楊萬娟， 徐杰

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周病科，云南 昆明（650106）

常見的牙周炎有慢性牙周炎（chronic periodon?titis，CP）和侵襲性牙周炎（aggressive periodontitis，AgP）等。當(dāng)CP 發(fā)展至重度慢性牙周炎（severe chronic periodontitis，SCP）時(shí)，牙周支持組織破壞嚴(yán)重，并伴有多種并發(fā)癥；廣泛型侵襲性牙周炎（gen?eralized aggressive periodontitis，GAgP）患者由于病程進(jìn)展快，就診時(shí)通常也存在嚴(yán)重的牙周支持組織破壞，伴多種并發(fā)癥；臨床表現(xiàn)的相似性使SCP和GAgP 在鑒別診斷方面存在一定的局限性。

牙周炎是感染性疾病，隨著牙周炎的進(jìn)展，齦下菌群的多樣性也會(huì)增加［1?2］。因此菌斑生物膜中相關(guān)微生物的檢測是研究病因?qū)W的重要手段［3］。常見的牙周微生物檢測技術(shù)包括細(xì)菌培養(yǎng)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）及DNA 探針等技術(shù)。它們能對牙周致病菌進(jìn)行定性及定量研究，但是能一次性同時(shí)檢測的細(xì)菌數(shù)量有限，在菌群研究方面存在局限性。

近年來，研究者將高通量測序（high?throughput sequencing，HTS）技術(shù)用于牙周炎相關(guān)微生物的研究，并取得了一定的進(jìn)展。該技術(shù)能夠進(jìn)行大規(guī)模并行測序，具有高通量、高效率和高準(zhǔn)確度的優(yōu)勢，能夠?qū)ρ乐芪⑸锶郝涞慕M成、多樣性、菌群關(guān)系及群落功能等多方面信息展開研究［4］。因此本研究選擇以GAgP 與SCP 患者為研究對象，利用HTS 檢測上述兩種疾病齦下菌群的組成和多樣性等信息，并觀察基礎(chǔ)治療前后兩者齦下菌群的變化。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2018 年9 月至2019 年5 月在昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周病科就診的11 例GAgP 患者和14 例SCP 患者。其中GAgP 患者年齡21～32 歲，平均（26.16 ± 4.40）歲，男性4 例，女性7 例；SCP 患者年齡36～64 歲，平均（44.36 ± 8.51）歲，男性8例，女性6 例。診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照1999 年牙周病分類國際研討會(huì)所制定的標(biāo)準(zhǔn)。所有患者試驗(yàn)前均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①GAgP 患者年齡不超過35 歲，全口至少有6 顆取樣患牙，探診深度（probing depth，PD）≥ 6 mm，臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL）≥5 mm，X 線片顯示有鄰面牙槽骨吸收，無明顯的咬合關(guān)系異常，未接受正畸治療；②SCP 患者年齡35 歲以上，全口至少有6 顆取樣患牙，PD ≥6 mm，CAL ≥5 mm，牙槽骨吸收超過根長的1/2；③半年內(nèi)未進(jìn)行過任何牙周治療；④3 個(gè)月內(nèi)未使用過抗生素或非甾體類抗炎藥；⑤至少有20 顆天然牙，且每個(gè)象限都余留有天然牙；⑥同意參加此項(xiàng)研究。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：①妊娠及哺乳期婦女；②患有糖尿病、心血管疾病和血液性疾病等系統(tǒng)性疾病者；③吸煙者。

1.2 牙周檢查及治療

記錄納入病例PD、CAL 和探診出血等指標(biāo)，進(jìn)行牙周基礎(chǔ)治療，包括齦上潔治、齦下刮治、根面平整和口腔衛(wèi)生指導(dǎo)。牙周基礎(chǔ)治療的方法：使用瑞士EMS 牙周治療儀進(jìn)行齦上潔治，齦下刮治、根面平整及拋光，同時(shí)進(jìn)行口腔衛(wèi)生指導(dǎo)，1 周后復(fù)診再次清理殘余牙石。齦上潔治效果是肉眼看不到牙石和色素，齦下刮治及根面平整效果是探診根面光滑平整，無殘余牙石。

