胡廣偉，張珍珍，高煥

綜 述

文昌魚左右體軸建立機制的研究進展

胡廣偉1,2，張珍珍1,2，高煥1,2

1. 江蘇海洋大學，江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室/江蘇省海洋生物技術重點實驗室，連云港 222005 2. 江蘇海洋大學，江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，連云港 222005

兩側(cè)對稱動物左右體軸建立機制研究是發(fā)育生物學領域重要的基礎科學問題之一。文昌魚(amphioxus)由于其特殊的進化地位以及與脊椎動物相似的胚胎發(fā)育模式和身體構(gòu)筑方式，是研究動物左右體軸建立機制的理想模式物種。近年來隨著文昌魚室內(nèi)全人工繁育技術、高效顯微注射技術和基因敲除技術的建立，國內(nèi)外學者在左右體軸建立機制研究上取得了豐碩的成果。本文從文昌魚胚胎左右不對稱發(fā)育特點出發(fā)，總結(jié)了近期文昌魚左右體軸建立方面取得的研究進展，并提出了文昌魚左右體軸調(diào)控網(wǎng)絡圖：纖毛運動導致Hh蛋白在文昌魚中不對稱分布(L

文昌魚；左右體軸；胚胎發(fā)育

兩側(cè)對稱動物(Bilateria)體軸的正確建立是胚胎發(fā)育過程中的重要事件，是器官發(fā)生與形態(tài)建成的重要基礎[1]。體軸的建立主要包括前后軸(anterior- posterior axis)、背腹軸(dorsal-ventral axis)和左右軸(left-right axis)。左右體軸的建立一般始于胚胎發(fā)育早期，其過程主要包括胚胎原始對稱的打破、左右體軸建立相關基因的不對稱激活和不對稱器官的形態(tài)建成[2]。在成體中，兩側(cè)對稱動物外部形態(tài)呈兩側(cè)對稱，但這種對稱是相對的，其內(nèi)部器官的排布往往呈左右不對稱排列，從軟體動物貝殼的旋轉(zhuǎn)方向到脊椎動物內(nèi)臟器官的排布都有這種現(xiàn)象。內(nèi)臟器官的不對稱分布不僅能有效地利用軀體空間，而且對于各個器官功能的正常行使也至關重要[3]。

文昌魚(amphioxus)隸屬脊索動物門(Chordata)、頭索動物亞門(Cephalochordata)，是無脊椎動物向脊椎動物過渡的中間類群，同時也是脊索動物中現(xiàn)存最原始的類群[4]。由于文昌魚身體構(gòu)筑方式、基因組成以及胚胎發(fā)育模式均與脊椎動物相似，是進化發(fā)育與比較基因組學研究的理想模式物種[5,6]。此外，文昌魚在胚胎學研究上也具有其獨特優(yōu)勢。首先，文昌魚個體小，軀體結(jié)構(gòu)相對簡單，繁殖能力強，卵子體外受精、體外發(fā)育，胚胎和成體透明，從受精卵的第一次卵裂到神經(jīng)胚的發(fā)育過程都十分清晰[7]，非常利于胚胎發(fā)育早期的觀察和研究；其次，佛羅里達文昌魚()和白氏文昌魚()全基因組測序工作已經(jīng)完成[8,9]，相比脊椎動物，文昌魚的基因組沒有經(jīng)歷兩輪復制，因此與脊椎動物同源基因家族中的多數(shù)成員都是以單拷貝的形式存在，為通過基因編輯方法研究基因功能提供了極大的便利；最后，針對文昌魚研究的相關技術手段也日趨成熟，目前已經(jīng)實現(xiàn)了文昌魚室內(nèi)全人工繁育技術[10,11]、建立了高效的顯微注射技術[12]、實現(xiàn)了TALEN介導的基因敲除技術[13]、建立了文昌魚轉(zhuǎn)基因技術[14]等。得益于上述技術手段的突破，近年來人們在文昌魚左右體軸建立方面的研究也取得了很多新成果。本文從文昌魚胚胎左右不對稱發(fā)育特點出發(fā)，綜述了近期文昌魚左右體軸建立取得的研究進展。

