宋 莎,劉厚宇，陳松梅,趙 凱，吳亞維

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴陽 550006;2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴陽 550025;3.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽 550025;4.貴州省清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴陽 550004

貴州地方櫻桃資源十分豐富，但對資源保護(hù)、研究利用方面的報(bào)道相對較少。李金強(qiáng)等[1]對貴州櫻桃資源生態(tài)分布、主要特征和利用現(xiàn)狀進(jìn)行初步調(diào)查。宋常美等[2]利用ISSR技術(shù)對貴州櫻桃資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)貴州地方櫻桃資源的多樣性豐富，其中畢節(jié)、遵義及黔南等地資源具有豐富的多樣性，尤其畢節(jié)地區(qū)擁有大量品質(zhì)優(yōu)良的資源，可作為育種的親本。歐茂華[3]對貴州櫻桃屬植物進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)共有16個(gè)種，其中典型櫻桃亞屬12個(gè)種和矮生櫻桃亞屬4個(gè)種。然而近年來，少數(shù)人采取砍枝、砍樹的掠奪式采收方式,一些優(yōu)良株系逐漸被毀掉,導(dǎo)致本地資源破壞嚴(yán)重[1]。為更好地利用貴州地方櫻桃資源，貴州省果樹科學(xué)研究所自2015年起收集省內(nèi)主要地區(qū)的中國櫻桃種質(zhì)資源，并建立了貴州櫻桃資源圃進(jìn)行資源保存和評價(jià)[4]。本研究利用ISSR (Inter-simple Sequence Repeats Polymorphism)分子標(biāo)記技術(shù)[5-6]對一些野生資源和該櫻桃資源圃中近40種櫻桃進(jìn)行遺傳多樣性檢測，為這些資源的保存及有利基因挖掘和新品種選育提供基礎(chǔ)資料和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為中國櫻桃資源的幼葉，共計(jì)40份(表1)，其中5份資源為野生櫻桃(包括32號和33號，35號云南櫻桃，38號微毛櫻桃和40號采自雷公山的野生櫻桃)，其余材料采自貴州省農(nóng)科院果樹科學(xué)研究所落葉果樹種質(zhì)資源圃。3月中旬，取幼葉于自封袋，冰盒保存迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，清水洗凈后硅膠吸干水分，液氮處理置于-80 ℃℃冰箱保存。

表1 供試櫻桃材料Table 1 Test materials of P.pseudocerasus

1.2 ISSR引物

本試驗(yàn)所用ISSR引物(見表2)，參照宋常美等[2]、田田等[7]的方法。

表2 用于ISSR擴(kuò)增的隨機(jī)引物及其序列Table 2 Random primers and sequences for ISSR amplification

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增及檢測

采用北京天根生物科技公司的植物DNA提取試劑盒(DP 302)。使用核酸微量測定儀及瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA濃度及質(zhì)量。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，Tm(視引物而定)1 min，72 ℃延伸1 min，38個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃終止反應(yīng)。利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測PCR產(chǎn)物，電泳為150 V，電泳時(shí)間根據(jù)不同濃度設(shè)定，范圍在1.2～2.5 h之間。凝膠取出后放入含有5%冰醋酸和10%乙醇的固定液容器中，置搖床上 100 r·min-1固定 15 min。0.1%的硝酸銀置搖床上 100 r·min-1銀染 15 min，迅速用dd H2O快速清洗2次。加入顯色液(-20 ℃預(yù)冷10 min)(包含1.5% NaOH+1.1%甲醛)加入輕搖至條帶清晰，用dd H2O沖洗膠表面的顯色液，拍照分析。

表4 櫻桃源產(chǎn)地遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of origin of P.pseudocerasus

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

電泳后，統(tǒng)計(jì)每個(gè)ISSR位點(diǎn)上重復(fù)性好且清晰的條帶進(jìn)行記錄，以1和0分別記錄等位基因的有無。采用POPGENE 1.32軟件，服從Hardy-Weinberger平衡，分析計(jì)算平均觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)。利用NTSYS.pc統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)[8]。根據(jù)基礎(chǔ)值或者遺傳距離GD(1-GS)按非加權(quán)數(shù)據(jù)分析法(Unweighted pair-group using arithmetic average，UPGMA)進(jìn)行遺傳相似性聚家族。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物的遺傳多樣性研究

