王金悅，葉青卓，李 婷，王 迪，張向榮*

（1.沈陽藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2.沈陽藥科大學(xué) 功能食品與葡萄酒學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

七葉皂苷鈉（sodium aescinate，SA）是從七葉樹科植物天師栗（Aesculus Wilsonii Rehd.）的干燥成熟果實(shí)娑羅子中提取到的皂苷鈉鹽，主要成分為七葉皂苷鈉 A、B、C、D。研究表明，SA具有消炎[1]、抗?jié)B出[2]、消腫[3]、抗氧化、清除自由基[4]、增加靜脈張力[5]和改善血液循環(huán)[6]等作用。臨床可用于治療腦水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)所致腫脹，也用于治療靜脈回流障礙性疾病，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前已經(jīng)上市的 SA 制劑有片劑、注射劑、針劑和凝膠劑，但都有各自的缺點(diǎn)。口服 SA 的生物利用度較低[7]，而由于 SA 屬于含多酯鍵的三萜皂苷類藥物，具有較強(qiáng)的刺激性，靜注可對血管產(chǎn)生刺激性，引起注射部位疼痛，長時(shí)間用藥可能引起靜脈炎，外用可能會(huì)引起皮膚或粘膜的局部疼痛和過敏反應(yīng)等[8-10]。作為一種具備多種生物活性和藥理作用的藥物，這極大地限制了它的臨床應(yīng)用和與其相關(guān)的新藥開發(fā)。

納米技術(shù)在藥物遞送領(lǐng)域的應(yīng)用在學(xué)術(shù)界和工業(yè)界呈現(xiàn)出不斷發(fā)展的趨勢，納米技術(shù)的發(fā)展也日趨成熟[11]。因此借助有效的制劑手段，可將 SA 制備成固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLNs），進(jìn)而提高口服 SA 的生物利用度，更好地實(shí)現(xiàn)其臨床應(yīng)用價(jià)值。固體脂質(zhì)納米粒的制備方法有很多，包括：沉淀法、研磨法、高壓均質(zhì)法和乳化法等。本研究采用熔融乳化超聲法，使用單硬脂酸甘油酯（glycerol monostearate，GMS）作為脂質(zhì)材料，蛋黃卵磷脂（egg yolk lecithin，EL）和泊洛沙姆 188（F68）為乳化劑，將 SA 制備成 W/O/W 型復(fù)乳液，再通過探頭超聲得到分散均勻的七葉皂苷鈉固體脂質(zhì)納米粒（SA-SLNs）。此方法設(shè)備簡單、容易操作，適用于學(xué)校及其他科研機(jī)構(gòu)的中小規(guī)模試驗(yàn)。

Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（Box-Behnken design，BBD）可通過建立可信的數(shù)學(xué)模型來表達(dá)響應(yīng)與因素之間的關(guān)系，篩選得到最優(yōu)的處方設(shè)計(jì)，目前已被廣泛應(yīng)用[12-14]。本研究采用 BBD 實(shí)驗(yàn)，以粒徑（particle size，gPS）和包封率（encapsulation efficiency，wEE）為評價(jià)指標(biāo)，考察處方中 GMS、EL 和 F68 用量對制劑的影響，預(yù)測最優(yōu)處方并驗(yàn)證，最后考察其體外釋放效果并進(jìn)行評價(jià)。

1 儀器與材料

CP114 分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司），YP2002 電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司），DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南予華儀器有限公司），XO-250 超聲波細(xì)胞破碎儀（南京先歐儀器制造有限公司），KQ3200E 超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），TG16G 高速離心機(jī)（天津廣豐科技有限公司），SC-04 低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），L-7000 高效液相色譜儀（日本日立公司），Nano-ZS90 Zetasizer 粒度測定儀（英國 Malvern公司），JEM-2100F 透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社），MD34 透析袋（截留分子量20 000，美國 VAKE 公司）。

七葉皂苷鈉 A（質(zhì)量分?jǐn)?shù) ≥ 98%，批號 ZJ0719BC13，上海源葉生物科技有限公司），SA原料藥（質(zhì)量分?jǐn)?shù) 98%，南京春秋生物工程有限公司），GMS（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），EL（批號 510300-2183999，德國 Lipoid GmbH 公司），F(xiàn)68（德國 BASF 公司），無水乙醇、甲醇、乙腈（色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司），水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），其余試劑（分析純，市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 SA-SLNs 的制備

