對GPR35受體活性產(chǎn)生影響[10,11]。

GPCR家族作為最大的一類細(xì)胞膜受體家族，能夠?qū)飧袘?yīng)、信息素、激素、神經(jīng)遞質(zhì)在內(nèi)的多種刺激產(chǎn)生反應(yīng)并調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移以及應(yīng)激反應(yīng)，與多種疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)[13]。是G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor, GPCR)，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族視紫紅質(zhì)樣受體亞群[14]。在外周血白細(xì)胞、脾臟、小腸、結(jié)腸和胃等多個(gè)組織器官及細(xì)胞類群中表達(dá)較高，且被證明可能參與哮喘、心血管疾病、腸炎、糖尿病等一系列疾病的發(fā)生發(fā)展，但具體功能及機(jī)制尚未研究清楚[14]。目前為止，在腸炎的病理進(jìn)程中的作用及機(jī)制依舊沒有確定的結(jié)論。GPR35的激動(dòng)劑包括犬尿酸，LPA，Zaprinast以及雙羥萘酸，但是不同激動(dòng)劑在腸炎發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用完全相反：有研究證明社交壓力帶來的犬尿酸積累能夠通過GPR35促進(jìn)腸炎的發(fā)生發(fā)展，而雙羥萘酸可以通過促進(jìn)腸上皮粘膜修復(fù)的方式抑制腸炎的發(fā)生發(fā)展[15,16]。鑒于激動(dòng)劑相關(guān)的研究無法證明在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用，構(gòu)建基因突變小鼠，并在敲除動(dòng)物模型水平上進(jìn)行腸炎模型構(gòu)建將有助于明確在腸炎發(fā)生發(fā)展中的功能，鑒定新的藥物作用靶標(biāo)。

在腸炎的發(fā)病進(jìn)程中，GPCR下游信號通路如ERK1/2、RHOA及AKT等信號通路等在腸炎發(fā)生發(fā)展中能夠起到重要的作用[17]。ERK1/2信號通路在腸上皮組織的激活能夠促進(jìn)腸上皮粘膜修復(fù)，進(jìn)而保護(hù)腸道組織免受腸炎癥狀侵襲[18]。有研究顯示GPR35能夠通過下游Gq、Gi/o、G12/13以及β-arrestin分子調(diào)控下游ERK1/2和 AKT等信號通路活性。在DSS誘導(dǎo)腸炎模型中，是否能夠通過調(diào)控ERK1/2信號通路活性調(diào)節(jié)腸炎發(fā)病進(jìn)程成為需要研究的重點(diǎn)。本研究將從細(xì)胞及動(dòng)物模型兩個(gè)方面探究腸炎相關(guān)SNP位點(diǎn)對活性水平的調(diào)控及在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)機(jī)制，為腸炎易感基因的鑒定、腸炎發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探索以及后續(xù)腸炎治療藥物靶點(diǎn)開發(fā)打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建

人源有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，根據(jù)文獻(xiàn)查閱及序列比對，選擇亞型作為后續(xù)研究蛋白，cDNA全長930 bp，蛋白全長309 aa。根據(jù)人源cDNA序列設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物及突變引物，引物交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。利用點(diǎn)突變試劑盒的方法構(gòu)建GPR35 T108M，S294R突變載體，最后將GPR35 WT，T108M及S294R序列利用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)克隆至pcDNA3.1載體(V79020，Thermo Fisher，美國)中，用于后續(xù)活性研究。引物序列見表1。

表1 GPR35野生型及突變型克隆引物序列

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞購買自上海中科院。將狀態(tài)良好的293T細(xì)胞接種到含10%胎牛血清，l%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。將細(xì)胞放置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度到達(dá)90%后，利用1：3的比例傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到60%~70%后，利用轉(zhuǎn)染試劑PEI將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞到細(xì)胞內(nèi)。其中，質(zhì)粒與PEI按照1∶3的比例混合加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，8 h后換新鮮培養(yǎng)基。24~48 h后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒蛋白表達(dá)水平達(dá)到高峰且效果持續(xù)到72~96 h。