1.3 樣本采集及基因組DNA 提取

在基線及牙周基礎(chǔ)治療后第6 周分別采集齦下菌斑，兩次采集位點(diǎn)相同，共采集50 個(gè)樣本。GAgP 基線時(shí)樣本記為QA 組，牙周治療后第6 周樣本記為QB 組；SCP 基線時(shí)樣本記為MA 組，基礎(chǔ)治療后第6 周樣本記為MB 組。將患者口腔分為6 個(gè)區(qū)段，采集每個(gè)區(qū)段內(nèi)PD 最深位點(diǎn)的齦下菌斑。去除齦上菌斑，Gracey 刮治器采集齦下菌斑，并將6 個(gè)位點(diǎn)的集合菌斑迅速置入1 個(gè)裝有750 μl 滅菌TE 緩沖液的1.5 ml EP 管，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂梦⒘繕悠坊蚪MDNA 提取試劑盒（天根公司，中國）提取齦下菌斑樣本中的基因組DNA，并用超微量紫外分光光度計(jì)測定DNA 純度和濃度。

1.4 樣本前處理及高通量測序

使 用 引 物515f 和806r 擴(kuò) 增16s rDNA 的V4 高變 區(qū)。第 一 輪PCR 反 應(yīng) 體 系：2 × High?Fidelity Master Mix 12.5 μL、PE1?515f（10 μM）0.25 μL、PE2?806r（10 μM）0.25 μL、Template DNA 3 μL、ddH2O 25 μL；循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；15 個(gè)循環(huán)（94 ℃，45 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃延伸5 min。第 二 輪PCR 反 應(yīng) 體 系：PE1.0?L（100 μM）0.15 μL、index primer（10 μM）1.5 μL；循環(huán)條件：98 ℃預(yù)變性1 min；15 個(gè)循環(huán)（98 ℃，10 s；56 ℃，20 s；72℃，20 s）；72 ℃延伸5 min 。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 電泳觀察20 min，切割目的條帶并純化，BioTek 酶標(biāo)儀定量，Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

利 用QIIME（quantitative insights in microbial ecology）、Mothur 以及SPSS（26.0 版本）等軟件對原始數(shù)據(jù)去雜得到優(yōu)化序列，根據(jù)97%相似度對優(yōu)化序列進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，選擇每個(gè)OTU 中豐度最高的序列作為OTU 的代表序列，將OTU 代表序列與物種分類數(shù)據(jù)庫作比對，注釋樣品中的物種信息，繪制相對豐度柱狀圖和熱圖；計(jì)算菌群豐度指數(shù)以及菌群多樣性指數(shù)（Shahnon、Simpson 指數(shù)），繪制稀釋曲線，通過t檢驗(yàn)、non?parametric factorial Kruskal?Wallis sum?rank 檢驗(yàn)及皮爾遜系數(shù)函數(shù)對群落進(jìn)行α 多樣性分析與β 多樣性分析，繪制主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）圖；進(jìn)行LEfSe差異分析（linear discriminant analysis effect size）、Network 網(wǎng)絡(luò)分析以及使用KEGG PATHWAY 數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）對群落功能進(jìn)行預(yù)測。檢驗(yàn)水平為雙側(cè)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 齦下菌斑菌群相對豐度

本次測序50 個(gè)樣本共獲得19 580 817 條原始序列，經(jīng)過濾最終獲得19 302 060 條高質(zhì)量序列，按97%相似度進(jìn)行聚類得到2 364 個(gè)OTU，與數(shù)據(jù)庫比對注釋到19 門，38 綱，64 目，112 科，209 屬，125 種。門、屬和種三個(gè)水平的優(yōu)勢菌在各組中的相對豐度見圖1。屬水平的相對豐度熱圖見圖2，其中卟啉單胞菌屬和密螺旋體屬等主要分布于GAgP 和SCP 基線樣本中，放線菌屬和羅氏菌屬等主要分布在GAgP 和SCP 治療后第6 周的樣本中。

2.2 α 多樣性分析

基線時(shí)GAgP 和SCP 的Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表1）；治療后第6 周，兩者的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均降低，其中SCP 的Shannon 指數(shù)降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。隨著測序深度增加，當(dāng)序列數(shù)超過50 000 時(shí)，說明此次測序量已經(jīng)足夠覆蓋所有菌種（圖3）。

2.3 β 多樣性分析

如圖4 所示，QA 組和MA 組距離近，說明基線時(shí)GAgP 和SCP 齦下菌群相似；QB 組和MB 組距離接近，但與QA 組和MA 組分開，說明治療后第6 周GAgP 和SCP 齦下菌群相似，但與基線不同。與QA組和MA 組內(nèi)各樣本間距離相比，QB 組和MB 組內(nèi)各樣本間距離稍分散，說明治療后第6 周齦下菌群變化因個(gè)體差異稍有不同。

Figure 2 Relative abundance heatmap in genus level in GAgP group and SCP group before and after treatment圖2 GAgP 組與SCP 組治療前后屬水平相對豐度熱圖

