王卓，申笑涵，施奇惠

綜 述

單細胞基因組測序技術(shù)新進展及其在生物醫(yī)學中的應用

王卓，申笑涵，施奇惠

復旦大學生物醫(yī)學研究院, 上海 201100

隨著單細胞基因組測序技術(shù)的建立與發(fā)展，對細胞基因組特征的分析進入了單細胞水平。單細胞的基因組分辨率不但使研究人員能夠在單細胞尺度上分析腫瘤細胞的異質(zhì)性，也使得傳統(tǒng)上難以檢測的稀有細胞的基因組研究成為可能。這些稀有細胞往往具有重要的生物學意義或臨床價值，如癌癥患者血液中循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)的基因組檢測或三代試管嬰兒植入前胚胎細胞的遺傳缺陷診斷與篩查(preim-plantation genetic diagnosis/screening, PGD/PGS)。本文總結(jié)了近年來發(fā)展的各種單細胞基因組擴增技術(shù)及其優(yōu)缺點，并介紹了單細胞基因組測序技術(shù)在腫瘤生物學和臨床檢測中的應用，以期為單細胞基因組測序技術(shù)在臨床檢測中應用開發(fā)提供參考。

單細胞全基因組；高通量測序；異質(zhì)性；循環(huán)腫瘤細胞

細胞是構(gòu)成生命體的基本單元，正如物理在原子層面進行研究，化學在分子層面進行研究，生物學基于細胞進行研究。細胞在統(tǒng)一的基因組藍圖和時空特異性調(diào)控下，由一個受精卵分化出各種形態(tài)、位置、功能不同的細胞，從而構(gòu)成一個完整的生命體。腫瘤作為一種由基因組異常導致的惡性病變，其細胞之間存在著基因組層面上的異質(zhì)性，這就使腫瘤成為了一組具有不同基因組特征構(gòu)成的細胞的集合體。這種異質(zhì)性的解析對于理解腫瘤的演化規(guī)律、耐藥機制以及發(fā)展有效的治療方法有著重要的意義。但是，早期的測序技術(shù)只能用于包含大量細胞的樣本，然后通過計算機重構(gòu)模擬細胞之間的差異。單細胞測序技術(shù)的建立和發(fā)展使研究人員能夠真正從單細胞水平上研究細胞間的異質(zhì)性，包括單細胞基因組單堿基突變差異(single-nucleotide variants, SNV)、短序列插入/缺失(insertions and deletions, Indel)和拷貝數(shù)變異(copy number variants, CNV)等，以及單細胞基因表達差異和單細胞蛋白修飾差異等[1,2]。除了腫瘤異質(zhì)性研究以外，單細胞測序所具有的分辨率也使得對具有重要生物學意義或臨床價值的稀有細胞的基因組研究成為可能，如循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)或三代試管嬰兒植入前的遺傳缺陷診斷與篩查(preimplantation genetic diag-nosis/screening, PGD/PGS)。單細胞基因組測序主要包括3個部分：單細胞獲取、單細胞全基因組擴增和擴增產(chǎn)物測序及分析。本文總結(jié)了近年來單細胞基因組擴增技術(shù)的發(fā)展及優(yōu)缺點，并介紹了單細胞基因組測序技術(shù)在腫瘤生物學和臨床檢測中的應用。

1 單細胞的獲取

單細胞測序首先需要獲取感興趣的單細胞樣本。研究中通常采用機械剪切結(jié)合酶解方法將組織消化成單細胞懸液，單細胞消化過程為了避免消化不充分從而導致細胞類型不均一，通常采用多種水解酶混合使用，單細胞樣本的回收根據(jù)實驗需要選擇合適的技術(shù)平臺(表1)。使用口吸管[3]或顯微操作儀(micromanipulation)[4]回收單細胞，可以借助顯微鏡直觀的觀察目標單細胞，可視化、準確、回收成功率高，但對操作人員技術(shù)要求較高，單細胞回收通量比較低。口吸管或顯微操作技術(shù)適用于目標細胞較少且珍貴樣本，如循環(huán)腫瘤細胞或輔助生殖移植前胚胎細胞。流式細胞分選技術(shù)(fluorescence activ-ated cell sorting, FACS)[5]的應用非常廣泛，F(xiàn)ACS可以高通量、高效的將目標單細胞樣本回收到96孔板或384孔板中，與高通量、標準化實驗操作兼容。如果借助熒光標記的單克隆抗體可以標記細胞亞群，F(xiàn)ACS還可以有選擇的回收某一特定類型單細胞。缺點是FACS對細胞有一定損傷，對起始細胞數(shù)量有一定要求，細胞數(shù)量較少的細胞亞群或珍貴樣本不適合使用FACS進行單細胞回收。激光顯微切割捕獲技術(shù)(laser-capture microdissection, LCM)[6]通常被用于分離回收固定染色切片上的目標細胞樣本，LCM技術(shù)的優(yōu)點是可以確定單細胞在組織樣本中的空間位置，但設備操作者需要對組織樣本非常熟悉，因為是從組織原位回收目的細胞，需要操作者分辨出目標細胞和非目標細胞[7]，對操作者技術(shù)要求也比較高，LCM是唯一能夠獲取目標細胞空間位置的技術(shù)。微流控芯片平臺[8,9]用于單細胞回收的優(yōu)點是通量高，效率高，自動化程度高，能夠與下游分子生物學反應集成化，全部在微流控芯片上完成，降低污染，降低人為操作導致的實驗偏差，反應體積小，反應效率高，節(jié)約試劑使用量，但微流控平臺對技術(shù)要求比較高，如果自己搭建微流控芯片平臺很多普通生物學實驗室沒有相關(guān)技術(shù)支持，使用全自動商業(yè)化儀器，設備成本較高。