1.3 β-arrestin招募檢測

本實(shí)驗(yàn)主要參照Mitsuru Hattoriw論文中的方法檢測野生型及突變型GPR35受體招募β-arrestin能力[19]。將GPR35、GPR35T08M、GPR35S294R序列克隆至ELuC載體中。293T細(xì)胞密度達(dá)到60%后，利用PEI將GPR35-ELucC和ELucC-ARRB2轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。24 h后將細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行β-arrestin招募實(shí)驗(yàn)。將不同濃度Zaprinast及熒光素酶底物加入培養(yǎng)基中，利用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞生物熒光強(qiáng)度。

1.4 鈣流檢測實(shí)驗(yàn)

將GPR35，GPR35T08M，GPR35S294R質(zhì)粒與Gq質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中，24 h后將細(xì)胞接種到96孔板中，每孔2×104個(gè)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，加入不同濃度的Zaprinast，利用Fluo-8鈣流檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞中鈣流活性。

1.5 CRE熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測

將GPR35、GPR35T08M、GPR35S294R質(zhì)粒及CRE-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞中，24 h后將細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×104個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度Zaprinast至培養(yǎng)基中，24 h后根據(jù)Dual Luciferase Reporter Assay System操作說明書，利用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.6 Gpr35敲除小鼠構(gòu)建

根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)sgRNA設(shè)計(jì)原則，針對鼠源基因第6個(gè)外顯子部分通過Zhang lab (http://crispr.mit.edu)網(wǎng)站設(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)。sgRNA序列為sgRNA1：GGGCCTGCTGCTCAACAGCGT GG, sgRNA2：CTATATGACCAACCTGGCTGTGG。sgRNA引物交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。利用顯微注射技術(shù)將sgRNA及Cas9蛋白注射進(jìn)受精卵中，并將存活的受精卵移植到假孕受體母鼠內(nèi)，至母鼠生產(chǎn)得到F0代。提取小鼠組織DNA進(jìn)行PCR鑒定，檢測Cas9敲除效果并繁殖獲得敲除小鼠。

1.7 DSS小鼠腸炎模型構(gòu)建

利用3%硫酸葡聚糖(dextran sulfate sodium, DSS)飼喂6~8周同窩小鼠5天。每日稱重小鼠體重，觀察小鼠糞便粘稠程度及便血情況。5天后將3%DSS水替換成正常的飲用水。第7天利用CO2窒息法處死小鼠，解剖并測量小鼠結(jié)腸長度，收集小鼠結(jié)腸組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

依照Trizol試劑盒說明書提取小鼠結(jié)腸組織總RNA，分光光度儀檢測RNA濃度。利用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將定量RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。依照TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR)檢測各類炎癥因子表達(dá)水平。qPCR引物見表2。

1.9 HE染色

新鮮小鼠結(jié)腸組織利用5%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯，石蠟包埋。樣品蠟塊組利用切片機(jī)切片，厚度為5 μm。利用蘇木精/伊紅對石蠟切片進(jìn)行染色，染色結(jié)果采用顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。

表2 qPCR引物

1.10 免疫組化及免疫熒光染色

利用S-P法對小鼠結(jié)腸石蠟切片進(jìn)行免疫組化及免疫熒光染色。應(yīng)用BrdU抗體(ab6326，abcam，美國)，Lysosome抗體(ab24170，Abcam，美國)，稀釋比例分別為1∶500，1∶300。隨后利用DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，普通光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄染色結(jié)果。免疫熒光實(shí)驗(yàn)中F4/80抗體(70076T，CST，美國)稀釋濃度為1∶200，二抗為綠色熒光標(biāo)記二抗，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.11 Western blotting (WB)分析

結(jié)腸組織利用液氮研磨粉碎組織，利用RIPA加蛋白酶磷酸酶抑制劑(100×)裂解組織蛋白。BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。將等量蛋白樣品上樣，PAGE膠分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜中。ERK1/2 (9102S，CST，美國)，p-ERK1/2 (8544S，CST，美國)抗體濃度為1∶1000，β-actin (3700T，CST，美國)抗體濃度為1∶5000。熒光標(biāo)記羊抗兔二抗?jié)舛葹?∶5000。利用Odyssey成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.12 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 GPR35相關(guān)腸炎SNP位點(diǎn)將導(dǎo)致GPR35編碼蛋白突變或表達(dá)水平變化

