徐勁松，楊海鵬，張紅梅,4，劉小紅，郝耀山，孫 毅

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西 忻州 034000；2.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637002；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心，太原 030031;4.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源和種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031)

溫度是影響作物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素，只有在適宜的溫度環(huán)境中，作物才能較好地生長(zhǎng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)[1-2]。然而進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，地球溫室效應(yīng)的加劇以及全球極端高溫天氣的頻發(fā)，對(duì)糧食的正常生產(chǎn)已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響[3-4]。在作物生長(zhǎng)周期中，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段遭遇持續(xù)高溫脅迫可能導(dǎo)致發(fā)育遲緩，植株矮?。坏窃谏成L(zhǎng)階段，尤其是在受精和灌漿早期如果遭遇高溫脅迫，則可能會(huì)導(dǎo)致配子發(fā)育畸形，嚴(yán)重影響受精過(guò)程，對(duì)產(chǎn)量影響更大[5-7]。

對(duì)玉米來(lái)說(shuō)，在生殖生長(zhǎng)及受精結(jié)實(shí)階段遭遇高溫是一個(gè)常見(jiàn)的自然現(xiàn)象[8]。高溫對(duì)雄配子(花粉)發(fā)育的影響要大于雌配子[9]。在雌雄穗分化至籽粒成熟階段如果遭遇持續(xù)的高溫脅迫，將造成敗育小花數(shù)量增加、花粉結(jié)構(gòu)破壞、活力下降、雌穗結(jié)實(shí)率降低，最終導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收[10]。當(dāng)然，不同玉米材料耐高溫脅迫的能力存在差異[11-12]，在國(guó)內(nèi)耐高溫玉米資源較少，目前僅有鄭單958、中地88等較少的耐高溫品種被選育推廣。因此，以玉米花粉為對(duì)象，研究在高溫環(huán)境下基因的差異表達(dá)具有重要意義。

組蛋白在真核細(xì)胞中具有非常重要的生物學(xué)功能，與基因組DNA一起構(gòu)成了染色質(zhì)，組蛋白幫助染色質(zhì)折疊使其能裝進(jìn)細(xì)胞核的微小空間。組蛋白是含量極其豐富的蛋白質(zhì)，在真核細(xì)胞中與DNA量大致相同。大多數(shù)的真核細(xì)胞含有5類不同的組蛋白：H 1、H 2 A、H 2 B、H 3和H 4，其中H 3組蛋白在不同物種中相當(dāng)保守。目前，對(duì)組蛋白編碼基因及其功能已有較多研究[13-17]，包括H 3組蛋白[18-22]。但是關(guān)于玉米花粉細(xì)胞中組蛋白H 3基因在不同玉米材料中的差異表達(dá)研究還未見(jiàn)報(bào)道。

基于此，本實(shí)驗(yàn)選擇了耐高溫和不耐高溫的2個(gè)玉米材料，在高溫脅迫條件下，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，克隆了一個(gè)玉米花粉細(xì)胞中組蛋白H 3基因，并對(duì)該基因作了生物信息學(xué)和在不同材料中的差異表達(dá)分析，為其他基因類似結(jié)構(gòu)和功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)以耐高溫脅迫的中地88和不耐高溫的先玉335兩個(gè)玉米品種為試驗(yàn)材料，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1玉米花粉采集

兩份玉米材料種植于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所溫室大棚，在散粉期于42 ℃高溫環(huán)境取其花粉，每份材料取4株(作為4個(gè)生物學(xué)重復(fù))，每株取量約300 mg，分別裝入1.5 mL滅菌離心管中并做標(biāo)記，再用錫箔紙包好，迅速投入液氮罐中速凍，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2總RNA的分離純化

選用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)DP 441)提取總RNA(具體方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))，再對(duì)提取的總RNA利用Nanodrop NC 2000設(shè)備進(jìn)行濃度的紫外定量測(cè)定及RNA完整性分析，對(duì)提取的RNA進(jìn)一步用1%濃度瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.2.3轉(zhuǎn)錄組分析

對(duì)總RNA進(jìn)一步作mRNA純化、mRNA片段化、cDNA合成、文庫(kù)片段的PCR富集、文庫(kù)質(zhì)檢、Illumina平臺(tái)高通量測(cè)序。該項(xiàng)工作在南京派森諾基因科技有限公司完成。

1.2.4玉米組蛋白Zm-H3基因的克隆及DNA序列

從返回的結(jié)果文件中，收索到了在2個(gè)玉米材料中存在差異表達(dá)的Zm-H3基因。先用DNAMAN Version 6軟件對(duì)Zm-H3基因的DNA序列進(jìn)行分析，包括脫氧核苷酸組成、序列長(zhǎng)度及分子量等。

