劉麗珍，甄莉娜，崔乃忠，白志強(qiáng)

(1.山西大同大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；2.山西大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所，山西 大同 037009)

大蒜是百合科蔥屬植物蒜的鱗莖部分[1]，作為食藥同源植物富含營養(yǎng)物質(zhì)和必需氨基酸，被人們廣泛使用[2]。紫皮大蒜為富硒農(nóng)產(chǎn)品，具有殺菌抗菌、抗癌抗突變、增加生物活性、減少心腦血管疾病、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力等功效，被譽(yù)為“天然抗生素”[3-5]。《本草綱目》中記載，大蒜可以祛風(fēng)濕、除風(fēng)邪、止衄血、通五臟、治泄瀉、止霍亂及散癰腫[6-7]。新鮮的大蒜不含生物活性物質(zhì)大蒜素，以不穩(wěn)定的蒜氨酸形式存在[8]。王希麗等[9]研究表明，白皮蒜有26種揮發(fā)性成分，而紫皮蒜有35種。大蒜被搗碎后，蒜氨酸經(jīng)蒜氨酸酶的催化生成了大蒜素[10]。侯志敏等[11]研究表明，紫皮大蒜的大蒜素含量高，抑菌作用明顯，而且對細(xì)菌病毒均有殺滅和抑制作用[12]。

目前，大蒜素的提取方法有水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑法、真空微波萃取法和超臨界萃取法。水蒸氣蒸餾法設(shè)備簡易、方便操作、穩(wěn)定性好、成本低，但高溫會(huì)使蒜酶失活，導(dǎo)致大蒜素的產(chǎn)率降低[13]；有機(jī)溶劑法提取設(shè)備簡易，操作方法簡便，大蒜素提取產(chǎn)率較高，廣泛用于食品藥品領(lǐng)域[14]；真空微波萃取法操作簡單，提取率高，但高溫易使大蒜素分解；超臨界萃取法安全可靠，提取大蒜素的產(chǎn)率非常高，不易破壞原產(chǎn)物，但成本高、不易操作，用于制備高附加值的食品。本試驗(yàn)以山西應(yīng)縣紫皮蒜為材料，采用有機(jī)溶劑法提取大蒜素，結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)選出最佳提取條件；之后將較常見的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種到含有大蒜素的培養(yǎng)基中，以探討大蒜素對兩種細(xì)菌的作用，為食品藥品和醫(yī)學(xué)方面的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

紫皮大蒜：應(yīng)縣產(chǎn)；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：由山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器

JA5003B型分析天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；A-88型組織搗碎機(jī)、GZX-250-D型光照培養(yǎng)箱、DK-8D型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇國旺實(shí)驗(yàn)儀器廠；HC-2062型臺式高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；9070MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大蒜的選取及提取工藝

選取大小均勻、瓣肉潔白、無病蟲害、無機(jī)械破損的紫皮大蒜。去皮后用無菌水清洗干凈，搗碎成泥狀，40 ℃酶解30 min，離心15 min，取上清液過濾、除菌、分裝于高壓滅菌后的離心管中備用。

1.3.1.1 料液比對大蒜素提取的影響

準(zhǔn)確稱取樣品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入95%的乙醇溶液，40 ℃水浴1 h，設(shè)置料液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，離心取上清液，每個(gè)樣品重復(fù)3次，觀察不同料液比下大蒜素的提取率。

1.3.1.2 乙醇濃度對大蒜素提取的影響

準(zhǔn)確稱取樣品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入不同濃度的乙醇溶液20 mL，40 ℃水浴1 h，設(shè)置乙醇濃度分別為45%、55%、65%、75%、85%、95%，離心取上清液，每個(gè)樣品重復(fù)3次，觀察不同乙醇濃度下大蒜素的提取率。

1.3.1.3 提取溫度對大蒜素提取的影響

準(zhǔn)確稱取樣品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入85%的乙醇溶液20 mL，水浴1 h，設(shè)置溫度分別為20，25，30，35，40，45 ℃，離心取上清液，每個(gè)樣品重復(fù)3次，觀察不同提取溫度下大蒜素的提取率。

1.3.1.4 提取時(shí)間對大蒜素提取的影響

準(zhǔn)確稱取樣品6份，每份5 g，40 ℃酶解30 min，加入85%的乙醇溶液20 mL，30 ℃分別水浴0.5，1，1.5，2，2.5，3 h后，離心取上清液，每個(gè)樣品做3次重復(fù)，觀察不同提取時(shí)間下大蒜素的提取率。

1.3.2 制備菌懸液

采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基接種大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，置于37 ℃培養(yǎng)箱24 h，分別置于0.9%的生理鹽水中制成菌懸液進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.3 測定抑菌能力

將打孔滅菌處理過的濾紙片置于大蒜提取液中,浸泡50 min。放入含有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的平板里，待菌液全部吸收入培養(yǎng)基內(nèi)，于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h觀察抑菌圈直徑，每種菌重復(fù)3次取平均值。

1.3.4 測定最小抑菌濃度(MIC)

用無菌蒸餾水2倍稀釋大蒜素原液，濃度為500，250，125，62.5，31.25，15.625 mg/mL 6個(gè)不同梯度，分別浸泡濾紙片到含有1.3.3菌的培養(yǎng)基中，每種重復(fù)3次。

1.4 正交試驗(yàn)

