左勇，陳靜，張晶

(1.四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，成都 610101；2.宜賓學(xué)院質(zhì)量管理與檢驗(yàn)檢測(cè)學(xué)部，四川 宜賓 644000；3.重慶大學(xué) 生物工程學(xué)院，重慶 400044)

甜面醬又稱甜醬、面醬，是以小麥或面粉為主要原料，經(jīng)蒸煮、接種制曲、拌鹽水發(fā)酵后釀制而成的半固態(tài)調(diào)味品[1]，其口感獨(dú)特、色澤鮮美，常作醬腌菜等輔料之用。在甜面醬成熟過程中，淀粉質(zhì)類物質(zhì)被降解為還原糖賦予醬醪甜味；蛋白質(zhì)在蛋白酶水解作用下被分解為小分子肽、氨基酸等賦予甜面醬鮮味；微生物代謝所產(chǎn)生的大量有機(jī)酸與醇類等物質(zhì)通過酯化作用產(chǎn)酯賦予甜面醬柔和的酯香；發(fā)酵過程中的美拉德反應(yīng)賦予甜面醬鮮亮的色澤[2]。

近年來，甜面醬中揮發(fā)性風(fēng)味成分的相關(guān)研究屢有報(bào)道，孟鴛等[3]對(duì)比不同的萃取方式分析甜面醬中的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)頂空固相微萃取法對(duì)揮發(fā)性的酯類和烯烴類化合物的提取效果最佳；張靜等[4-7]對(duì)影響頂空固相微萃取提取甜面醬中揮發(fā)性成分的因素進(jìn)行相關(guān)研究；左勇等[8]對(duì)甜面醬保溫發(fā)酵過程中的揮發(fā)性成分的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，結(jié)合主成分分析，綜合評(píng)定保溫發(fā)酵7周的甜面醬風(fēng)味最佳；黃明泉等[9-12]發(fā)現(xiàn)甜面醬中氨基酸含量最高的是谷氨酸，呈現(xiàn)鮮味。

本研究采用主成分分析法，對(duì)保溫發(fā)酵不同時(shí)間后經(jīng)曬露成熟的甜面醬中的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，確定風(fēng)味最佳的樣品，再對(duì)甜面醬中游離氨基酸的呈味貢獻(xiàn)進(jìn)行分析，以確定呈味最佳的樣品。根據(jù)香味與呈味研究結(jié)果，推斷最佳保溫發(fā)酵時(shí)間，以期為兩段式發(fā)酵技術(shù)(先保溫發(fā)酵后曬露)提供風(fēng)味品質(zhì)評(píng)價(jià)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜面醬：分別保溫發(fā)酵20，25，30，35，40 d后，再經(jīng)曬露成熟的甜面醬樣品，分別編號(hào)為1～5。

萃取頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS；手動(dòng)進(jìn)樣器；頂空萃取裝置 美國(guó)Supelco公司；6890N-5979B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；ThermoFisher U3000液相色譜儀 上海力晶科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 揮發(fā)性風(fēng)味成分測(cè)定

采用頂空固相微萃取技術(shù)提取甜面醬香氣成分，再利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析揮發(fā)性成分組成及含量。

1.2.1.1 樣品處理

稱取4 g甜面醬樣品和1 g氯化鈉于盛有6 mL蒸餾水的15 mL頂空瓶中，60 ℃水浴平衡5 min，待萃取頭吸附60 min后將其移至氣相色譜的高溫汽化室中解吸5 min進(jìn)行GC-MS分析。萃取頭老化：萃取頭在GC進(jìn)樣口于270 ℃老化5～10 min，插入裝有平衡5 min的樣品頂空瓶中，于60 ℃水浴保溫60 min后進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.1.2 GC-MS條件

色譜條件[13]：柱型采用Agilent DB-Wax毛細(xì)管色譜柱(60 m×250 μm×0.25 μm)；手動(dòng)不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為250 ℃；程序升溫：初始溫度40 ℃，保留3 min，以2 ℃/min的速率升至60 ℃，再以6 ℃/min的速率升至250 ℃，保留5 min；檢測(cè)器溫度250 ℃；載氣為He，流速1 mL/min。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍10～450 amu，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃。

1.2.1.3 化合物定性方法[14]

由GC-MS得到譜圖, 參照標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)(NIST 05)確定揮發(fā)性風(fēng)味成分。僅當(dāng)匹配度純度>800的鑒定結(jié)果才予以報(bào)道。

1.2.1.4 化合物定量方法

采用峰面積歸一化法對(duì)甜面醬中的各揮發(fā)性組分進(jìn)行定量分析，求得各組分的相對(duì)含量。

1.2.2 游離氨基酸分析

采用高效液相色譜法測(cè)定保溫發(fā)酵后并經(jīng)曬露成熟的甜面醬樣品的游離氨基酸含量。

1.2.2.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1 g樣品于50 mL的容量瓶中，加0.01 mol/L的鹽酸40 mL，旋渦混勻5 min，超聲提取5 min，定容。避光靜置2 h，取5 mL 4000 r/min離心10 min，準(zhǔn)確取1 mL上清液，加入1 mL 2%～4%磺基水楊酸，渦旋1 min，避光靜置1 h，15000 r/min離心15 min，精密量取上清液500 μL于5 mL塑料離心管中，精密加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液250 μL，混勻，精密加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液250 μL，混勻，室溫放置1 h，加2 mL正己烷，劇烈振搖，放置10 min，取下層溶液用0.22 μm的水相膜濾過濾上機(jī)分析。