針對基因座上腸炎相關(guān)的SNP位點(diǎn)進(jìn)行位置分析發(fā)現(xiàn)：rs4676410位點(diǎn)位于第5個(gè)內(nèi)含子的位置，而rs3749171和rs3749172位點(diǎn)位于的編碼區(qū)(圖1 A)。對這3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)：rs46776410位點(diǎn)在基因內(nèi)含子區(qū)域，在UCSC Genome Browser網(wǎng)站查詢這個(gè)位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)rs4676410位點(diǎn)位置存在一個(gè)EH38E2090026遠(yuǎn)端增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)序列。rs4676410位點(diǎn)有可能導(dǎo)致表達(dá)水平變化[8]。rs3749171和rs3749172 SNP位點(diǎn)位于編碼區(qū)上，根據(jù)對序列比對發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNP位點(diǎn)會造成GPR35蛋白在108位置的蘇氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?T108M)，294位置的絲氨酸突變?yōu)榫彼?S294R)[10,11]。這個(gè)突變可能會導(dǎo)致GPR35蛋白結(jié)構(gòu)上的改變，影響GPR35蛋白的受體活性進(jìn)而調(diào)控腸炎的發(fā)生發(fā)展(圖1 B)。因此，基于腸炎相關(guān)SNP位點(diǎn)在基因座位置的分析可以推測GPR35活性或表達(dá)水平變化是導(dǎo)致腸炎的發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因。

2.2 Gpr35敲除小鼠構(gòu)建

為了進(jìn)一步探究在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了敲除小鼠模型。如圖所示，在第6個(gè)外顯子的編碼區(qū)域選擇兩個(gè)靶點(diǎn)，并設(shè)計(jì)相應(yīng)sgRNA (圖2 A)。將體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA與Cas9蛋白通過顯微注射的方法注入受精卵，并將受精卵移植到假孕小鼠體內(nèi)。最終，在F0代中得到了5只成功敲除的小鼠.通過測序分析發(fā)現(xiàn)這5只小鼠體內(nèi)包含10種不同的突變形式(圖2 B)。后續(xù)在F1代中尋找能夠穩(wěn)定遺傳的突變個(gè)體，選擇3號小鼠(缺失104 bp)后代相互交配，最終獲得純合突變小鼠開展后續(xù)研究(圖2C)。

2.3 Gpr35敲除不會引起自發(fā)腸炎

成功構(gòu)建敲除小鼠后，首先對敲除小鼠進(jìn)行生理觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠外形、生長速度、體長等沒有明顯缺陷。接下來對小鼠小腸，結(jié)腸切片染色觀察發(fā)現(xiàn)：敲除小鼠在腸上皮完整性方面與野生型小鼠并無差異(圖3 A)。小腸上皮隱窩中潘氏細(xì)胞(lysosome免疫組化標(biāo)記)平均數(shù)目(WT組平均4.5±1.0個(gè)；–/–組平均4.6±1.2個(gè)，=0.804)，絨毛上杯狀細(xì)胞(Alcian blue染色標(biāo)記)平均數(shù)目(WT平均16.2±2.6個(gè)，–/–組平均16.6± 2.3個(gè)，=0.7845)及結(jié)腸上皮每個(gè)視野內(nèi)杯狀細(xì)胞(Alcian blue染色標(biāo)記)(WT平均68.6±11.25個(gè)，–/–組平均66.4±13.6個(gè)，=0.8234)，及位置與野生型小鼠無明顯差異(圖3 B，C)。這說明敲除后在正常狀態(tài)下不會造成腸上皮完整性破壞及自發(fā)腸炎的發(fā)生。

圖1 腸炎相關(guān)SNP位點(diǎn)分析

A：腸炎相關(guān)SNP位點(diǎn)位置分析；B：rs3749171，rs3749172位點(diǎn)造成GPR35氨基酸突變位置分析。

圖2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建Gpr35敲除小鼠

A：構(gòu)建敲除小鼠的sgRNA靶點(diǎn)序列。下劃線表示sgRNA序列，藍(lán)色字體表示PAM序列；B：F0代小鼠靶點(diǎn)附近的基因組測序分析結(jié)果；C：3號F0代小鼠(104 bp缺失)與野生型小鼠產(chǎn)生的F1代雜合子小鼠相互交配后F2代小鼠的基因型鑒定，野生型條帶為396 bp，敲除條帶為282 bp，WT為野生型，HZ為雜合子，HO為純合子。