表1 單細胞分離技術(shù)優(yōu)缺點比較

2 單細胞全基因組擴增技術(shù)的發(fā)展

哺乳動物由受精卵發(fā)育成完整個體，受精卵基因組遺傳自父親和母親，分析基因組特定基因堿基序列可以分析家系遺傳追蹤。腫瘤細胞積累新的基因突變可以形成新的腫瘤細胞克隆亞群。應用基因測序可以分析腫瘤細胞基因組單堿基突變、插入和缺失、拷貝數(shù)變異和染色體結(jié)構(gòu)變異。單細胞基因組DNA大約5.6 pg，滿足不了測序要求，即使最新的三代測序技術(shù)對樣本量要求降低很多[10]，也需要對單細胞基因組進行預擴增。單細胞培養(yǎng)可以實現(xiàn)核酸在胞內(nèi)的擴增，但細胞培養(yǎng)只適用于少量細胞類型，如部分干細胞、腫瘤細胞系等，臨床檢測所分離的稀有細胞原代培養(yǎng)成功率還不高，暫時不具備普遍應用的價值，腫瘤細胞在人為培養(yǎng)下，可能會積累新的基因突變，因此臨床上單細胞基因組預擴增主要使用體外試劑擴增技術(shù)。單細胞基因組預擴增技術(shù)主要有基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增、多重置換擴增(multiple displace-ment amplification, MDA)和體外轉(zhuǎn)錄(trans-cription technology, IVT)等技術(shù)(圖1)。

2.1 基于PCR的單細胞基因組擴增技術(shù)

隨機寡核苷酸引物PCR技術(shù)(primer-extension preamplification PCR, PEP-PCR)[11,12]或簡并引物PCR技術(shù)(degenerate oligonucleotide-primed PCR, DOP-PCR)[13,14]首先應用引物隨機結(jié)合在單細胞基因組上，通過PCR反應隨機擴增全基因組序列。而接頭介導的PCR技術(shù)(ligation-mediated PCR, LM-PCR)[15]則是使用限制性內(nèi)切酶Mse I在基因組5?-TTAA-3?位置隨機切斷單細胞基因組DNA，然后在DNA片段末端加上擴增引物，也是通過PCR反應擴增基因組DNA片段。PEP-PCR、DOP-PCR和LM-PCR技術(shù)作為單細胞基因組DNA擴增技術(shù)的雛形，最先實現(xiàn)了單細胞基因組DNA的擴增，滿足了某些研究的需要。但PCR擴增反應具有堿基偏好性導致基因組擴增存在偏向性，全基因組擴增產(chǎn)物覆蓋度不足10%[16]，PCR擴增反應堿基錯配率偏高，此類單細胞基因組擴增技術(shù)不適用于檢測基因點突變，假陽性率較高。

圖1 單細胞全基因組擴增技術(shù)的發(fā)展

A：單細胞全基因組擴增技術(shù)發(fā)展時間軸；B：人工單細胞全基因組擴增技術(shù)；C：自動化單細胞基因組擴增技術(shù)。

2.2 多重置換擴增技術(shù)

Dean等[17,18]創(chuàng)造性的開發(fā)了新的單細胞基因組擴增方法—多重置換擴增技術(shù)，phi29 DNA聚合酶在恒溫條件下擴增單細胞基因組，phi29 DNA聚合酶具有很強DNA合成活性和鏈置換活性，擴增產(chǎn)物可大于10 kb，以新合成的DNA子鏈為模板，繼續(xù)合成新的DNA子鏈，所以MDA反應后擴增產(chǎn)量高，而且phi29 DNA聚合酶保真性好，與PCR反應使用的DNA聚合酶相比，擴增產(chǎn)物保真度提高1000倍，基因組擴增覆蓋度更高，MDA技術(shù)比較適合檢測單細胞基因組SNV，但MDA指數(shù)擴增會導致有些基因組區(qū)域偏向性[19]，因此不適用于基因組CNV檢測，另外，高效的phi29 DNA聚合酶會導致基因融合和等位基因丟失的現(xiàn)象[20]。為了解決MDA指數(shù)擴增所導致的偏向性，F(xiàn)u等[21]將單細胞基因組隨機片段化，借助微流控芯片生成的乳滴將DNA片段和預擴增試劑包裹起來，形成小的空間，借助乳滴中擴增反應最小限制因子來終止擴增反應，避免了傳統(tǒng)MDA技術(shù)基因組擴增時，基因組某些區(qū)域無限擴增的偏向性，同時借助乳滴物理隔離DNA片段，降低了單細胞擴增時人為導致的基因融合，但phi29 DNA聚合酶對不完整DNA擴增效率較低，可能會降低擴增產(chǎn)物基因組覆蓋度。MDA技術(shù)比較適合新鮮樣本的單細胞基因組擴增，不適合用于固定后的單細胞樣本。

2.3 多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(shù)

多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(shù)(multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC)[22]將PCR和MDA技術(shù)聯(lián)合，同時兼顧了單細胞基因組擴增的保真度和均一性。MALBAC單細胞基因組擴增分為兩個過程：前5個循環(huán)采用Bst DNA聚合酶完成多重置換擴增，完整的擴增產(chǎn)物兩端引入互補序列可以形成loop結(jié)構(gòu)，封閉新擴增的DNA子鏈，避免新合成的DNA子鏈被當作擴增反應DNA模板；PCR擴增利用高溫變性將完整的擴增子loop結(jié)構(gòu)打開，經(jīng)過PCR反應完成單細胞基因組擴增。MALBAC技術(shù)利用loop結(jié)構(gòu)抑制了指數(shù)擴增，盡可能的從單細胞原始基因組模板合成子鏈DNA，第二步擴增使用PCR方法盡可能的保證擴增產(chǎn)物的均一性。MALBAC技術(shù)第一步應用多重置換反應將擴增產(chǎn)物全基因組覆蓋度提高到90%以上，在一定程度保證了擴增產(chǎn)物的保真性，適用于SNV的檢測，同時loop結(jié)構(gòu)巧妙的應用實現(xiàn)了單細胞基因組準線性擴增，抑制了第一步反應指數(shù)擴增，盡可能的從單細胞原始基因組模板合成子鏈DNA，保證了擴增產(chǎn)物的均一性，可用于基因組拷貝數(shù)變異的檢測。MALBAC技術(shù)可以同時用于新鮮樣本和固定后的單細胞樣本的單細胞基因組擴增，MALBAC技術(shù)的應用促進了臨床輔助生殖技術(shù)的發(fā)展[23]。