表1 GAgP 和SCP 基線時(shí)α 多樣性指數(shù)Table 1 The α diversity index of GAgP and SCP at baseline

表2 GAgP 和SCP 基礎(chǔ)治療前后α 多樣性指數(shù)Table 2 The α diversity index of GAgP and SCP before and after initial therapy

2.4 LEfSe 差異分析

LEfSe 分析用于尋找各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物，如圖5，在門、綱和目水平，放線菌在GAgP 治療后第6 周增加，且線性判別分析分值（LDA score）大于5，說明放線菌是GAgP 治療后顯著增加的細(xì)菌。

2.5 Network 網(wǎng)絡(luò)分析

網(wǎng)絡(luò)圖可以研究細(xì)菌與細(xì)菌之間的關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)中兩個(gè)圖標(biāo)距離越近，說明它們越相關(guān)。如圖6，本實(shí)驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)10 個(gè)緊密聯(lián)系的細(xì)菌關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，小桿菌屬、產(chǎn)線菌屬及密螺旋體屬等33 個(gè)菌屬構(gòu)成最大的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，二氧化碳噬纖維菌屬、鏈球菌屬及金氏菌屬等19 個(gè)菌屬構(gòu)成第二大關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，這兩大關(guān)系網(wǎng)絡(luò)均有鏈球菌屬參與。

2.6 群落功能預(yù)測

Figure 3 Rarefaction curve圖3 稀釋曲線

本次測序通過KEGG PATHWAY 數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）對群落功能進(jìn)行預(yù)測，未發(fā)現(xiàn)GAgP 和SCP 齦下菌群間存在顯著差異的群落功能，差異主要體現(xiàn)在GAgP 和SCP治療前后，GAgP 預(yù)測到62 種功能在治療后第6 周發(fā)生改變（P＜0.05），SCP 預(yù)測到38 種群落功能在治療后第6 周發(fā)生改變（P＜0.05）；其中與氨基酸代謝、甲烷代謝和肽酶等相關(guān)的功能降低（群落功能預(yù)測圖見本文OSID 碼）。

3 討 論

3.1 齦下菌群的組成和結(jié)構(gòu)分析

基線時(shí)，GAgP 和SCP 的優(yōu)勢菌在門、屬和種水平均無明顯差異。優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬與Han等［5］和Tsai 等［6］的研究一致，包括擬桿菌門、梭桿菌門和卟啉單胞菌屬等。優(yōu)勢菌種包括牙髓卟啉單胞菌、直腸彎曲菌和索氏密螺旋體等，未檢出牙齦卟啉單胞菌和齒垢密螺旋體等常見的代表菌種，此結(jié)果與Szafranski 等［7］的研究結(jié)果不完全相同，分析這一現(xiàn)象與測序選擇擴(kuò)增的16s rDNA 高變區(qū)不同有關(guān)。Szafranski 等［7］擴(kuò)增的是V1?V2 和V5?V6 高變區(qū)，結(jié)果可檢測到牙齦卟啉單胞菌和齒垢密螺旋體等常見的牙周致病菌，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的是V4 高變區(qū)，故檢出的是大量的牙髓卟啉單胞菌。該結(jié)果說明齦下菌群組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，除了常見的牙周致病菌外，還有許多其他細(xì)菌發(fā)揮著重要作用，而HTS 有助于發(fā)現(xiàn)更多的菌群。16s rDNA 高變區(qū)的選擇還與測序平臺(tái)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)使用的Illumina MiSeq 平臺(tái)測序成本相對較低，測序深度也較深［8］，V3～V4 區(qū)是該平臺(tái)經(jīng)常選擇的區(qū)域，故產(chǎn)生上述差異。治療后第6 周，GAgP 和SCP齦下菌群變化趨勢相似，擬桿菌門和卟啉單胞菌屬等相對豐度降低，放線菌門和鏈球菌屬等相對豐度增加，與之前的研究結(jié)果相同。