2.4 Gpr35敲除能夠減緩DSS誘導(dǎo)腸炎模型發(fā)生發(fā)展

隨后，利用DSS誘導(dǎo)的腸炎模型研究在腸道完整性被破壞并發(fā)炎癥的狀況下是否參與到腸炎發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程中。利用3%DSS替代飲用水，5天后替換為純凈水構(gòu)建小鼠DSS腸炎模型，兩組小鼠在第8天時(shí)CO2窒息處死小鼠，解剖并測量兩組小鼠結(jié)腸長度，取部分結(jié)腸組織用于HE染色，免疫組化染色及免疫熒光分析。在建模期間觀察記錄敲除小鼠及野生型小鼠體重變化，糞便硬度及便血情況。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導(dǎo)下敲除組的小鼠在第8天時(shí)平體重下降水平明顯低于野生型組小鼠(WT組平均體重比重78.6±6.0%，Gpr35組平均比重91.1±4.4%，<0.001) (圖4 A)；與此相對應(yīng)的，小鼠日?；顒?dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)也顯示出Gpr35小鼠腸炎嚴(yán)重程度弱于野生型小鼠(WT組DAI分?jǐn)?shù)6.3±1.1，–/–組DAI分?jǐn)?shù)3.2± 1.3，<0.001) (圖4 B)；在DSS誘導(dǎo)的腸炎模型中，結(jié)腸縮短程度也是評價(jià)腸炎表型的方法，對兩組小鼠結(jié)腸長度進(jìn)行測量可以發(fā)現(xiàn)野生型小鼠組結(jié)腸長度遠(yuǎn)低于敲除小鼠組(WT組平均長度4.9± 0.5 cm，–/–組平均5.7±0.3 cm，<0.01) (圖4 C)。對兩組小鼠結(jié)腸部位切片分析可以發(fā)現(xiàn)：野生型小鼠組中結(jié)腸組織腸上皮結(jié)構(gòu)破壞程度，總體潰瘍面積以及炎癥細(xì)胞浸潤水平遠(yuǎn)高于敲除小鼠組 (圖4 D)。而相應(yīng)的組織學(xué)評分也證明敲除小鼠組腸炎表型更輕微(WT組組織評分分?jǐn)?shù)6.6±1.3，–/–組組織評分4.0±0.8,<0.01) (圖4 E)。

隨后利用qPCR檢測兩組小鼠結(jié)腸炎癥因子表達(dá)水平，結(jié)果顯示敲除小鼠組結(jié)腸組織腸炎相關(guān)炎癥因子如(WT組1.0±0.14，Gpr35組0.3±0.15，<0.001)，(WT組1.0±0.13，Gpr35組0.25±0.1，<0.001)(WT組1.0±0.19，Gpr35組0.4±0.08，<0.001)以及(WT組1.0±0.12，Gpr35組0.67±0.29，<0.05)表達(dá)水平低于野生型小鼠組，同時(shí)的表達(dá)量高于野生型小鼠(WT組1.0±0.23，Gpr35組3.12±0.77，<0.001) (圖5 A)。對結(jié)腸組織進(jìn)行F4/80免疫熒光結(jié)果顯示，敲除組小鼠結(jié)腸粘膜巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)目顯著低于野生型組小鼠(WT組平均每個(gè)視野52.5±7.2個(gè)巨噬細(xì)胞，–/–組平均每個(gè)視野22±3.2個(gè)巨噬細(xì)胞，<0.001) (圖5 B)。相應(yīng)的，BrdU免疫組化染色也證明在敲除小鼠在DSS誘導(dǎo)的腸炎進(jìn)程中腸上皮細(xì)胞也保持著較高的增殖水平(WT組平均每個(gè)視野87±11.6個(gè)BrdU陽性細(xì)胞，–/–組平均每個(gè)視野141±15.4個(gè)陽性細(xì)胞，<0.001) (圖5 C)。上述結(jié)果均證明敲除后能夠顯著抑制DSS誘導(dǎo)的腸炎模型發(fā)生發(fā)展。