1.2.5玉米Zm-H3基因的生物信息學(xué)分析

1) 開(kāi)放閱讀框分析

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)在線軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對(duì)Zm-H3基因的DNA序列作開(kāi)放閱讀框分析，以尋找基因的編碼區(qū)。再利用NCBI網(wǎng)站的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，將該基因預(yù)測(cè)的編碼蛋白利用Blast在線軟件作同源比對(duì)，以預(yù)測(cè)編碼蛋白的生物學(xué)功能。

2) 編碼蛋白的理化性質(zhì)

對(duì)玉米Zm-H3基因編碼蛋白的理化性質(zhì)通過(guò)網(wǎng)絡(luò)在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)分析完成，具體內(nèi)容包括氨基酸組成、等電點(diǎn)、分子量、分子式和原子構(gòu)成、消光系數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶指數(shù)。此外，還進(jìn)一步對(duì)該蛋白的親水/疏水性作在線預(yù)測(cè)(https://web.expasy.org/protscale/)，以確定該蛋白在生理?xiàng)l件下是親水性蛋白還是疏水性蛋白。

3) 編碼蛋白的功能位點(diǎn)

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)在線軟件(https://prosite.expasy.org/)分析Zm-H3基因編碼蛋白的常見(jiàn)功能位點(diǎn)，選擇默認(rèn)參數(shù)設(shè)置。

4) 編碼蛋白的結(jié)構(gòu)

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)在線軟件(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測(cè)Zm-H3基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分析可能形成的螺旋區(qū)域、折疊區(qū)域及無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)在線軟件(https://www.swissmodel.expasy.org/)分析蛋白可能形成的三級(jí)結(jié)構(gòu)，基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白結(jié)構(gòu)信息，以進(jìn)一步確定該蛋白是否屬于真核生物組蛋白H 3。

1.2.6玉米Zm-H3基因的差異表達(dá)分析

根據(jù)2份玉米材料各3次生物學(xué)重復(fù)的轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序結(jié)果，分析Zm-H3基因在2份玉米材料間的差異表達(dá)情況。包括這2份材料各自均一化后的表達(dá)量、差異表達(dá)倍數(shù)及顯著性等。

2 結(jié)果與討論

2.1 總RNA的分離純化

1) 濃度及完整性分析

第一次提取時(shí)，中地88提取了3株(編號(hào)為N 1、N 2、N 3)的花粉總RNA，先玉335也提取了3株(編號(hào)為BN 1、BN 2、BN 3)的花粉總RNA，濃度及完整性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，RNA總量最高的為N 1，達(dá)到了3.94 μg，最低的為BN 3，僅為0.57 μg。在這6個(gè)樣品中，除BN 3外，其余5個(gè)樣品的RNA總量、純度及RIN值都達(dá)到了建庫(kù)要求。對(duì)此，又提了1株(編號(hào)為BN 4)先玉335的花粉總RNA，濃度及完整性測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，提取量達(dá)到了1.70 μg，RNA總量、純度及RIN值都滿足建庫(kù)要求。由此，中地88的3次重復(fù)(N 1、N 2、N 3)和先玉335的3次重復(fù)(BN 1、BN 2、BN 4)進(jìn)一步用于建庫(kù)和差異表達(dá)分析。

表1 提取總RNA的紫外分光光度計(jì)測(cè)定Table 1 Total RNA extract and determined by UV spectrophotometer

2) 電泳分析

對(duì)N 1、N 2、N 3、BN 1、BN 2、BN 3共6個(gè)RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果見(jiàn)圖1(實(shí)際點(diǎn)樣量分別為0.15、0.15、0.12、0.10、0.15、0.06 μg)。除編號(hào)為6的泳道(BN 3)的條帶較模糊外，其余編號(hào)為1～5的條帶都較清晰，該結(jié)果與表1數(shù)據(jù)中各樣品中的RNA濃度測(cè)定結(jié)果一致。對(duì)提取的BN 4樣品的RNA也進(jìn)行了電泳分析，點(diǎn)樣量為0.15 μg時(shí)顯示條帶非常清晰(未列出)，與表1中同一編號(hào)的樣品RNA濃度測(cè)定結(jié)果保持一致。

2.2 玉米Zm-H3基因的克隆

從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果文件中分析得到了編碼玉米組蛋白Zm-H3基因，ID號(hào)為Zm 00001 d 036036，位于玉米第6染色體上(67784534～67785534)，該基因的編碼鏈序列全長(zhǎng)為904 nt (圖2)，含有A、C、T、G四種脫氧核苷酸的數(shù)目分別為192、259、253、200個(gè)，分子量為278.98 kDa。該基因轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA后，分子量為557.38 kDa，GC含量為58.1%。