LEfSe 分析強(qiáng)調(diào)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和生物相關(guān)性，能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物［9］。Szafranski 等［7］通過LEfSe 分析發(fā)現(xiàn)牙周炎患者與牙周健康者的生物標(biāo)志物不同。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)GAgP 和SCP 間存在差異性生物標(biāo)志物，而在GAgP 患者治療后第6 周的齦下菌群中發(fā)現(xiàn)，放線菌在門、綱、目水平顯著增加。放線菌是牙周健康者富集的細(xì)菌［6］，本次結(jié)果提示可將其作為判斷GAgP 患者預(yù)后的潛在微生物標(biāo)志物。AgP 常與伴放線聚集桿菌（Actinobacillus actinomycetemcomi?tans，Aa）存在高度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)Aa，與Schulz 等［2］的結(jié)果一致，分析原因如下：①不同的地區(qū)人種會(huì)影響Aa的檢出率，非洲及中東等地區(qū)的AgP 患者中Aa檢出率較亞洲等地高［10］，Aa中毒性較高的JP2 基因型也多分布在非洲等地［11］，本實(shí)驗(yàn)的研究對象均為亞洲人，故未檢測到Aa；②Aa的定植常發(fā)生在青少年時(shí)期，且多導(dǎo)致典型的局限型侵襲性牙周炎［10］，本實(shí)驗(yàn)的研究對象是平均年齡（26.18 ± 4.40）歲的GAgP 患者，多處于晚期重度，也可能影響Aa的檢出。

3.2 群落多樣性分析

本實(shí)驗(yàn)中，GAgP 與SCP 基線時(shí)α 多樣性指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，基礎(chǔ)治療后第6 周，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)降低，說明基礎(chǔ)治療可以降低齦下菌群的多樣性，Campisciano 等［12］的研究也說明非手術(shù)治療后齦下菌群的α 多樣性降低。本實(shí)驗(yàn)β 多樣性分析顯示基線時(shí)GAgP 和SCP 齦下菌群的組成結(jié)構(gòu)相似，但治療后第6 周菌群變化存在個(gè)體差異，與Schwarzberg 等［13］的結(jié)果相似?；A(chǔ)治療后牙周袋變淺，此時(shí)的齦下菌群更易受口腔衛(wèi)生和飲食等個(gè)體因素的影響；Chen 等［14］通過評(píng)估口腔微生物群落遷移的生態(tài)過程發(fā)現(xiàn)，個(gè)體內(nèi)微生物群落的均質(zhì)化擴(kuò)散作用比個(gè)體間明顯，這一作用導(dǎo)致個(gè)體內(nèi)不同位點(diǎn)的菌群更加相似，而個(gè)體間的菌群存在差異。群落多樣性分析提示齦下菌斑控制的重要性，齦下菌斑生物膜是有序排列的建筑式樣結(jié)構(gòu)，多樣性高在一定程度上意味著齦下菌群間聯(lián)系緊密，豐富度越高，微生態(tài)系統(tǒng)更穩(wěn)定。因此充分去除生物膜有利于牙周健康，尤其對于牙周炎患者來說，預(yù)防齦上菌斑的堆積可以延緩齦下菌斑生物膜的重新定植［15］，這也是牙周維護(hù)治療的重要意義。

Figure 5 LEfSe analysis of the changes of subgingival microbiota in GAgP group before and after treatment圖5 GAgP 組治療前后菌群變化的LEfSe 差異分析

3.3 齦下菌群相關(guān)性分析

本實(shí)驗(yàn)通過Network 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)10 個(gè)相互聯(lián)系的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)，其中最大的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)包括小桿菌屬、產(chǎn)線菌屬及密螺旋體屬等33 種菌屬，它們大多是與牙周炎相關(guān)的菌屬，與Chen 等［14］的研究結(jié)果相同；第二大關(guān)系網(wǎng)絡(luò)包括二氧化碳噬纖維菌屬、鏈球菌屬及金氏菌屬等19 種菌屬，它們大多是與牙周健康相關(guān)的菌屬。在上述兩大關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中，鏈球菌屬均有參與，提示鏈球菌屬在齦下菌群由健康向失調(diào)轉(zhuǎn)變的過程中可能發(fā)揮著重要作用。

Figure 6 Network analysis of genus level correlation圖6 屬水平物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析

在健康人口腔中，鏈球菌是正常菌群，它與多種菌群密切聯(lián)系并維持口腔菌群的穩(wěn)定［16］。在菌斑生物膜形成的過程中，鏈球菌是早期定植者，它可以通過黏附素?受體作用機(jī)制直接黏附定植到獲得性薄膜上，為其他細(xì)菌提供新的結(jié)合位點(diǎn)［17］，從而介導(dǎo)其他口腔細(xì)菌的定植，最終形成復(fù)雜穩(wěn)定的生物膜群落。在細(xì)菌定植的過程中，齦下菌群經(jīng)歷了三個(gè)階段的演變：健康菌群階段、健康菌群和牙周炎相關(guān)菌群組成的多樣化菌群階段、以牙周致病菌為主的菌群階段，這一演變過程提示及時(shí)阻斷由早期定植者介導(dǎo)的菌群演變的重要性。然而口腔是一個(gè)有菌環(huán)境，鏈球菌作為口腔正常菌群的一員，在維護(hù)口腔健康方面發(fā)揮著重要作用，正確的治療理念是維持菌群平衡，因此對患者進(jìn)行口腔衛(wèi)生指導(dǎo)顯得尤為重要。每日進(jìn)行有效的菌斑控制，能夠在菌斑生物膜形成早期將其清除，避免菌群演變導(dǎo)致菌群失調(diào)而引發(fā)牙周炎，對牙周炎的預(yù)防和療效維護(hù)有重要意義。