篩選出比較好的12條ISSR引物進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果(表3)顯示，引物位點(diǎn)數(shù)在5(引物815)～14(引物807)之間，總位點(diǎn)數(shù)是120，平均位點(diǎn)數(shù)是10.00。引物多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)在3(引物871)～11(引物807)之間，總數(shù)是85，多態(tài)性比率在50%～90%之間，平均多態(tài)性比率是69.01%。觀測等位基因數(shù)在1.50～2.00之間，平均1.75。有效等位基因數(shù)1.11～1.69之間，平均值為1.30。Nei’s遺傳多樣性在0.08～0.27之間，平均為0.19。香濃指數(shù)在0.14～0.52之間，平均值0.30。表明ISSR位點(diǎn)遺傳多樣性較為豐富，但不同ISSR引物在揭示遺傳多樣性方面存在差異，其中，引物866具有最高的多態(tài)比率、觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s遺傳多樣性、香濃指數(shù)，是最有效的引物。

表3 ISSR引物的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of ISSR primers

2.2 ISSR檢測櫻桃遺傳多樣性分析

以不同采集地區(qū)來分析，畢節(jié)市群體遺傳多樣性He最高，達(dá)0.194，其次是凱里市(0.121)，安順市和六盤水市分別為0.87和0.89。香濃指數(shù)畢節(jié)市最高(0.299)，其次是凱里市(0.176)，安順市和六盤水市較低。這些數(shù)據(jù)表明，畢節(jié)市有最高的遺傳多樣性，這與宋常美等[2]的研究結(jié)果一致。

2.3 ISSR對櫻桃主坐標(biāo)分析

對野生資源與栽培資源做主坐標(biāo)分析，結(jié)果如圖1所示，野生資源和栽培資源遺傳距離比較遠(yuǎn)，尤其是來自黔西縣的“紅皮”與“青皮”(表1編號32、33；圖1中編號38、39)櫻桃與其他櫻桃遺傳距離非常遠(yuǎn)，而另外3種野生櫻桃也能與其余的中國櫻桃栽培種區(qū)別開。

2.4 群體間的遺傳變異

地區(qū)群體間的遺傳變異系數(shù)為8%，群體內(nèi)為92%，而野生群體與栽培群體間遺傳變異系數(shù)為35%，群體內(nèi)遺傳變異系數(shù)為65%。野生栽培群體Gst值0.350(p>0.001)，基因流為0.840。地區(qū)種群間Gst值為0.080(p>0.012)。野生與栽培群體間發(fā)生的遺傳變異大于地區(qū)間。Gst值較大，說明雜合子匱乏，純合子較多。

2.5 櫻桃ISSR聚類分析

ISSR分析結(jié)果顯示(圖3)，供試材料遺傳相似性在0.64～0.98之間，以相似性系數(shù)0.81為閾值，可以把野生種和栽培種區(qū)分開，野生櫻桃可以聚為3群組，黔西“紅皮”與“青皮”依然聚在一家族，而且遺傳相似性高達(dá)0.98，與其他所有櫻桃親緣關(guān)系都很遠(yuǎn)。云南櫻桃單獨(dú)聚為一家族，而雷公山的兩種櫻桃與瑪瑙紅櫻桃聚為一家族。相比起來，栽培種內(nèi)的遺傳相似性高于野生種內(nèi)。在以遺傳相似性系數(shù)0.87為閾值時(shí)，栽培種可以聚為3個(gè)亞組，第一群組中，包含七星關(guān)區(qū)1、水城縣2、金沙縣2、六枝特區(qū)2、威寧縣1、修文縣1、關(guān)嶺縣3、普定縣1、水城縣3、盤州市2、盤州市1、盤州市4、關(guān)嶺縣1、六枝特區(qū)3、普定縣2、六枝特區(qū)1、織金縣3、織金縣2、織金縣4、織金縣 5、盤州市3、赫章縣3、大方縣2、大青葉(山東)等24份材料。第二亞組有來自織金縣1、赫章縣2、金沙縣1、七星關(guān)區(qū)2、赫章縣1、黃平縣1以及湄潭縣1等7種櫻桃。第三亞組水城1、關(guān)嶺縣2、大方縣1等3種櫻桃。野生櫻桃群組中，比較意外的是，瑪瑙紅櫻桃聚在與之相近的是雷公山的兩種櫻桃聚在一支(亞組4)，而云南櫻桃與之遺傳距離較遠(yuǎn)(亞組5)，黔西縣的兩種野生櫻桃(亞組6)與所有櫻桃遺傳距離最遠(yuǎn)，每一條引物都能將其與其他櫻桃區(qū)別開來。

一些地理距離近的櫻桃遺傳距離也近，如盤縣發(fā)耳鎮(zhèn)的兩份材料(編號14、29)聚在一起，織金縣小納雍鎮(zhèn)2份材料與織金縣八步鎮(zhèn)的材料(編號12、18、24)聚在一起，雷公山2份材料(編號37、38)聚在一起，黔西縣2份材料(編號32、33)聚在一起。同樣來自關(guān)嶺縣關(guān)索鎮(zhèn)的兩份材料，其中一份(編號20)與盤縣發(fā)耳鎮(zhèn)兩份材料(編號14、29)遺傳距離最近，說明可能存在人工引種，或者自然雜交。