1 文昌魚形態(tài)學上的左右不對稱

文昌魚形態(tài)學上的左右不對稱相比于其他脊索動物較為特殊，在文昌魚胚胎發(fā)育至神經(jīng)胚中期，體節(jié)(somite)首先呈現(xiàn)出左右不對稱排布(圖1E)，其中左側(cè)體節(jié)相比右側(cè)體節(jié)位置更靠前[15]，而且這種不對稱會一直持續(xù)到成體階段，最終導致肌節(jié)和外周神經(jīng)元也呈現(xiàn)與體節(jié)一致的左右不對稱排列特征[16]。文昌魚在整個胚胎發(fā)育過程中的左右不對稱在幼體階段最為明顯，尤其以咽區(qū)器官(pharyngeal organs)最為顯著(圖1)。在器官發(fā)生時，咽區(qū)左右兩側(cè)細胞會經(jīng)歷完全不同的命運走向，其中胚胎左側(cè)細胞會分化形成口和前窩(preoral pit)，口前窩與脊椎動物垂體前葉(anterior pituitary)同源，由左側(cè)體腔囊(coelomic pouch)發(fā)育而來，最終與口前端表皮融合[17]。胚胎右側(cè)咽壁會分化形成內(nèi)柱(endostyle)和棒狀腺(club-shaped gland)，內(nèi)柱與脊椎動物甲狀腺同源，位置與口相對。棒狀腺是一個管狀結(jié)構(gòu)橫跨著整個咽區(qū)，右側(cè)部分與咽壁相連是具有分泌功能的腺體部，位于內(nèi)柱的后方；左側(cè)部分是沒有分泌功能的管狀結(jié)構(gòu)開口于體外，位于口的下方，棒狀腺的具體功能以及其在脊椎動物中的同源器官目前尚不清楚[18]。隨著發(fā)育的進行，咽區(qū)器官的不對稱程度會隨著第一鰓裂的形成而進一步加劇。比較分析發(fā)現(xiàn)-，不同種類的文昌魚在胚胎發(fā)育過程中雖然會有細微的差異，但是幼體時期的左右不對稱特征是這類生物的普遍共性[19]。

圖1 文昌魚左右不對稱器官的分布情況

A：文昌魚三鰓裂時期幼體的側(cè)面觀；B~D：文昌魚咽區(qū)器官縱切片結(jié)果；E：文昌魚神經(jīng)胚期體節(jié)的排布情況。pp：口前窩；en：內(nèi)柱；csg：棒狀腺；m：口；fgs：第一鰓裂；箭頭表示體節(jié)間隔。

2 參與文昌魚左右體軸建立的信號通路

2.1 Nodal信號通路與文昌魚左右體軸建立

Nodal是TGF-β超家族成員之一，在絕大多數(shù)后口動物中均有發(fā)現(xiàn)[20]。研究表明，Nodal信號通路通過調(diào)控下游基因的不對稱表達參與左右體軸建立，在左右體軸建立調(diào)控網(wǎng)絡中處于核心位置[21]。在小鼠()中，基因在節(jié)點(node)兩側(cè)最初呈對稱表達，隨后由于Nodal抑制因子Cer在右側(cè)開始表達，使得Nodal的表達主要集中在節(jié)點左側(cè)。隨著發(fā)育的進行，節(jié)點處Nodal活性被傳遞到側(cè)板中胚層[22~24]，并在側(cè)板中胚層誘導其自身以及和基因的表達，由于Lefty擴散速度較快，且對Nodal具有抑制作用，從而將Nodal的活性限制在左側(cè)。通過這種自誘導反饋方式(self- enhancement and lateral inhibition, SELL)，、和在側(cè)板中胚層中的表達得到進一步強化，最終轉(zhuǎn)錄因子Pitx通過激活下游基因的表達參與細胞增殖、分化和不對稱器官的發(fā)育[25]。