除了上述最大的兩個(gè)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了分別以出芽菌屬、沙雷氏菌屬、微桿菌屬、Anaerococcus、Nicoletella、甲烷短桿菌、巴拿馬草屬及Dermacoccus為代表的8 個(gè)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，其中與牙周炎相關(guān)的致病菌聚集桿菌屬和巴氏桿菌屬、Ni?coletella及Bibersteinia相互聯(lián)系，但關(guān)于這些菌屬之間的具體關(guān)系以及它們與牙周炎的關(guān)系暫未有相關(guān)研究報(bào)道，有待進(jìn)一步的研究?；诰鷮匍g相關(guān)性的網(wǎng)絡(luò)分析可以在復(fù)雜的齦下菌群中盡可能發(fā)現(xiàn)更多相互聯(lián)系的菌屬，雖然不能明確具體的關(guān)系是協(xié)同或者拮抗，但能為今后驗(yàn)證細(xì)菌之間具體的相互作用提供方向。

3.4 群落功能預(yù)測

HTS 不僅能分析菌群的組成和結(jié)構(gòu)，還可以進(jìn)行群落功能預(yù)測，了解群落中細(xì)菌的代謝功能有助于理解菌群的致病機(jī)制［18］。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)基線時(shí)GAgP 和SCP 的齦下菌群間存在顯著差異的群落功能，但牙周基礎(chǔ)治療后第6 周，GAgP 的齦下菌群中預(yù)測到62 種功能發(fā)生改變，SCP 的齦下菌群中預(yù)測到38 種功能發(fā)生改變，其中與氨基酸代謝、甲烷代謝和肽酶等相關(guān)的功能降低，表明此時(shí)齦下菌群中的代謝活動(dòng)受到影響，這可能與牙周基礎(chǔ)治療后齦下菌群的豐富度和多樣性降低有關(guān)。牙周基礎(chǔ)治療可以擾亂齦下微生態(tài)系統(tǒng)，齦下菌群的新陳代謝活動(dòng)會(huì)受到干擾。Kirst 等［19］通過測序發(fā)現(xiàn)CP 患者的齦下菌群中與能量代謝、甲烷代謝和肽酶等相關(guān)的功能比牙周健康者更為豐富，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牙周基礎(chǔ)治療后上述功能降低，間接說明能量代謝、甲烷代謝和肽酶等細(xì)菌代謝功能與牙周炎有關(guān)。雖然具體作用機(jī)制不明確，但HTS可以同時(shí)對齦下菌群中的多種代謝功能進(jìn)行預(yù)測，在此基礎(chǔ)上篩選出關(guān)鍵功能，對今后的針對性研究具有一定的意義。

4 小 結(jié)

綜上所述，本研究通過HTS 分析了GAgP 和SCP 患者齦下菌群的組成、多樣性、菌群關(guān)系及群落功能等信息，并觀察了牙周基礎(chǔ)治療前后的菌群變化，結(jié)果顯示GAgP 和SCP 的齦下菌群相似，牙周基礎(chǔ)治療可以改變齦下菌群組成和結(jié)構(gòu)，降低群落多樣性，降低氨基酸代謝、甲烷代謝和肽酶等群落功能。鏈球菌屬在齦下菌群由健康向失調(diào)轉(zhuǎn)變的過程中可能發(fā)揮著重要作用。不足之處：本實(shí)驗(yàn)只觀察了牙周基礎(chǔ)治療后第6 周齦下菌群的變化，未進(jìn)行遠(yuǎn)期效果的觀察，今后應(yīng)延長追蹤時(shí)間，觀察遠(yuǎn)期效果；在進(jìn)行高通量測序時(shí)，本實(shí)驗(yàn)只選擇了16s rDNA 的一個(gè)高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，在細(xì)菌種水平上的鑒定不夠完善，在今后的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)在測序平臺(tái)讀長允許的條件下選擇多個(gè)高變區(qū)組合進(jìn)行測序。

【Author contributions】Yang WJ performed the experiments, ana?lyzed the data and wrote the article. Xu J designed the study. All au?thors read and approved the final manuscript as submitted.