2.4 單細胞基因組線性擴增技術(shù)

Tn5轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)因其可以在基因組DNA上隨機打斷，在打斷位置插入一段已知序列，并且穩(wěn)定性好的特點，已經(jīng)成為分子遺傳研究和基因診斷應用的常用工具酶[24]。通過轉(zhuǎn)座子介導的單細胞基因組線性擴增技術(shù)(linear amplification via transposon insertion, LIANTI)[25]利用Tn5轉(zhuǎn)座酶打斷基因組DNA時引入T7啟動子，通過體外轉(zhuǎn)錄以基因組DNA片段為模板，大量合成mRNA，再通過mRNA合成大量cDNA雙鏈，每次轉(zhuǎn)錄合成mRNA都是以最原始的DNA片段為模板，實現(xiàn)了單細胞基因組線性擴增。LIANTI技術(shù)使得單細胞基因組測序覆蓋提高到97%，同時兼顧了擴增的均一性，而且降低了擴增錯誤率，等位基因丟失率僅17%。LIANTI技術(shù)可同時適用于檢測單細胞SNV、Indel和CNV。實驗中擴增后的cDNA雙鏈仍然使用傳統(tǒng)的高通量測序文庫構(gòu)建方法，仍然是每個單細胞擴增后的DNA片段單獨構(gòu)建文庫，所以LIANTI測序通量有限。

2.5 高通量單細胞基因組擴增技術(shù)

腫瘤細胞基因組進化重建研究往往需要一次性研究大量腫瘤單細胞基因組突變特征，低通量的單細胞測序技術(shù)成本高，高人力成本。2017年，加拿大英屬哥倫比亞大學的Hansen課題組和美國俄勒岡健康與科學大學的Adey課題組同時發(fā)表文章，報道利用Tn5轉(zhuǎn)座酶開發(fā)了大規(guī)模、低成本的單細胞基因組CNV測序技術(shù)[26,27]。直接建庫技術(shù)(direct library preparation, DLP)[26]借助微流控平臺實現(xiàn)單細胞樣本的獲取，利用Tn5轉(zhuǎn)座酶打斷DNA引入接頭時并沒有添加index，通過11個PCR循環(huán)反應引入index和測序接頭，將多個單細胞文庫混合后進行基因測序。單細胞組合標簽測序技術(shù)(single-cell combinatorial index sequencing, SCI-seq)[27]使用FACS將單細胞回收到96孔板中，在Tn5轉(zhuǎn)座酶打斷DNA引入接頭時添加index1，然后將添加index1的DNA片段混勻后重新分組，通過PCR循環(huán)反應引入index2，再將文庫混勻后進行基因測序。DLP和SCI-seq技術(shù)適用于高通量的、低成本單細胞CNV分析，由于Tn5轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)酶切后的DNA片段存在一些大片段，超出了二代測序讀長范圍，導致基因組覆蓋度降低，所以不適用于單細胞SNV和Indel檢測，而且DLP和SCI-seq技術(shù)在PCR擴增過程中仍然會引入一定偏向性。為了降低PCR擴增DNA片段帶來的偏向性，Yin等[28]將sci技術(shù)和LIANTI技術(shù)結(jié)合并進行了優(yōu)化，開發(fā)了一種高通量單細胞基因組線性擴增技術(shù)(sci-L3-WGS)。借助sci組合標簽技術(shù)，sci-L3-WGS大大提高了LIANTI技術(shù)的通量。第一輪加標簽，Tn5轉(zhuǎn)座酶隨機打斷單細胞基因組并加上標簽1，第二輪加標簽2和T7轉(zhuǎn)錄啟動子序列連接到DNA片段末端，T7轉(zhuǎn)錄啟動子的引入，可以實現(xiàn)體外轉(zhuǎn)錄反應，以DNA片段為模板，線性擴增的方式合成大量mRNA，再將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成cDNA第二條鏈的時候再引入標簽3，最后在DNA片段末端加上測序接頭，完成的文庫DNA片段含有3種標簽組合，因此sci-L3- WGS技術(shù)可以實現(xiàn)高通量單細胞基因組線性擴增。sci-L3-WGS技術(shù)細胞回收率高達90%，以更少的測序數(shù)據(jù)達到更高覆蓋度，單細胞基因組可覆蓋約97,000片段，測序數(shù)據(jù)高達86%為有效reads，比LIANTI技術(shù)61%的有效reads提高了25%。

以上高通量技術(shù)雖然一定程度上解決了單細胞基因組測序細胞通量問題，自動化平臺則可以進一步減少人為操作，大大提高實驗效率。Tapestri技術(shù)平臺最先使用微流控平臺實現(xiàn)單細胞多基因突變檢測[29]，采用油包水的方式高通量的分離單細胞，使用多重PCR特異性擴增多個目標區(qū)域靶序列，引入barcode，通過高通量測序?qū)崿F(xiàn)單細胞靶基因SNV檢測，同時利用擴增的目標片段可以低分辨率的分析單細胞CNV，只是擴增區(qū)域有限，覆蓋度不是很高。單細胞捕獲效率有限，需要一次性上機大量單細胞樣本，不適合少量單細胞樣本的檢測。10× genomics是另一款基于微流控自動化、高通量的檢測單細胞基因組拷貝數(shù)變異的平臺[30]，10×genomics進行單細胞基因組測序時需要進行兩次捕獲，第一次將磁球與單細胞包裹在一起，通過磁球上引物隨機擴增單細胞基因組片段，第二次將凝膠球與磁球包裹起來，將barcode標記到單細胞DNA片段上，一次操作可以檢測數(shù)千個腫瘤單細胞基因組拷貝數(shù)變異，進而基于腫瘤單細胞CNV特征對腫瘤細胞進行分群，因為需要進行兩次捕獲，所以捕獲率只有15%左右。