在文昌魚胚胎中，Nodal信號通路的成員在胚胎孵化早期至神經(jīng)胚中期呈明顯的不對稱表達，具體體現(xiàn)為、、和主要在左側(cè)表達(L>R)，Nodal的抑制因子Cer主要在右側(cè)表達(L

2.2 BMP信號通路與文昌魚左右體軸建立

BMP (bone morphogenetic protein)是一類多功能的分泌蛋白，同屬于TGF-β超家族，在胚胎發(fā)育和器官形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要功能[32]。已有研究表明，BMP信號通路可與Nodal信號通路相互作用參與動物左右體軸的建立，如在小鼠中BMP信號活性受Nodal信號調(diào)控[33]，與此同時，BMP信號也可通過調(diào)控Nodal信號參與左右體軸建立，敲除導致小鼠節(jié)點及側(cè)板中胚層中Nodal表達下降，進而影響左右體軸的正常建立[34]。同樣在雞()和海膽()中，Nodal信號通路成員的不對稱表達也依賴于BMP信號活性[35~38]。最新研究顯示，在文昌魚中BMP信號通路通過調(diào)控Nodal信號通路參與左右不對稱發(fā)育，在原腸胚晚期到神經(jīng)胚期抑制BMP信號活性會使、、和在左側(cè)的表達消失，和呈現(xiàn)異位表達。表型分析發(fā)現(xiàn)，抑制BMP信號活性導致文昌魚左右體軸建立異常，原來位于左側(cè)的口和口前窩消失，取而代之的是原本僅出現(xiàn)在右側(cè)的內(nèi)柱和棒狀腺，胚胎左右兩側(cè)均為右側(cè)結(jié)構(gòu)(right isomerism)[39]，相關特征與抑制Nodal信號通路產(chǎn)生的結(jié)果相一致，說明BMP信號通路與Nodal信號通路在文昌魚左右體軸調(diào)控上具有一致性，同時也表明BMP信號通路在左右體軸建立方面功能的保守性。

2.3 Hedgehog信號通路與文昌魚左右體軸建立

()基因最早是由Nusslein-Volhard等[40]在果蠅()發(fā)育相關基因突變體篩選過程中發(fā)現(xiàn)的，由于該基因突變導致果蠅身體節(jié)段(segment)后部消失，使整個胚胎看起來像一個“刺猬”，因此將這一基因命名為。1993年Forbe等[41]首先提出Hh信號通路概念。隨后Hh信號通路核心成員在果蠅中相繼被發(fā)現(xiàn)，后來又在多種脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了Hh信號通路的同源基因，證實Hh信號通路在動物中普遍存在，廣泛參與細胞增殖、分化及多種組織器官的發(fā)生[42]。

英國雷丁大學Shimeld[43]最初將Hh信號通路與文昌魚左右體軸形成建立聯(lián)系，通過表達譜分析發(fā)現(xiàn)，基因在文昌魚神經(jīng)胚中期(5體節(jié))開始出現(xiàn)不對稱表達，這與文昌魚胚胎開始出現(xiàn)不對稱表型的時期一致，考慮到Hh信號通路在雞胚左右體軸建立中的功能[44]，Shimeld推測文昌魚中的不對稱表達極有可能與左右體軸建立相關。但是這一觀點并未得到大多數(shù)學者的認可，主要原因是在文昌魚中不對稱表達出現(xiàn)的時間是在神經(jīng)胚中期，遠遠晚于左右體軸調(diào)控基因開始不對稱表達的時期[28]。直到2014年，隨著基因敲除技術的興起，研究人員利用TALEN技術構(gòu)建了基因敲除突變體文昌魚，發(fā)現(xiàn)突變體文昌魚左右不對稱器官發(fā)育異常，證明Hh信號通路在文昌魚左右不對稱發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能[45]。在這一結(jié)果的基礎上，Hu等[46]通過組織切片、掃描電鏡系統(tǒng)地分析了基因敲除后的表型，發(fā)現(xiàn)基因敲除后文昌魚咽區(qū)器官及體節(jié)的不對稱性均受到影響，主要表現(xiàn)在右側(cè)器官消失，左右兩側(cè)均為左側(cè)特征，整個胚胎呈現(xiàn)左右對稱的表型；此外原位雜交結(jié)果也顯示，在突變體中表達消失，及其下游調(diào)控基因和表達由左側(cè)表達變?yōu)樽笥覍ΨQ表達，這些結(jié)果證明了Hh信號通路在文昌魚中通過調(diào)控參與左右不對稱建立。最新研究結(jié)果顯示，Hh信號活性在文昌魚中存在左右差異(L