圖3 自然狀態(tài)下Gpr35敲除小鼠與野生型小鼠小腸，結(jié)腸上皮完整性及功能細(xì)胞染色分析

A：小鼠小腸，結(jié)腸HE染色；B：小腸lysosome免疫組化染色(截圖部分為隱窩區(qū)域放大圖)及小腸，結(jié)腸Alcian blue染色，標(biāo)尺長度200 μm；C：各組細(xì)胞染色計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。其中，WT為野生型對照組小鼠，Gpr35為敲除小鼠組；為無顯著水平差異。

圖4 DSS誘導(dǎo)腸炎模型體重變化，DAI指數(shù)，結(jié)腸長度及HE染色分析

利用3%DSS水溶液飼喂兩組小鼠，第5天換成正常飲用水，第8天處死小鼠取材。實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠體重變化等各項(xiàng)指標(biāo)。A：兩組小鼠每日體重變化(以第1天體重為基準(zhǔn))；B：兩組小鼠每日DAI活動(dòng)指數(shù)評分；C：第8天實(shí)驗(yàn)中止后小鼠結(jié)腸長度測量；D：HE檢測兩組小鼠腸上皮結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺長度2000 μm；E：組織學(xué)評分評價(jià)兩組小鼠腸上皮損傷水平。其中，WT為野生型對照組小鼠，Gpr35為敲除小鼠組；*:<0.05, **:<0.01, ***:<0.001。

2.6 Gpr35敲除能夠激活ERK1/2信號通路通路抑制腸炎的發(fā)生發(fā)展

ERK1/2信號通路是GPCR下游重要的信號通路組成部分，GPCR能夠通過Gi/o，Gs及β-arrestin 等第二信使因子調(diào)控ERK1/2信號通路[20]。WB檢測兩組小鼠結(jié)腸組織中Erk1/2及p-Erk1/2表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：相較于野生型小鼠組，敲除后能夠顯著促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞Erk1/2磷酸化水平(圖6)。這說明敲除后能夠通過上調(diào)下游Erk1/2相關(guān)信號通路活性的方式抑制腸炎的發(fā)生發(fā)展。

2.7 rs3749171和rs3749172位點(diǎn)突變增強(qiáng)GPR35受體活性

為了探究上述兩個(gè)SNP突變對GPR35受體活性的影響，構(gòu)建了GPR35，GPR35T108M及GPR35S294R表達(dá)載體。利用Zaprinast作為GPR35受體激動(dòng)劑，分別采用鈣流檢測(GPR35下游Gq相關(guān)信號通路)，β-arrestin招募(GPR35下游β-arrestin招募相關(guān)信號通路)以及CRE熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(cAMP響應(yīng)元件、GPR35下游Gi/o和Gs共同調(diào)節(jié)的信號通路) 3種方式研究突變對GPR35受體活性的影響。結(jié)果表明：GPR35T108M，GPR35S294R突變體的受體活性在不同濃度Zaprinast刺激下，下游信號通路活性如鈣流響應(yīng)強(qiáng)度(圖7 A)，β-arrestin招募水平(圖7 B)以及下游CRE表達(dá)抑制(圖7 C)方面均強(qiáng)于野生型GPR35 (表3)。這些結(jié)果提示rs3749171與rs3749172SNP位點(diǎn)突變能夠增強(qiáng)GPR35對不同濃度Zaprinast激動(dòng)劑敏感性及下游信號通路活性。

圖5 DSS誘導(dǎo)腸炎模型中炎癥因子表達(dá)水平，巨噬細(xì)胞浸潤水平及細(xì)胞增殖分析

A：qPCR分析兩組小鼠結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)水平；B：免疫熒光染色分析巨噬細(xì)胞在兩組小鼠腸上皮粘膜中浸潤水平，標(biāo)尺長度100 μm；C：免疫組化分析兩組小鼠腸上皮增殖水平，標(biāo)尺長度200 μm。其中，WT為野生型對照組小鼠，Gpr35為敲除小鼠組；*:<0.05, ***:<0.001。

圖6 Gpr35敲除對DSS誘導(dǎo)腸炎模型中Erk1/2信號通路活性影響

A：WB分析兩組小鼠結(jié)腸Erk1/2及p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平；B:灰度分析兩組小鼠p-Erk1/2表達(dá)量占總體Erk1/2蛋白比例。其中，WT為野生型對照組小鼠，Gpr35為敲除小鼠組；**:<0.01。