3 單細胞基因組測序在生物醫(yī)學中的應用

3.1 單細胞基因組測序用于腫瘤異質(zhì)性研究

腫瘤組織由腫瘤祖細胞發(fā)展而來，在腫瘤形成過程中，腫瘤細胞不斷積累新的基因突變，形成腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。腫瘤異質(zhì)性是腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的主要因素之一。研究腫瘤異質(zhì)性與腫瘤臨床診斷和治療息息相關(guān)。腫瘤基因測序通常是提取腫瘤組織中大量細胞基因組DNA，檢測腫瘤細胞基因突變，但這樣檢測的基因突變結(jié)果代表的是多種類型細胞平均化的結(jié)果。單細胞基因組擴增技術(shù)的建立，可以從單細胞水平研究腫瘤細胞基因突變，進而比較腫瘤單細胞之間的基因突變異質(zhì)性。腫瘤異質(zhì)性研究早期，單細胞基因組擴增主要基于PCR技術(shù)完成，雖然擴增后的基因組覆蓋度有限，仍然可以滿足基因組拷貝數(shù)變異的分析。

Klein等[31]從乳腺癌患者骨髓中分離到稀有腫瘤細胞，擴增腫瘤細胞單細胞基因組，利用比較基因組雜交技術(shù)探索腫瘤但細胞CNV突變分析。Martelotto 等[32]基于PCR技術(shù)建立了腫瘤組織石蠟切片(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)樣本單細胞CNV 分析方法。應用NGS建立了一種重現(xiàn)性較好、準確度較高的FFPE樣本單細胞CNV 分析方法，有助于利用臨床腫瘤FFPE樣本，研究腫瘤進化機制。美國德州大學MD安德森癌癥中心Navin課題組應用單細胞基因組測序技術(shù)分析乳腺癌腫瘤單細胞CNV特征，加深了對乳腺癌腫瘤細胞進化機制的理解；應用單細胞基因組測序技術(shù)比較了原位腫瘤組織和轉(zhuǎn)移腫瘤組織中腫瘤單細胞CNV變異差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞與原位灶腫瘤細胞具有類似的CNV變異，通過腫瘤單細胞CNV分析明確了乳腺癌轉(zhuǎn)移確實是由原位腫瘤進展轉(zhuǎn)移到其他器官形成轉(zhuǎn)移病灶的，而不是由完全不同的獨立腫瘤細胞克隆形成的[16]。通過乳腺癌腫瘤單細胞CNV分析，確定了乳腺癌腫瘤細胞“爆發(fā)式”進化模式，即腫瘤細胞CNV突變在乳腺癌原位腫瘤病灶早期就已經(jīng)出現(xiàn)，并形成單克隆或多克隆，在一段時間內(nèi)保持一定的穩(wěn)定[33]。應用空間單細胞基因組測序技術(shù)研究乳腺原位導管癌和侵襲性導管癌腫瘤細胞克隆組成，揭示了乳腺癌多克隆共轉(zhuǎn)移模式。腫瘤原位灶腫瘤細胞多個克隆可以同時轉(zhuǎn)移到新的位置形成轉(zhuǎn)移病灶[34]。

MDA技術(shù)的建立大大提高了單細胞SNV和Indel的檢測，Xu等[35]應用MDA技術(shù)詳細的描繪了一位腎癌患者腫瘤單細胞SNV突變譜，從單細胞水平證明了腎癌相關(guān)突變基因VHL和PBRM1可能與腫瘤發(fā)生沒有直接關(guān)系，而且此腎癌患者腫瘤組織中并沒有鑒定出明顯的主克隆亞群，通過單細胞基因突變檢測預示著腫瘤異質(zhì)性要比之前的認識復雜的多。Hou等[36]和Wang等[37]應用單細胞測序分析了骨髓瘤和乳腺癌單細胞SNV突變譜，揭示了腫瘤單細胞之間堿基突變異質(zhì)性。應用Tapestri高通量技術(shù)平臺，在急性髓細胞性白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者治療后腫瘤單細胞中檢測到攜帶NRAS、KRAS和FLT3突變的，提供了新的用藥靶點[38]。雖然腫瘤細胞系具有均勻的染色體拷貝數(shù)變異，但Velazquez-Villarreal等[30]借助10×genomics高通量單細胞DNA拷貝數(shù)檢測平臺，從單細胞水平揭示了腫瘤細胞系單細胞之間拷貝數(shù)變異差異，發(fā)現(xiàn)了腫瘤細胞系中多個亞克隆，提示腫瘤細胞系較我們之前認識的更復雜。

3.2 單細胞基因組測序用于CTC檢測

單細胞測序技術(shù)的發(fā)展促進了稀有細胞的檢測與應用。血液CTC是由腫瘤組織脫落進入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞，CTC計數(shù)可以用于患者預后療效評估。Jonas等[39]應用單細胞測序分析了非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者骨髓中播散腫瘤細胞(disseminated tumor cell, DTC)和原位腫瘤基因突變特征，確定了DTC的來源。Carlotta等[40]應用單細胞測序分析了腦轉(zhuǎn)移乳腺癌患者CTC基因突變特征，揭示了乳腺癌腦轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路基因突變潛在靶點。應用單細胞測序比較肺癌肺靜脈血和外周血中CTC和原位腫瘤細胞及轉(zhuǎn)移病灶腫瘤細胞基因突變特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTC攜帶了一部分原位腫瘤細胞基因突變特征，而與轉(zhuǎn)移病灶腫瘤細胞基因突變特征更相近，明確了CTC是肺癌轉(zhuǎn)移的中間途徑[41,42]。Carter 等[43]和Su等[44]在各自研究中，應用單細胞測序檢測了小細胞肺癌患者外周血中CTC單細胞CNV 變異特征，基于CTC單細胞CNV突變特征提出了患者接受化療反應預測模型，用于患者化療預后評估。吳保軍等[45]應用單細胞基因組CNV變異分析，從肺癌患者惡性胸腔積液中鑒定出攜帶不同CNV變異的腫瘤細胞亞群，從單細胞水平揭示了肺癌患者惡性腫瘤細胞異質(zhì)性。