3 左右組織者結(jié)構(gòu)與左右對稱的打破

在大多數(shù)脊椎動物中，胚胎原始對稱的打破與原腸背部一群短暫存在的特殊細胞團密切相關，這群細胞稱為左右組織者(LR organizer, LRO)，如小鼠中的節(jié)點(node)[48]、非洲爪蟾()中的原腸頂板(gastrocoel roof plate, GRP)[49]和斑馬魚()中的庫氏囊泡(Kupffer’s Vesicle, KV)[50]。盡管左右組織者結(jié)構(gòu)在不同物種中形態(tài)結(jié)構(gòu)差異較大但都具有如下特點：都存在動纖毛，能夠以固定的方式運動產(chǎn)生單向的液流[51,52]，液流導致LRO兩側(cè)產(chǎn)生差異，并誘導相關基因的左右不對稱表達，最終打破左右對稱[1]。

文昌魚胚胎發(fā)育模式及身體構(gòu)筑方式與脊椎動物高度相似，因此有學者認為文昌魚中也應存在類似于脊椎動物的LRO結(jié)構(gòu)[3,53]，并對文昌魚中左右組織者存在的部位和特點進行了推測：首先，位置上應該位于原腸腔的背壁，可在脊索形成時整合到脊索中；其次，應該存在極性細胞，具有動纖毛能夠定向擺動產(chǎn)生單向的液流，并且能夠激活相關信號通路；最后，LRO結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的時期應該與不對稱基因開始表達的時間相一致。根據(jù)這一推測，研究人員一直在試圖尋找文昌魚的“LRO”。但事實上，文昌魚胚胎在原腸胚時期絕大多數(shù)細胞都具有纖毛[54]，而且在文昌魚原腸胚期也沒有檢測到動纖毛標記基因的表達[55]，敲除纖毛形成相關基因也不影響文昌魚左右體軸的正常建立[47]。由此看來，有必要對文昌魚中是否存在LRO結(jié)構(gòu)這一問題進行重新討論。需要指出的是，最新的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖毛運動對文昌魚左右對稱的打破至關重要，纖毛運動會導致Hh信號的不對稱激活，進而通過調(diào)控的表達調(diào)控文昌魚左右不對稱發(fā)育，用甲基纖維素抑制纖毛運動會導致Hh蛋白分布異常、表達隨機化，最終導致左右體軸建立異常[47]。但是由于甲基纖維素只起到抑制纖毛運動的作用，不能確定動纖毛的著生位置，因此依然不確定在文昌魚中是否有LRO這一結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)語與展望

文昌魚是人們對頭索動物亞門動物的統(tǒng)稱，與尾索動物亞門和脊椎動物亞門共同組成脊索動物門，是脊索動物中最早分化出來的一支。與以海鞘為代表的尾索動物不同，文昌魚與脊椎動物具有更多相似的特征，是了解脊椎動物祖先的現(xiàn)生動物代表；此外，文昌魚是與步帶動物(mbulacrarians)親緣關系最近的脊索動物，因此揭示文昌魚左右體軸建立機制并將其與步帶動物體軸建立機制進行比較對于全面理解兩側(cè)對稱動物左右體軸建立機制以及背腹軸轉(zhuǎn)換(dorso-ventral inversion)都具有十分重要的意義。