2.3 玉米組蛋白Zm-H3基因的生物信息學(xué)分析

1) 開(kāi)放閱讀框

將Zm-H3基因序列作開(kāi)放閱讀框分析，結(jié)果共顯示了4個(gè)編碼區(qū)，其中正鏈3個(gè)(蛋白長(zhǎng)度為136、40、25個(gè)氨基酸)，負(fù)鏈1個(gè)(蛋白長(zhǎng)度為31個(gè)氨基酸)。因?yàn)閷?dǎo)入的為DNA編碼鏈序列，所以只考慮正鏈，再根據(jù)氨基酸序列長(zhǎng)度及進(jìn)一步的BLAST蛋白比對(duì)，確定Zm-H3基因的編碼蛋白為組蛋白H 3，編碼蛋白含136個(gè)氨基酸(圖3)，編碼區(qū)為DNA序列中第98～508位，其中第98～100位和第506～508位分別為起始密碼子和終止密碼子。

2) 蛋白的理化性質(zhì)

在線分析結(jié)果顯示：在Zm-H3基因編碼蛋白含有的136個(gè)氨基酸中，帶負(fù)電荷的氨基酸共有11個(gè)(Asp+Glu)，帶正電荷的氨基酸共有31個(gè)(Arg+Lys)；等電點(diǎn)為11.15，屬堿性蛋白；蛋白的分子量為15 406.07，分子式為C679H1144N216O186S3，共由2 228個(gè)原子構(gòu)成；如果所有半胱氨酸殘基縮合成胱氨酸，該蛋白的消光系數(shù)則為4 470；不穩(wěn)定指數(shù)為38.38，屬于穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為83.38。

親水/疏水預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示，親水性總平均值為-0.602，最小值為-2.767(第41位的精氨酸)，最高值為1.444(第101位的亮氨酸)，屬親水性蛋白。

3) 蛋白的功能位點(diǎn)

玉米Zm-H3基因編碼蛋白共預(yù)測(cè)到5個(gè)功能位點(diǎn)(表2)，包括1個(gè)組蛋白H 3信號(hào)序列1、1個(gè)組蛋白H 3信號(hào)序列2、2個(gè)cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)。

表2 玉米Zm-H3基因編碼蛋白的功能位點(diǎn)Table 2 Functional sites analysis of protein encoded by maize Zm-H3 gene

4) 蛋白的結(jié)構(gòu)

對(duì)Zm-H3基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)作在線預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5所示，包括：1) 7個(gè)螺旋區(qū)，具體位置包括：18-21、23-26、47-55、59-62、68-78、87-115和122-131；2) 10個(gè)卷曲區(qū)，螺旋區(qū)外的其它區(qū)域。沒(méi)有預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)折區(qū)。

利用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)Zm-H3基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，共有45個(gè)模板被顯示，與Zm-H3基因編碼蛋白的氨基酸序列一致性最高為96.32%，最低為62.14%，均值為71.95%。所有這些蛋白均顯示為組蛋白H 3。這一結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)本研究克隆的基因的編碼產(chǎn)物為玉米組蛋白H 3。

2.4 玉米Zm-H3基因的差異表達(dá)分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果表明，Zm-H3基因在中地88和先玉335兩個(gè)玉米材料上表現(xiàn)差異顯著(表3)，該基因在耐高溫材料中地88中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在不耐高溫材料先玉335中呈現(xiàn)低表達(dá)，表達(dá)差異達(dá)2.08倍。

表3 玉米Zm-H3基因在不同玉米材料中的表達(dá)Table 3 Expression level of Zm-H3 gene in different maize materials

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以耐高溫的中地88和不耐高溫的先玉335為植物材料，在高溫環(huán)境下利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段對(duì)玉米花粉組蛋白H 3基因進(jìn)行了克隆及表達(dá)分析，得出結(jié)論為：

1) 2個(gè)材料共提取了7株玉米花粉的總RNA，其中有6株(各3個(gè)生物學(xué)重復(fù))的RNA在濃度、總量和完整性3個(gè)方面均滿足建庫(kù)要求；

2) 克隆了一個(gè)組蛋白H 3基因(Zm-H3)，該基因位于玉米第6染色體，全長(zhǎng)cDNA為904 bp，編碼長(zhǎng)度為136個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，對(duì)該蛋白的理化性質(zhì)、功能位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)分析也顯示該基因?yàn)橛衩捉M蛋白Zm-H3基因；

3)Zm-H3基因在42 ℃高溫環(huán)境下，在中地88和先玉335兩個(gè)玉米材料中呈現(xiàn)差異表達(dá)，在中地88材料中的表達(dá)量達(dá)到了先玉335的2.08倍。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為玉米組蛋白H 3基因的應(yīng)用奠定分子基礎(chǔ)，也為其它基因的克隆及表達(dá)分析提供參考。