3.3 單細胞基因組測序用于胚胎移植前基因診斷和篩查

胚胎移植前PGD主要用于具有家族式遺傳病家庭進行試管嬰兒移植前胚胎基因診斷，可以確保新生兒不攜帶相關(guān)基因異常而進行的胚胎移植前基因檢測；胚胎移植前PGS主要是針對體外受精胚胎進行的染色體倒位等異常的篩查。通常用來做PGD 或PGS的樣本為極體或囊胚期單細胞，能夠用于檢測的DNA含量很少，并且能夠檢測的靶點比較少。單細胞基因組高通量測序技術(shù)的發(fā)展大大提高了PGD或PGS檢測成功率：如CGH芯片、SNP雜交芯片以及NGS測序。Wells等[46]借助DOP-PCR單細胞擴增技術(shù)第一次完成了第一極體單細胞全基因組擴增，并采用CGH芯片成功檢測到胚胎染色體異常情況。Daina等[47]使用MDA擴增胚胎活檢單細胞樣本，第一次完成了Lynch綜合征家庭開展單細胞雙因子PGD，可以從體外培養(yǎng)的胚胎中挑選既健康又具有整數(shù)倍性的胚胎用于胚胎移植。Tobler等[48]回顧性分析了498個胚胎的PGD/PGS結(jié)果，比較了SNP 芯片和CGH 雜交芯片用于MDA擴增胚胎單細胞染色體異常檢測情況，提示SNP芯片和CGH雜交芯片具有類似的異常檢出率。Huang等[49]利用3位孕婦捐獻23枚胚胎樣本，應用MALBAC技術(shù)，比較了MALBAC-scWGS技術(shù)、SNP芯片及CGH芯片用于PGD/PGS的準確性，MALBAC-scWGS檢測結(jié)果與SNP芯片或者CGH芯片結(jié)果重復性達到78.26%，其中有8個胚胎使用三種檢測技術(shù)的檢測結(jié)果完全一致，驗證了MALBAC-scWGS在PGD/ PGS檢測中的應用價值。Wang等[50]將此技術(shù)應用拓展到線粒體基因異常性疾病的PGD/PGS檢測中。單細胞基因組測序技術(shù)的發(fā)展極大的提高了臨床產(chǎn)前診斷技術(shù)的應用和準確性。

4 結(jié)語與展望

單細胞基因組擴增技術(shù)和高通量測序技術(shù)相結(jié)合極大的促進了單細胞基因組測序技術(shù)的發(fā)展，使得研究細胞之間基因差異達到單細胞水平。應用單細胞基因組測序技術(shù)，研究者對腫瘤多樣性、腫瘤異質(zhì)性以及腫瘤克隆進化機制不斷加深理解，同時單細胞基因組測序技術(shù)促進了CTC檢測和PGD/ PGS臨床的應用。多種單細胞基因組測序技術(shù)各有優(yōu)缺點，在科研或臨床應用時應該根據(jù)實際需求選擇合適的單細胞基因組測序技術(shù)。單細胞基因組測序技術(shù)的應用促進了腫瘤異質(zhì)性研究，但仍然需要發(fā)展能夠同時兼顧基因組擴增保真性和均一性的技術(shù)，提高腫瘤單細胞SNV、CNV、SV等基因突變的檢測。隨著腫瘤單細胞研究不斷深入，人們對單細胞多組學的需求會越來越高。Macaulay等[51]最早將單細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組測序聯(lián)合使用，同時檢測同一個單細胞樣本的基因組和轉(zhuǎn)錄組，通過單細胞測序發(fā)現(xiàn)HCC38-BL細胞系10%細胞存在11號染色體三倍體，并通過FISH技術(shù)做了驗證，Tang等[52]應用單細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了黑色素瘤患者不同部位腫瘤單細胞的突變負荷和基因表達特征。腫瘤細胞基因突變負荷檢測揭示了被遮蔽的部位黑色素細胞突變負荷少于暴露于陽光的部位，間歇性暴露于陽關(guān)的背部和四肢的突變負荷多于臉部、脖子等暴露在陽光下的部位。Zhou等[53]聯(lián)合單細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對結(jié)直腸癌腫瘤組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織、癌旁組織、外周血樣品以及健康人外周血中非上皮細胞進行了單細胞測序。研究發(fā)現(xiàn)人體正常組織中免疫細胞、成纖維細胞以及血管內(nèi)皮細胞中廣泛存在少量正常攜帶拷貝數(shù)變異。轉(zhuǎn)錄組測序分析在腫瘤組織成纖維細胞中BGN、RCN3、TAGLN、MYL9和TPM2表達量明顯上調(diào)，鑒定出腫瘤微環(huán)境中成纖維細胞特異性表達的腫瘤標志基因。Hou等[54]又開發(fā)了單細胞基因組、甲基化組和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，Zachariadis等[55]應用Tn5轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進一步提高了單細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組測序的細胞通量。未來單細胞組學技術(shù)開發(fā)不僅僅考慮提高細胞通量，多組學技術(shù)聯(lián)合開發(fā)，同時還需要考慮增加組織空間位置信息。隨著技術(shù)的發(fā)展，單細胞測序技術(shù)會展現(xiàn)出更強的應用價值，供研究者選擇在科學研究中選擇。

[1] Zhou Y, Wang CJ, Zhu CC, Chen JR, Cheng M, Deng YL, Guo Y. Single-cell gene variation analysis method for single gland., 2017, 39(8): 753–762.周彥, 王超杰, 朱純超, 陳江榮, 程酩, 鄧宇亮, 郭妍. 組織單腺體內(nèi)單細胞的基因變異分析方法. 遺傳, 2017, 39(8): 753–762.