圖7 rs3749171與rs3749172突變位點(diǎn)對GPR35受體活性影響分析

A：鈣流檢測GPR35、GPR35T108M和GPR35S294R在不同濃度Zaprinast刺激下鈣流響應(yīng)強(qiáng)度；B：β-arrestin招募實(shí)驗(yàn)檢測GPR35、GPR35T108M和GPR35S294R在不同濃度Zaprinast刺激下熒光強(qiáng)度；C：CRE熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測GPR35、GPR35T108M和GPR35S294R在不同濃度Zaprinast刺激下CRE轉(zhuǎn)錄活性。為無顯著性差異，*:<0.05, ***:<0.001。

表3 GPR35、GPR35T108M及GPR35S294R受體活性變化(歸一化處理)統(tǒng)計(jì)及顯著性分析

value指GPR35T108M，GPR35S294R與GPR35受體活性對比顯著性分析結(jié)果。

3 討論

腸炎是一種受多種機(jī)制調(diào)控的慢性炎癥疾病。目前腸炎的治療手段主要包括糖皮質(zhì)激素，炎癥因子抗體，以及菌群調(diào)節(jié)等方法。上述治療方法都能夠在一定程度上緩解腸炎表型，但是依舊存在治療價(jià)格高，見效慢，效果差等缺點(diǎn)[21~23]。因此，研究腸炎發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療靶點(diǎn)篩選依舊是一個(gè)很重要的課題。隨著基因組分析及測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究開始采用GWAS技術(shù)研究腸炎易感的SNP位點(diǎn)，并將其應(yīng)用于腸炎風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測及后續(xù)機(jī)制研究[8]。目前已經(jīng)篩選出上百個(gè)腸炎相關(guān)SNP位點(diǎn)，但是這些SNP位點(diǎn)調(diào)控基因表達(dá)，活性以及后續(xù)影響腸炎的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制依舊需要大量的工作去驗(yàn)證分析。

GPCR家族作為最大的一類細(xì)胞膜受體家族，能夠調(diào)控多種細(xì)胞生理進(jìn)程[13]。30%的現(xiàn)代藥物以GPCR作為治療靶點(diǎn)，而作為GPCR家族成員的一員，具有巨大的研究意義及藥物開發(fā)前景[24]。在腸炎方面，GWAS研究分析證明基因座上多個(gè)SNP位點(diǎn)與腸炎發(fā)生高度相關(guān)，但是對于在腸炎發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用一直沒有一個(gè)統(tǒng)一的認(rèn)知[9,10,11,15]。本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除小鼠用于研究在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常情況下Gpr35小鼠腸上皮完整性及細(xì)胞構(gòu)成與野生型小鼠沒有差異，不會引起自發(fā)腸炎。但是在DSS腸炎誘導(dǎo)模型中，敲除小鼠在小鼠體重下降水平，DAI評分，結(jié)腸長度縮短程度，炎癥因子表達(dá)水平以及巨噬細(xì)胞浸潤等多個(gè)炎癥損傷評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)低于野生型小鼠，這說明能夠促進(jìn)腸炎的發(fā)生發(fā)展。而這個(gè)結(jié)果與社交壓力積累犬尿酸通過促進(jìn)腸炎發(fā)生發(fā)展的研究中促進(jìn)腸炎發(fā)生發(fā)展的研究結(jié)果一致[15]。而對于雙羥萘酸的矛盾性結(jié)果，有研究證明雙羥萘酸是人源GPR35特異激動(dòng)劑，而對鼠源Gpr35基本沒有激動(dòng)效果[25]。這個(gè)可以解釋雙羥萘酸在DSS小鼠腸炎模型中起到的保護(hù)作用這個(gè)矛盾的結(jié)果。因此，結(jié)合本文研究與文獻(xiàn)分析結(jié)果，最終可以確認(rèn)在腸炎的發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程中起到促進(jìn)作用。