1.2.2.2 色譜條件

色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；波長(zhǎng)：254 nm；流動(dòng)相A：0.1 mol/L醋酸鈉溶液(取無水醋酸鈉8.2 g，加水900 mL溶解，用冰醋酸調(diào)pH至6.5，然后加水至1000 mL-乙腈(93∶7)。流動(dòng)相B：乙腈-水(8∶2)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析采用SPSS 19.0軟件[15]，采用Origin作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜面醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖

保溫發(fā)酵后經(jīng)曬露成熟的甜面醬樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的離子流圖譜見圖1。

圖1 甜面醬的揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in sweet soybean paste注：圖中1～5分別代表1～5號(hào)樣品。

離子流圖能夠反映揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成和豐度，見圖1。保溫發(fā)酵不同時(shí)間后經(jīng)曬露相同時(shí)間后成熟的甜面醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成差異不大。

2.2 甜面醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，從甜面醬中共檢測(cè)出33種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類3種，酯類14種，醛類9種，酚類1種，烷烴類3種，其他化合物3種。通過面積歸一化法求得各類化合物的相對(duì)百分含量，結(jié)果見表1。

表1 先保溫后曬露成熟的甜面醬中主要揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量Table 1 The relative content of main volatile components in sweet soybean paste produced by two-stage fermentation

由表1可知，甜面醬中揮發(fā)性成分的組成及含量受保溫發(fā)酵時(shí)間的影響。為選擇具有代表性的成分作為反映先保溫后曬露發(fā)酵法生產(chǎn)的甜面醬整體風(fēng)味的指標(biāo)，故對(duì)保溫發(fā)酵后經(jīng)曬露成熟的甜面醬的風(fēng)味物質(zhì)組成及相對(duì)含量進(jìn)行主成分分析，通過降維處理問題的思路，提取少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)實(shí)現(xiàn)對(duì)風(fēng)味的綜合評(píng)價(jià)。

計(jì)算各主成分的貢獻(xiàn)率與累積貢獻(xiàn)率，累積貢獻(xiàn)率不低于85%時(shí)，表明所選主成分能夠包含全部指標(biāo)的絕大部分信息。各成分的特征值以及貢獻(xiàn)率見表2。

表2 主成分的特征值以及貢獻(xiàn)率Table 2 The eigenvalues and contribution rates of principal components

由表2可知，前3個(gè)特征值的累積貢獻(xiàn)率為90.77%，說明前3個(gè)主成分基本包含了全部指標(biāo)所具有的信息。故選取前3個(gè)特征值，即將原來指標(biāo)轉(zhuǎn)化為4個(gè)新的指標(biāo)，起到了降維的作用，能夠比較客觀地反映兩階段曬露法所生產(chǎn)的甜面醬風(fēng)味物質(zhì)的組成情況。第1主成分可解釋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成總變異的43.66%，第2主成分能夠解釋34.08%，第3主成分可解釋13.04%。前3個(gè)特征值對(duì)應(yīng)的特征向量見表3。

表3 主成分特征向量表Table 3 The eigenvector values of principal components

續(xù) 表

由表3可知，棕櫚酸乙酯、苯乙酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十五酸乙酯、亞麻酸乙酯、乙酸苯乙酯、棕櫚酸異丁酯、十四烷與第1主成分呈正相關(guān)；異戊醇、糠醛、5-甲基呋喃醛、苯乙醛、2-苯基巴豆醛、2-乙?；量┡c第2主成分呈高度正相關(guān)；苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛、2,4-二叔丁基苯酚與第3主成分呈正相關(guān)。故可將棕櫚酸乙酯、苯乙酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十五酸乙酯、亞麻酸乙酯、乙酸苯乙酯、棕櫚酸異丁酯、異戊醇、苯乙醇、糠醛、5-甲基呋喃醛、苯甲醛、苯乙醛、2-苯基巴豆醛、2,4-二叔丁基苯酚、十四烷、2-乙酰基吡咯視為兩階段發(fā)酵法所生產(chǎn)的甜面醬中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

通過對(duì)各特征向量數(shù)據(jù)中心化和標(biāo)準(zhǔn)化后求得各主成分的得分，以每個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)重，計(jì)算出樣品質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)指數(shù)。綜合評(píng)價(jià)指數(shù)越大，綜合質(zhì)量越好[16]。通過SPSS計(jì)算出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)得分見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)化后主成分得分Table 4 The scores of principal components after standardization