[2] Zhao LN, Wang N, Yang GL, Su XB, Han ZG. A method for reliable detection of genomic point mutations based on single-cell target-sequencing., 2020, 42(7): 703–712.趙利楠, 王娜, 楊國良, 蘇現(xiàn)斌, 韓澤廣. 基于單細胞靶向測序探究基因堿基突變的方法. 遺傳, 2020, 42(7): 703–712

[3] Nagano T, Lubling Y, Stevens TJ, Schoenfelder S, Yaffe E, Dean W, Laue ED, Tanay A, Fraser P. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure., 2013, 502(7469): 59–64.

[4] Babbe H, Roers A, Waisman A, Lassmann H, Goebels N, Hohlfeld R, Friese M, Schr?der R, Deckert M, Schmidt S, Ravid R, Rajewsky K. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction., 2000, 192(3): 393–404.

[5] Dalerba P, Kalisky T, Sahoo D, Rajendran PS, Rothenberg ME, Leyrat AA, Sim S, Okamoto J, Johnston DM, Qian DL, Zabala M, Bueno J, Neff NF, Wang JB, Shelton AA, Visser B, Hisamori S, Shimono Y, van de Wetering M, Clevers H, Clarke MF, Quake SR. Single-cell dissection of transcriptional heterogeneity in human colon tumors., 2011, 29(12): 1120–1127.

[6] Frumkin D, Wasserstrom A, Itzkovitz S, Harmelin A, Rechavi G, Shapiro E. Amplification of multiple genomic loci from single cells isolated by laser micro-dissection of tissues., 2008, 8: 17.

[7] Bhattacherjee V, Mukhopadhyay P, Singh S, Roberts EA, Hackmiller RC, Greene RM, Pisano MM. Laser capture microdissection of fluorescently labeled embryonic cranial neural crest cells., 2004, 39(1): 58–64.

[8] Marcus JS, Anderson WF, Quake SR. Microfluidic single-cell mRNA isolation and analysis., 2006, 78(9): 3084–3089.

[9] White AK, VanInsberghe M, Petriv OI, Hamidi M, Sikorski D, Marra MA, Piret J, Aparicio S, Hansen CL. High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR., 2011, 108(34): 13999–14004.

[10] Pushkarev D, Neff NF, Quake SR. Single-molecule sequencing of an individual human genome., 2009, 27(9): 847–850.

[11] Snabes MC, Chong SS, Subramanian SB, Kristjansson K, DiSepio D, Hughes MR. Preimplantation single-cell analysis of multiple genetic loci by whole-genome amplification., 1994, 91(13): 6181–6185.

[12] Zhang L, Cui XF, Schmitt K, Hubert R, Navidi W, Arnheim N. Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis., 1992, 89(13): 5847–5851.

[13] Telenius H, Carter NP, Bebb CE, Nordenskj?ld M, Ponder BA, Tunnacliffe A. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer., 1992, 13(2): 718–725.

[14] Cheung VG, Nelson SF. Whole genome amplification using a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds of genotypes to be performed on less than one nanogram of genomic DNA., 1996, 93(25): 14676–14679.

[15] Klein CA, Schmidt-Kittler O, Schardt JA, Pantel K, Speicher MR, Riethmüller G. Comparative genomic hybridization, loss of heterozygosity, and DNA sequence analysis of single cells., 1999, 96(8): 4494–4499.

[16] Navin N, Kendall J, Troge J, Andrews P, Rodgers L, McIndoo J, Cook K, Stepansky A, Levy D, Esposito D, Muthuswamy L, Krasnitz A, McCombie WR, Hicks J, Wigler M. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing., 2011, 472(7341): 90–94.

[17] Dean FB, Nelson JR, Giesler TL, Lasken RS. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification., 2001, 11(6): 1095–1099.

[18] Dean FB, Hosono S, Fang LH, Wu XH, Faruqi AF, Bray-Ward P, Sun ZY, Zong QL, Du YF, Du J, Driscoll M, Song WM, Kingsmore SF, Egholm M, Lasken RS. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification., 2002, 99(8): 5261–5266.

[19] de Bourcy CF, De Vlaminck I, Kanbar JN, Wang JB, Gawad C, Quake SR. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods., 2014, 9(8): e105585.

[20] Lasken RS, Stockwell TB. Mechanism of chimera formation during the multiple displacement amplification reaction., 2007, 7: 19.

[21] Fu YS, Li CM, Lu SJ, Zhou WX, Tang FC, Xie XS, Huang YY. Uniform and accurate single-cell sequencing based on emulsion whole-genome amplification., 2015, 112(38): 11923–11928.

[22] Zong CH, Lu SJ, Chapman AR, Xie XS. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell., 2012, 338(6114): 1622– 1626.

[23] Yao YX, La YF, Di R, Liu QY, Hu WP, Wang XY, Chu MX. Comparison of different single cell whole genome amplification methods and MALBAC applications in assisted reproduction., 2018, 40(8): 620–631.姚雅馨, 喇永富, 狄冉, 劉秋月, 胡文萍, 王翔宇, 儲明星. 不同單細胞全基因組擴增方法的比較及MALBAC在輔助生殖中的應用. 遺傳, 2018, 40(8): 620–631.

[24] Picelli S, Bj?rklund AK, Reinius B, Sagasser S, Winberg G, Sandberg R. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects., 2014, 24(12): 2033–2040.

[25] Chen CY, Xing D, Tan LZ, Li H, Zhou GY, Huang L, Xie XS. Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI)., 2017, 356(6334): 189–194.

[26] Zahn H, Steif A, Laks E, Eirew P, VanInsberghe M, Shah SP, Aparicio S, Hansen CL. Scalable whole-genome single-cell library preparation without preamplification., 2017, 14(2): 167–173.

[27] Vitak SA, Torkenczy KA, Rosenkrantz JL, Fields AJ, Christiansen L, Wong MH, Carbone L, Steemers FJ, Adey A. Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing., 2017, 14(3): 302– 308.

[28] Yin Y, Jiang Y, Lam KWG, Berletch JB, Disteche CM, Noble WS, Steemers FJ, Camerini-Otero RD, Adey AC, Shendure J. High-throughput single-cell sequencing with linear amplification., 2019, 76(4): 676–690.e10.