本研究對腸炎SNP易感位點(diǎn)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)3個(gè)腸炎相關(guān)SNP位點(diǎn)位于基因范圍內(nèi)，其中rs3749171和rs3749172位于編碼區(qū)，最終導(dǎo)致GPR35突變。針對rs3749171位點(diǎn)，研究人員比對了不同種屬在該位置的氨基酸保守性，發(fā)現(xiàn)GPR35在108位置的蘇氨酸位點(diǎn)在不同種屬不具備進(jìn)化保守性，這預(yù)示著GPR35T108M突變可能會導(dǎo)致GPR35活性的改變[10]。該突變位置在GPR35第3個(gè)跨膜區(qū)位置，該位點(diǎn)發(fā)生突變可能會導(dǎo)致GPR35受體識別部位空間位阻發(fā)生改變，導(dǎo)致GPR35對配體敏感性發(fā)生變化。對于rs3749172位點(diǎn)，研究人員也證明該位點(diǎn)突變與動(dòng)脈粥樣硬化及冠狀動(dòng)脈疾病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性，而對其突變氨基酸位置進(jìn)行分析則發(fā)現(xiàn)其突變位置位于GPR35的C末端，294位的絲氨酸突變?yōu)槔野彼峥赡芘cGPR35與下游G蛋白及β-arrestin結(jié)合活性產(chǎn)生影響最終導(dǎo)致GPR35受體活性改變[26]。

GPR35與炎癥及腸炎發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制目前主要是通過ERK1/2相關(guān)信號通路活性調(diào)節(jié)腸上皮損傷愈合能力以及通過鈣離子相關(guān)信號通路招募巨噬細(xì)胞等單核細(xì)胞遷移到炎癥部位[16,27]。而與之相對應(yīng)的GPR35下游包括Gi/o，Gq在內(nèi)的小G蛋白激活以及β-arrestin招募相關(guān)[20,28,29]。本研究通過體外構(gòu)建GPR35、GPR35T108M、GPR35S294R表達(dá)載體，利用鈣流檢測，β-arrestin招募實(shí)驗(yàn)以及CRE熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對其進(jìn)行受體活性分析，最終證明rs3749171，rs3749172位點(diǎn)突變會導(dǎo)致GPR35受體活性增強(qiáng)，下游相關(guān)信號通路激活。最新的關(guān)于在結(jié)腸癌的研究中也證明了GPR35-T108M突變增強(qiáng)了GPR35調(diào)控下游Na/K-ATP酶的活性的能力[30]。結(jié)合前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究能夠得到最終結(jié)論：腸炎相關(guān)SNP位點(diǎn)rs3749171和rs3749172能夠增強(qiáng)GPR35受體活性及下游相關(guān)信號通路進(jìn)而促進(jìn)腸炎的發(fā)生發(fā)展。而這個(gè)結(jié)果也與前文敲除動(dòng)物模型結(jié)果一致，最終從動(dòng)物模型及病人SNP相關(guān)易感群體分析兩個(gè)方向共同驗(yàn)證了在腸炎發(fā)生發(fā)展中的作用。

ERK1/2信號通路是GPCR下游重要的信號通路組成部分，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖，凋亡及遷移等細(xì)胞進(jìn)程[20]。而對敲除小鼠腸炎模型腸上皮WB分析發(fā)現(xiàn)：相較于野生型小鼠，敲除后，小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中ERK1/2磷酸化水平在腸炎發(fā)生過程中顯著上調(diào)。這說明能夠通過抑制ERK1/2信號通路的方式促進(jìn)腸炎的發(fā)生發(fā)展。在腸炎病理進(jìn)程中，腸上皮ERK1/2相關(guān)信號通路能夠通過調(diào)控腸上皮粘膜傷口愈合的方式抑制腸炎的發(fā)生發(fā)展[16,31]。這些研究與DSS腸炎模型中敲除小鼠腸上皮ERK1/2磷酸化水平上調(diào)的結(jié)果保護(hù)腸炎相關(guān)論證匹配。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究基礎(chǔ)相結(jié)合證明了能夠通過抑制下游ERK1/2相關(guān)信號通路活性的方式促進(jìn)腸炎的發(fā)生發(fā)展。