在料液比、乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間 4個(gè)單因素中，分別選取3個(gè)影響最大的因素為水平，做 L9(34)正交試驗(yàn)，重復(fù)3次，以考察大蒜素的最佳提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對大蒜素提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比的加大，大蒜素的提取率逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶4時(shí)，提取率為最大值，繼續(xù)添加乙醇量，大蒜素的提取率反而開始下降。因此在做正交試驗(yàn)時(shí)，選取料液比1∶3、1∶4、1∶5做3個(gè)水平。

圖1 料液比對大蒜素提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of allicin

2.1.2 乙醇濃度對大蒜素提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇濃度的升高，大蒜素的提取率不斷增加，并且在濃度為85%時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)濃度大于85%時(shí)，大蒜素的提取率開始下降?？赡苁且?yàn)闈舛容^低時(shí)，大蒜素未被乙醇完全萃取，而影響大蒜素向有機(jī)相轉(zhuǎn)移，溶劑體積分?jǐn)?shù)增大，有利于大蒜素的提取，達(dá)到飽和時(shí)，大蒜素不穩(wěn)定，開始分解。因此在做正交試驗(yàn)時(shí)，選取乙醇濃度75%、85%、95%做3個(gè)水平。

圖2 乙醇濃度對大蒜素提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of allicin

2.1.3 提取溫度對大蒜素提取率的影響

由圖3可知，大蒜素的提取率隨著提取溫度的升高而不斷增加，在溫度為35 ℃時(shí)，大蒜素的提取率最高；隨著溫度的繼續(xù)上升，大蒜素的提取率呈下降趨勢。可能是由于低溫時(shí)，蒜氨酸酶的活性較低，影響大蒜素向有機(jī)相的轉(zhuǎn)移；溫度繼續(xù)上升加快了分子的熱運(yùn)動(dòng)，酶的活性也達(dá)到最大，提取率最高；但過高的溫度會(huì)導(dǎo)致大蒜素不穩(wěn)定而分解，逐漸轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)，而使大蒜素的含量減少。即蒜氨酸酶的活性隨著溫度的升高而增強(qiáng)，達(dá)到一定程度時(shí)，活性趨于平穩(wěn)，之后溫度繼續(xù)升高，酶的活性反而下降直到失活狀態(tài)。因此在做正交試驗(yàn)時(shí)，選取提取溫度30，35，40 ℃做3個(gè)水平。

圖3 提取溫度對大蒜素提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of allicin

2.1.4 提取時(shí)間對大蒜素提取率的影響

由圖4可知，大蒜素的提取率隨著提取時(shí)間的延長不斷增加，時(shí)間為1.5 h時(shí)，大蒜素的提取率達(dá)到峰值，之后大蒜素的提取率不隨時(shí)間的延長而增加，反而下降。原因可能是開始時(shí)提取時(shí)間較短，蒜氨酸不能完全分解為大蒜素；但時(shí)間過長時(shí)，已生成的大蒜素或已揮發(fā)或已轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)。因此在做正交試驗(yàn)時(shí)，選取提取時(shí)間1，1.5，2 h做3個(gè)水平。

圖4 提取時(shí)間對大蒜素提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of allicin

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素，以大蒜素提取率為指標(biāo)，做4因素3水平正交試驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果見表1。

由表1～表3可知，提取大蒜素的最佳條件為A3B2C3D2，即料液比為1∶5，乙醇濃度為85%，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，大蒜素的提取率最大。由極差值R可知，有機(jī)溶劑提取法提取紫皮大蒜中大蒜素的影響順序?yàn)锳>B>D>C，即料液比的影響最大，乙醇濃度的影響次之，提取溫度的影響最小。4個(gè)因素對大蒜素的提取率影響不顯著。用優(yōu)化的組合重復(fù)3 次做驗(yàn)證試驗(yàn)，得出的提取率為0.43%。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of L9(34) orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 The analysis of variance

2.3 大蒜素的抑菌結(jié)果

大蒜素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果見表4和表5。

表4 大腸桿菌的抑菌圈直徑Table 4 The bacteriostatic zone diameter of of Escherichia coli

表5 金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑Table 5 The bacteriostatic zone diameter of Staphylococcus aureus

由表4和表5可知，紫皮大蒜中大蒜素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，且抑菌圈直徑隨著大蒜素濃度的增加而增大。這可能是由于大蒜素中的含硫活性基團(tuán)與細(xì)菌生長所必需的半胱氨酸中的巰基結(jié)合，競爭性地抑制了細(xì)菌生長繁殖[15]。Fujisawa H等[16]認(rèn)為，大蒜素的抗菌能力是其釋放的氧原子或烯丙基巰基與細(xì)菌中的巰基酶相互作用的結(jié)果。

2.4 最小抑菌濃度

由表6可知，大蒜素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度分別為62.5，31.25 mg/mL，且大蒜素對金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯強(qiáng)于大腸桿菌，這與姚芹等[17]、尚叢珊等[18]的研究結(jié)果一致，且抑菌效果隨濃度的增大而增加。

表6 大蒜素的最小抑菌濃度Table 6 The minimum inhibitory concentration of allicin

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果得出：當(dāng)乙醇濃度為85%，料液比為1∶5，提取溫度為40 ℃，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，大蒜素的提取率最大，為0.43%。大蒜素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，最低抑菌濃度分別為 62.5，31.25 mg/mL，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于大腸桿菌，該試驗(yàn)結(jié)果為大蒜素的進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)。