[29] Pellegrino M, Sciambi A, Treusch S, Durruthy-Durruthy R, Gokhale K, Jacob J, Chen TX, Geis JA, Oldham W, Matthews J, Kantarjian H, Futreal PA, Patel K, Jones KW, Takahashi K, Eastburn DJ. High-throughput single-cell DNA sequencing of acute myeloid leukemia tumors with droplet microfluidics., 2018, 28(9): 1345– 1352.

[30] Velazquez-Villarreal EI, Maheshwari S, Sorenson J, Fiddes IT, Kumar V, Yin YF, Webb MG, Catalanotti C, Grigorova M, Edwards PA, Carpten JD, Craig DW. Single-cell sequencing of genomic DNA resolves sub-clonal heterogeneity in a melanoma cell line., 2020, 3(1): 318.

[31] Klein CA, Schmidt-Kittler O, Schardt JA, Pantel K, Speicher MR, Riethmüller G. Comparative genomic hybridization, loss of heterozygosity, and DNA sequence analysis of single cells., 1999, 96(8): 4494–4499.

[32] Martelotto LG, Baslan T, Kendall J, Geyer FC, Burke KA, Spraggon L, Piscuoglio S, Chadalavada K, Nanjangud G, Ng CKY, Moody P, D'Italia S, Rodgers L, Cox H, da Cruz Paula A, Stepansky A, Schizas M, Wen HY, King TA, Norton L, Weigelt B, Hicks JB, Reis-Filho JS. Whole-genome single-cell copy number profiling from formalin-fixed paraffin-embedded samples., 2017, 23(3): 376–385.

[33] Gao RL, Davis A, McDonald TO, Sei E, Shi XQ, Wang Y, Tsai PC, Casasent A, Waters J, Zhang H, Meric-Bernstam F, Michor F, Navin NE. Punctuated copy number evolution and clonal stasis in triple-negative breast cancer., 2016, 48(10): 1119–1130.

[34] Casasent AK, Schalck A, Gao RL, Sei E, Long A, Pangburn W, Casasent T, Meric-Bernstam F, Edgerton ME, Navin NE. Multiclonal invasion in breast tumors identified by topographic single cell sequencing., 2018, 172(1–2): 205–217.e212.

[35] Xu X, Hou Y, Yin XY, Bao L, Tang AF, Song LT, Li FQ, Tsang S, Wu K, Wu HJ, He WM, Zeng L, Xing MJ, Wu RH, Jiang H, Liu X, Cao DD, Guo GW, Hu XD, Gui YT, Li ZS, Xie WY, Sun XJ, Shi M, Cai ZM, Wang B, Zhong MM, Li JX, Lu ZH, Gu N, Zhang XQ, Goodman L, Bolund L, Wang J, Yang HM, Kristiansen K, Dean M, Li YR, Wang J. Single-cell exome sequencing reveals single- nucleotide mutation characteristics of a kidney tumor., 2012, 148(5): 886–895.

[36] Hou Y, Song LT, Zhu P, Zhang B, Tao Y, Xu X, Li FQ, Wu K, Liang J, Shao D, Wu HJ, Ye XF, Ye C, Wu RH, Jian M, Chen Y, Xie W, Zhang RR, Chen L, Liu X, Yao XT, Zheng HC, Yu C, Li QB, Gong ZL, Mao M, Yang X, Yang L, Li JX, Wang W, Lu ZH, Gu N, Laurie G, Bolund L, Kristiansen K, Wang J, Yang HM, Li Y, Zhang XQ, Wang J. Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-negative myeloproliferative neoplasm., 2012, 148(5): 873–885.

[37] Wang Y, Waters J, Leung ML, Unruh A, Roh W, Shi XQ, Chen K, Scheet P, Vattathil S, Liang H, Multani A, Zhang H, Zhao R, Michor F, Meric-Bernstam F, Navin NE. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing., 2014, 512(7513): 155–160.

[38] McMahon CM, Ferng T, Canaani J, Wang ES, Morrissette JJD, Eastburn DJ, Pellegrino M, Durruthy-Durruthy R, Watt CD, Asthana S, Lasater EA, DeFilippis R, Peretz CAC, McGary LHF, Deihimi S, Logan AC, Luger SM, Shah NP, Carroll M, Smith CC, Perl AE. Clonal selection with Ras pathway activation mediates secondary clinical resistance to selective FLT3 inhibition in acute myeloid leukemia., 2019, 9(8): 1050–1063.

[39] Demeulemeester J, Kumar P, M?ller EK, Nord S, Wedge DC, Peterson A, Mathiesen RR, Fjelldal R, Zamani Esteki M, Theunis K, Fernandez Gallardo E, Grundstad AJ, Borgen E, Baumbusch LO, B?rresen-Dale AL, White KP, Kristensen VN, Van Loo P, Voet T, Naume B. Tracing the origin of disseminated tumor cells in breast cancer using single-cell sequencing., 2016, 17(1): 250.

[40] Riebensahm C, Joosse SA, Mohme M, Hanssen A, Matschke J, Goy Y, Witzel I, Lamszus K, Kropidlowski J, Petersen C, Kolb-Kokocinski A, Sauer S, Borgmann K, Glatzel M, Müller V, Westphal M, Riethdorf S, Pantel K, Wikman H. Clonality of circulating tumor cells in breast cancer brain metastasis patients., 2019, 21(1): 101.

[41] Chemi F, Rothwell DG, McGranahan N, Gulati S, Abbosh C, Pearce SP, Zhou C, Wilson GA, Jamal-Hanjani M, Birkbak N, Pierce J, Kim CS, Ferdous S, Burt DJ, Slane-Tan D, Gomes F, Moore D, Shah R, Al Bakir MA, Hiley C, Veeriah S, Summers Y, Crosbie P, Ward S, Mesquita B, Dynowski M, Biswas D, Tugwood J, Blackhall F, Miller C, Hackshaw A, Brady G, Swanton C, Dive C, Consortium T. Pulmonary venous circulating tumor cell dissemination before tumor resection and disease relapse., 2019, 25(10): 1534–1539.