3 討 論

植物遺傳多樣性反映了植物遺傳背景復(fù)雜程度及物種存在的歷史遠(yuǎn)近[9]。以栽培資源和野生資源而論，盡管栽培種數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生資源，但是野生資源還是顯示出高度的遺傳多樣性和變異度，這與Chen Tao等[11]、Zhang Jing等[12]以及王浩等[13]的研究結(jié)果一致，說明野生資源更為古老。與野生資源比，栽培種植資源較低的遺傳多一些，可能與人們對良種推廣的繁殖的偏向性遭受人工選擇壓力以及多采用無性繁殖有關(guān)[14]。中國櫻桃栽培種植資源在長期的馴化過程中經(jīng)歷了嚴(yán)重的奠基者效應(yīng)以及在近期有效動態(tài)變化中產(chǎn)生較強(qiáng)的瓶頸效應(yīng)，使群體中低頻率等位基因嚴(yán)重丟失，而高頻率等位基因在群體中有效固定，從而導(dǎo)致總?cè)后w遺傳多樣性丟失[13]。

前期工作中，對部分野生資源應(yīng)用有所研究，其中來自黔西縣的32號、33號櫻桃，因春梢嫩枝顏色為紅色和綠色，俗稱為紅皮櫻桃與青皮櫻桃，聚類和主坐標(biāo)分析均表明，與其他栽培種和野生種櫻桃遺傳距離最遠(yuǎn)。注意紅皮櫻桃與青皮櫻桃的一些特殊性狀，如兩種櫻桃種子可以不經(jīng)過數(shù)月的低溫沙藏打破休眠而萌發(fā)，也可長時(shí)間置于常溫干燥條件下而不喪失種子活性，這在其他櫻桃中未見報(bào)道。這種特殊的萌發(fā)性狀可能印證了和其他櫻桃親緣關(guān)系遠(yuǎn)，確切的起源還需要進(jìn)一步從植物形態(tài)分類，以及更豐富的櫻桃資源進(jìn)行分子標(biāo)記來探索。在民間栽培實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)以其作為砧木，能促進(jìn)大櫻桃開花結(jié)果。2種櫻桃形態(tài)相近，僅靠一年生嫩枝顏色差異鑒別，分子標(biāo)記技術(shù)也證明紅皮與青皮之間相似性系數(shù)為0.98，推測紅皮櫻桃與青皮櫻桃是芽變關(guān)系。本課題組正在開展對紅皮櫻桃與歐洲甜櫻桃砧穗互作分子機(jī)制的研究。另外，其種子萌發(fā)特性對于研究櫻桃種子休眠機(jī)理提供思路。

瑪瑙紅櫻桃是優(yōu)質(zhì)的櫻桃品種，關(guān)于其起源問題，陳祖瑤等[15]根據(jù)記載認(rèn)為是酸櫻桃變異，宋常美等[16]利用分子標(biāo)記技術(shù)推測酸櫻桃的實(shí)生變異，與酸櫻桃相似系數(shù)為0.57，其中一個(gè)親本可能是歐洲甜櫻桃。本研究發(fā)現(xiàn)，瑪瑙紅櫻桃(編號37)與其他中國櫻桃栽培種遺傳距離較遠(yuǎn)，聚到野生櫻桃這一類中，特別是與來自雷公山的兩種櫻桃遺傳距離最近，推測瑪瑙紅櫻桃可能有野生種的血統(tǒng)，酸櫻桃可能屬于赫章的櫻桃野生種。

根據(jù)宋莎等[4]后期對資源圃櫻桃性狀觀察對照本研究結(jié)果，同一地理來源的櫻桃種質(zhì)，盡管有部分葉片性狀、葉柄顏色等有一定趨同，但是并未嚴(yán)格聚在一類，這種原因產(chǎn)生的結(jié)果可能是：

1) 同一地區(qū)的采集樣本可能會因所處環(huán)境因子的差異導(dǎo)致遺傳基因的變異；

2) 引物標(biāo)記位點(diǎn)較少，使得決定性狀的關(guān)鍵基因連鎖程度較低。本研究結(jié)果可以結(jié)合這些資源的性狀特征進(jìn)行雜交育種，為進(jìn)一步利用這些資源提供參考。

野生資源具有較高的遺傳多樣性，是豐富的基因庫，課題組曾發(fā)現(xiàn)微毛櫻桃具有較高的根癌病抗性，而紅皮櫻桃作為砧木具有促進(jìn)甜櫻桃成花的作用，有必要進(jìn)一步發(fā)掘野生資源的價(jià)值，本研究也為此提供一些理論基礎(chǔ)。