在現(xiàn)存脊索動物中，文昌魚幼體時期形態(tài)學上的左右不對稱發(fā)育最為特殊，是研究左右體軸建立的絕佳材料。長期以來由于技術手段的限制，使得文昌魚的研究相比其他模式物種較為滯后，近年來隨著相關研究技術手段的建立，尤其是胚胎顯微注射技術以及基因敲除技術的應用，以文昌魚為實驗材料，在左右體軸發(fā)育機制方面的研究正在迅速展開。研究人員先后闡釋了Nodal信號通路、Cer- Nodal-Pitx-Lefty級聯(lián)信號通路、Hedgehog信號通路、BMP信號通路在文昌魚左右體軸建立中的功能，且證實纖毛運動為打破左右對稱的原始動力?？偨Y(jié)現(xiàn)有的文昌魚左右體軸調(diào)控相關研究，本文將文昌魚左右體軸建立的調(diào)控網(wǎng)絡總結(jié)如下(圖2)：在文昌魚中纖毛運動導致Hh蛋白的不對稱分布(L

盡管文昌魚左右體軸建立機制越來越清晰，但是文昌魚左右體軸建立和分化是一個復雜的動態(tài)過程，需要多條信號通路精確調(diào)控，目前仍有很多問題有待闡明，如信號通路如何決定動態(tài)表達進而參與左右體軸建立？在脊椎動物中參與左右體軸建立的Delta/Notch、Wnt/β-catenin和Wnt/PCP信號通路在文昌魚中是否參與左右體軸建立？此外，有研究發(fā)現(xiàn)用質(zhì)子泵(proton pumps)抑制劑處理會導致文昌魚胚胎左右體軸建立異常[53]，說明離子流(ion flux)參與文昌魚左右體軸建立，但是其具體功能還不清楚。最后，文昌魚中是否存在LRO結(jié)構(gòu)還有待進行深入研究。對于上述科學問題的回答將有助于人們?nèi)骊U釋文昌魚左右體軸建立的機制。

圖2 文昌魚左右體軸建立調(diào)控網(wǎng)絡圖

纖毛運動導致Hh蛋白在文昌魚中不對稱分布(L

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Progress on the left-right asymmetry patterning in amphioxus

Guangwei Hu1,2, Zhenzhen Zhang1,2, Huan Gao1,2

The mechanisms underlying the establishment of left-right (L-R) asymmetry in bilaterians is one of the central enigmas in developmental biology. Amphioxus is an important model in studying the mechanisms of animal asymmetry specification due to its particular phylogenetic position, vertebrate-like embryogenesis and body plan. Recently, with the establishments of artificial breeding technology, high-efficiency microinjection method and gene knockout technology, researchers have successfully dissected the mechanisms of amphioxus L-R asymmetry development. In this review, we summarize the major progress in understanding L-R asymmetry specification in amphioxus and propose a model of regulation of L-R asymmetry in this species. Hh protein is transported dominantly to the right side by cilia movement, leading to R>L Hh signaling andexpression. Cer inhibits expression of Nodal, leading to the asymmetric expression of Nodal-dependent genes. The L-R differences in the propagation of the Nodal pathway result in the correct morphological L-R asymmetry development in amphioxus embryo. BMP signaling probably does not provide the asymmetric cue, but is necessary for correct expression ofand.

amphioxus; L-R axis; embryonic development

2020-07-28;

2020-12-18

國家自然科學基金項目(編號：31900370)，江蘇省自然科學基金項目(編號：BK20191007)和江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程項目資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31900370), the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20191007), and the Priority Academic Program Development Fund of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD)]

胡廣偉，博士研究生，講師，研究方向：動物遺傳發(fā)育。E-mail: hgw0127@163.com

10.16288/j.yczz.20-246

2021/1/4 13:52:16

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201230.1713.002.html

(責任編委: 孫永華)