[42] Ni XH, Zhuo ML, Su Z, Duan JC, Gao Y, Wang ZJ, Zong CH, Bai H, Chapman AR, Zhao J, Xu LY, An TT, Ma Q, Wang YY, Wu MN, Sun Y, Wang SH, Li ZX, Yang XD, Yong J, Su XD, Lu YY, Bai F, Xie XS, Wang J. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients., 2013, 110(52): 21083–21088.

[43] Carter L, Rothwell DG, Mesquita B, Smowton C, Leong HS, Fernandez-Gutierrez F, Li YY, Burt DJ, Antonello J, Morrow CJ, Hodgkinson CL, Morris K, Priest L, Carter M, Miller C, Hughes A, Blackhall F, Dive C, Brady G. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer., 2017, 23(1): 114–119.

[44] Su Z, Wang ZJ, Ni XH, Duan JC, Gao Y, Zhuo ML, Li RY, Zhao J, Ma Q, Bai H, Chen HY, Wang SH, Chen XX, An TT, Wang YY, Tian YH, Yu JY, Wang D, Xie XLS, Bai F, Wang J. Inferring the evolution and progression of small-cell lung cancer by single-cell sequencing of circulating tumor cells., 2019, 25(16): 5049–5060.

[45] Wu BJ, Wang Z, Dong Y, Deng YL, Shi QH. Identification and single-cell sequencing analysis of rare tumor cells in malignant pleural effusion of lung cancer patients., 2019, 41 (2): 175–184.吳保軍, 王卓, 董宇, 鄧宇亮, 施奇惠. 肺癌惡性胸腔積液中稀有腫瘤細胞的鑒定與單細胞測序分析. 遺傳, 2019, 41 (2): 175–184.

[46] Wells D, Escudero T, Levy B, Hirschhorn K, Delhanty JDA, Munné S. First clinical application of comparative genomic hybridization and polar body testing for preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy., 2002, 78(3): 543–549.

[47] Daina G, Ramos L, Obradors A, Rius M, Martinez- Pasarell O, Polo A, Del Rey J, Obradors J, Benet J, Navarro J. First successful double-factor PGD for lynch syndrome: monogenic analysis and comprehensive aneuploidy screening., 2013, 84(1): 70–73.

[48] Tobler KJ, Brezina PR, Benner AT, Du LK, Xu X, Kearns WG. Two different microarray technologies for preim-plantation genetic diagnosis and screening, due to reci-procal translocation imbalances, demonstrate equivalent euploidy and clinical pregnancy rates., 2014, 31(7): 843–850.

[49] Huang J, Yan LY, Fan W, Zhao N, Zhang Y, Tang FC, Xie XS, Qiao J. Validation of multiple annealing and looping- based amplification cycle sequencing for 24-chromosome aneuploidy screening of cleavage-stage embryos., 2014, 102(6): 1685–1691.

[50] Shang W, Zhang YS, Shu MM, Wang WZ, Ren LK, Chen F, Shao L, Lu SJ, Bo SP, Ma SJ, Gao YM. Comprehensive chromosomal and mitochondrial copy number profiling in human IVF embryos., 2018, 36(1): 67–74.

[51] Macaulay IC, Haerty W, Kumar P, Li YI, Hu TXM, Teng MJ, Goolam M, Saurat N, Coupland P, Shirley LM, Smith M, Van der Aa N, Banerjee R, Ellis PD, Quail MA, Swerdlow HP, Zernicka-Goetz M, Livesey FJ, Ponting CP, Voet T. G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes., 2015, 12(6): 519–522.

[52] Tang J, Fewings E, Chang D, Zeng HL, Liu SS, Jorapur A, Belote RL, McNeal AS, Tan TM, Yeh I, Arron ST, Judson-Torres RL, Bastian BC, Shain AH. The genomic landscapes of individual melanocytes from human skin., 2020, 586(7830): 600–605.

[53] Zhou Y, Bian SH, Zhou X, Cui YL, Wang WD, Wen L, Guo LM, Fu W, Tang FC. Single-cell multiomics sequencing reveals prevalent genomic alterations in tumor stromal cells of human colorectal cancer., 2020, 38(6): 818–828.e5.

[54] Hou Y, Guo HH, Cao C, Li XL, Hu BQ, Zhu P, Wu XL, Wen L, Tang FC, Huang YY, Peng JR. Single-cell triple omics sequencing reveals genetic, epigenetic, and transcriptomic heterogeneity in hepatocellular carcinomas., 2016, 26(3): 304–319.

[55] Zachariadis V, Cheng HT, Andrews N, Enge M. A highly scalable method for joint whole-genome sequencing and gene-expression profiling of single cells., 2020, 80(3): 541–553.e5.

Advances in single-cell whole genome sequencing technology and its application in biomedicine

Zhuo Wang, Xiaohan Shen, Qihui Shi

The advent and development of single-cell whole-genome sequencing (scWGS) technology has shed lights on the genomic heterogeneities within biosamples at the single-cell resolution. The technology is particularly well-established in the recent decade and witnesses a variety of clinical applications, such as circulating tumor cell (CTC) detection and preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). In this review, we summarize the latest practical breakthroughs of scWGS in the field of biomedicine, with the hope of providing a guideline to apply single-cell genomic sequencing in clinical researches.

single cell whole genome; high throughput sequencing; heterogeneity; circulating tumor cell

2020-12-01;

2021-01-03

中國博士后科學基金面上項目(編號：2019M651377)和上海市“超級博士后”激勵計劃項目(2018-2020)資助[Supported by China Postdoctoral Science Foundation Grant (No. 2019M651377), and Shanghai “Super Postdoctoral Fellow” Program (2018-2020)]

王卓，博士，研究方向：循環(huán)腫瘤細胞鑒定與單細胞測序。E-mail: wangzhuoibs@fudan.edu.cn

施奇惠，博士，研究員，研究方向：液態(tài)活檢與單細胞分析。E-mail: qihuishi@fudan.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-363

2021/1/22 10:34:26

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210122.0900.002.html

(責任編委: 方向東)