由表4可知，4號(hào)樣品綜合得分最高，即保溫發(fā)酵35 d再經(jīng)曬露成熟的甜面醬中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)綜合評(píng)價(jià)最好。結(jié)合表1可知，4號(hào)樣品中測(cè)得的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有23種，其中酯類有11種、醇類2種、醛類7種、酚類1種、烷烴類1種、其他1種；其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成與含量均較高，與綜合評(píng)分結(jié)果一致。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量在一定程度上影響甜面醬的風(fēng)味品質(zhì)，甜面醬感官評(píng)價(jià)中香氣主要來源自揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。綜合而言，4號(hào)樣品的風(fēng)味最佳。

2.3 甜面醬中游離氨基酸組成分析

保溫發(fā)酵不同時(shí)間后經(jīng)曬露成熟的甜面醬樣品中游離氨基酸含量的測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 甜面醬游離氨基酸定量結(jié)果Table 5 The quantitative results of free amino acids in sweet soybean paste

由表5可知，保溫發(fā)酵不同時(shí)間后經(jīng)曬露成熟的甜面醬中，游離氨基酸含量為13.78～16.66 mg/g，4號(hào)樣品與5號(hào)樣品在總氨基酸含量上沒有顯著性差異(P>0.05)。4號(hào)樣品中游離氨基酸總含量最高，其次為5號(hào)樣品；游離氨基酸含量最低的為1號(hào)樣品，部分樣品中氨基酸含量存在顯著性差異，主要原因在于保溫發(fā)酵時(shí)間不同，使得前期大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化程度存在差異。先保溫發(fā)酵再經(jīng)曬露成熟的甜面醬，醬醪中游離氨基酸含量較高的氨基酸分別為谷氨酸、絲氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸，因面粉中蛋白質(zhì)主要為富含脯氨酸和谷氨酸的麥醇溶蛋白及麥谷蛋白，故這兩種游離氨基酸含量均高于其他氨基酸，這與黃明泉等的研究結(jié)果大致相同。

2.4 甜面醬中游離氨基酸呈味貢獻(xiàn)分析

氨基酸具有不同的風(fēng)味特征，可以作為食品中的呈味物質(zhì)。氨基酸呈味貢獻(xiàn)可采用味道強(qiáng)度值(taste active value，TAV)來評(píng)價(jià)，其值為呈味物含量與呈味閾值之比。TAV>1時(shí)，表明該物質(zhì)對(duì)觀測(cè)樣品具有呈味貢獻(xiàn)，且呈味貢獻(xiàn)大小與該值成正比；TAV<1時(shí)，表明該物質(zhì)呈味作用不顯著[17]。分別計(jì)算保溫發(fā)酵不同時(shí)間后經(jīng)曬露成熟的甜面醬中游離氨基酸的TAV，結(jié)果見表6。

表6 甜面醬中游離氨基酸呈味分析Table 6 The taste active value analysis of free amino acids in sweet soybean paste

由表6可知，各個(gè)樣品中TAV值大于1的氨基酸有谷氨酸、丙氨酸及纈氨酸，表明這3種氨基酸對(duì)甜面醬的呈味具有顯著貢獻(xiàn)，此外4號(hào)樣品中天冬氨酸的TAV值也大于1，故該樣品中天冬氨酸對(duì)呈味也具有貢獻(xiàn)。因谷氨酸的TAV值遠(yuǎn)大于其他氨基酸的TAV值，故其呈鮮味的作用強(qiáng)于其他氨基酸。甜面醬不具有明顯苦味，原因可能是呈味物質(zhì)之間的相互作用掩蓋或抑制了苦味的呈現(xiàn)，一些苦味氨基酸低閾值濃度存在時(shí)能增強(qiáng)其他氨基酸的呈味作用[19]。因此，甜面醬中游離氨基酸呈味作用主要考察與滋味密切相關(guān)且具有呈味貢獻(xiàn)作用的鮮味及甜味氨基酸。

TAV值反映氨基酸的呈味貢獻(xiàn)。由表5和表6可知，4號(hào)樣品中鮮味及甜味氨基酸含量均最大，分別約為2.35，3.04 mg/g。兩種鮮味氨基酸的TAV值都大于1，對(duì)甜面醬的鮮味具有顯著貢獻(xiàn)；同時(shí)，呈甜味的丙氨酸TAV值>1，對(duì)甜面醬的甜味有一定的呈味貢獻(xiàn)。

就呈味貢獻(xiàn)而言，4號(hào)樣品中呈鮮味、甜味的氨基酸含量是5號(hào)樣品的1.02倍。故4號(hào)樣品呈味作用優(yōu)于5號(hào)樣品，即保溫發(fā)酵35 d后經(jīng)曬露成熟的甜面醬游離氨基酸呈味作用最佳。

3 結(jié)論

從不同甜面醬樣品中共檢測(cè)出33種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。其中風(fēng)味組成最佳的為保溫發(fā)酵35 d經(jīng)曬露成熟的甜面醬，共計(jì)23種，其中酯類有11種、醇類2種、醛類7種、酚類1種、烷烴類1種、其他1種。同時(shí)，該樣品中游離氨基酸的總含量最高約為16.66 mg/g，其中天冬氨酸、谷氨酸及丙氨酸味道強(qiáng)度值大于1，對(duì)甜面醬滋味具有顯著呈味貢獻(xiàn)。