在腸炎發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，腸道菌群在其中起到了重要的作用。腸道菌群的多種代謝產(chǎn)物通過腸上皮細(xì)胞GPR43，TLR4等受體正向或負(fù)向調(diào)節(jié)腸上皮通透性及免疫反應(yīng)強(qiáng)度，而腸道免疫系統(tǒng)則通過分泌抗菌肽，調(diào)節(jié)自身免疫活性的方式維持腸道內(nèi)菌群穩(wěn)定及腸道上皮通透性等生理狀態(tài)[32~34]。腸道菌群失衡及機(jī)體應(yīng)對腸道菌群免疫反應(yīng)失衡均會導(dǎo)致腸炎的發(fā)生發(fā)展[35]。在腸上皮細(xì)胞中高表達(dá)且能夠識別犬尿酸在內(nèi)的多種細(xì)菌代謝產(chǎn)物，調(diào)控下游相關(guān)信號通路活性變化[36,37]。這說明在腸道系統(tǒng)中能夠通過監(jiān)測各類細(xì)菌代謝產(chǎn)物濃度變化的方式調(diào)控下游信號通路激活/抑制程度，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸上皮通透性及下游免疫系統(tǒng)活性。在發(fā)生SNP相關(guān)突變后，GPR35識別犬尿酸等代謝物配體能力及激活下游信號通路的能力增強(qiáng)，并持續(xù)促進(jìn)/抑制下游腸上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞抵抗細(xì)菌入侵的進(jìn)程。在發(fā)生腸上皮損傷或菌群失調(diào)等特殊情況下，GPR35相關(guān)信號通路異?；罨瘯?dǎo)致免疫系統(tǒng)與菌群的平衡更容易被破壞，大概率提升腸炎發(fā)病幾率及腸炎嚴(yán)重程度。

綜上所述，本研究初步驗(yàn)證了腸炎相關(guān)SNP位點(diǎn)rs3749171和rs3749172能夠上調(diào)GPR35受體活性，且GPR35激活能夠促進(jìn)DSS誘導(dǎo)的腸炎的發(fā)生發(fā)展。上述結(jié)果將為后續(xù)腸炎發(fā)生病機(jī)制及后續(xù)腸炎治療藥物的開發(fā)提供新的靶點(diǎn)。

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Inflammatory bowel disease susceptible genepromotes bowel inflammation in mice

Yansen Zheng, Lingang Zhuo, Dali Li, Mingyao Liu

Inflammatory bowel disease (IBD) has emerged as a public health challenge with high incidence, recurrence rates and low cure rate. Moreover, sustained inflammation increases the risk of colorectal cancer. The occurrence and progression of IBD are closely related to the genetic mutation. Previous genome-wide association studies (GWAS) analysis demonstrated that the susceptibility loci rs4676410, rs3749171, and rs3749172 in thegene locus increase the risk of IBD, but no direct evidence on the function ofin IBD progression has been shown. To investigate the role ofin IBD, CRISPR/Cas9 technology was employed to construct aknockout mouse strain. TheGpr35mice exhibited lower susceptibility to dextran sodium sulfate-induced IBD model than the wildtype group with a significant reduction in body weight loss, DAI score, intestinal epithelial injury, and macrophage cell infiltration. To explore how the IBD susceptibility loci rs3749171 and rs3749172 regulate GPR35 activity, two mutant forms of GPR35 (T108M and S294R) were constructed. By analyzing the activity of GPR35 downstream signaling pathway, the two mutation forms of GPR35 exhibited higher receptor activity to Zaprinast than the wildtype GPR35. Finally, the Western blotting analysis found an elevated phosphorylation level of ERK1/2 inGpr35colon epithelial after DSS treatment, demonstrating that the loss function ofalleviates the IBD syndrome by activating the ERK1/2 signaling pathway. In summary, the IBD susceptibility loci rs3749171 and rs3749172 may promote the disease progression by activating GPR35 activity, providing a potential drug target for the treatment of inflammatory bowel disease.

rs3749171; rs3749172;; IBD; animal model

2020-11-18;

2020-12-31

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃基金項(xiàng)目(編號：2019YFA0110802)和國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號：81670470, 81873685)資助[Supported by grants from National Key R&D Program of China (No. 2019YFA0110802), and the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81670470, 81873685)]

鄭燕森，在讀博士研究生，專業(yè)方向：腸炎分子機(jī)制研究。E-mail: zhengysen@126.com

李大力，博士，教授，研究方向：動(dòng)物模型構(gòu)建新技術(shù)開發(fā)及基因編輯技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用。E-mail: dlli@bio.ecnu.edu.cn劉明耀，博士，教授，研究方向：G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在疾病發(fā)生過程中的作用。E-mail: myliu@bio.ecnu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-392

2021/1/28 8:34:48

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20210127.1133.001.html

(責(zé)任編委: 盧大儒)