采用熔融乳化超聲法制備 SA-SLNs。首先將 GMS、EL 溶于無水乙醇，于 75 °C 加熱至溶劑揮干且充分熔融，作為油相。將 SA 原料藥溶于 1 mL 蒸餾水中加熱至與油相等溫，形成內(nèi)水相。將內(nèi)水相注入油相，于 75 °C 超聲 5 min，制得 W/O 型初乳。另將 F68 溶于剩余 19 mL蒸餾水中，水浴至 75 °C，作為外水相。將外水相逐滴加入到 W/O 型初乳中，繼續(xù)乳化 15 min，得 W/O/W 型復(fù)合乳，將制得的復(fù)乳在冰浴條件下探頭超聲（250 W，95%）12 min（3s on，3s off），即得 SA-SLNs。

2.2 固體脂質(zhì)納米粒中 SA 的分析方法

2.2.1 色譜條件

色譜柱為 Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈∶磷酸（取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 85% 的磷酸 4 mL 用水稀釋至 1 000 mL）體積比為 40∶60；體積流量為 1.0 mL?min-1；檢測波長為 220 nm；進(jìn)樣量為 20μL；柱溫為室溫[15-16]。

Fig.1 The HPLC chromatograms of sodium aescinate A standard solution (A),sodium aescinate solution (B),SASLNs solution (C) and blank SLNs solution (D)圖1 七葉皂苷鈉A 標(biāo)準(zhǔn)溶液 (A)、SA-Sol (B)、SA-SLNs 溶液 (C)、空白 SLN s 溶液 (D) 的高效液相色譜圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取 SA 原料藥 300.0 mg 置于 50 mL 量瓶中，用適量甲醇超聲溶解并定容搖勻，即得質(zhì)量濃度為 6.0 g?L-1的儲(chǔ)備液。精密移取 0.25、0.5、1.0、2.0、3.0，4.0 和 5.0 mL 的儲(chǔ)備液，置于 10 mL 的量瓶中，用甲醇定容至刻度，混合得澄明無色溶液，在 220 nm 處檢測，進(jìn)樣 20μL進(jìn)行測定。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，得到擬合方程A=5.168 3 × 102ρ+6 .169 6 × 103，r=0.999 8，且 SA 質(zhì)量濃度在 150～3 000 mg?L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn)

配制質(zhì)量濃度分別為 150、1 200 和3 000 mg?L-1的低、中、高三種 SA 溶液，在同一日內(nèi)按照 2 h 的時(shí)間間隔，進(jìn)樣 20μL 進(jìn)行檢測，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測定 3 次，按所測峰面積積分值，求取日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算日內(nèi)精密度。同時(shí)，將該試驗(yàn)樣品在第 1～5 d 分別測定，計(jì)算日間精密度。由表1 可知，根據(jù)本方法所求得的日內(nèi)及日間精密度的 RSD 均小于 2%，證明該方法精密度良好，符合要求。

Table 1 Inter-day and intra-day precision assay of sodium aescinate by HPLC method表1 SA 液相分析方法的日內(nèi)和日間精密度

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

配置質(zhì)量濃度分別為 150、1 200 和 3 000 mg?L-1的低、中、高三種 SA 溶液各 6 份，取上述樣品過 0.45μm 的微孔濾膜，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件在同一日內(nèi)將 6 份續(xù)濾液依次連續(xù)進(jìn)樣10μL，測定其峰面積求取相對標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算得 RSD 為 1.09%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制質(zhì)量濃度為 1 200 mg?L-1的 SA 溶液，室溫下放置，分別在 0、2、4、6、8、12 h 后，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積以考察其穩(wěn)定性。經(jīng)計(jì)算求得峰面積的 RSD 值為 0.81%，可見樣品溶液在 12 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.6 檢測限和定量限的確定

精密吸取 SA 儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋配制成不同濃度的溶液，進(jìn)行 HPLC 檢測，測得其檢出限（S/N=3）濃度為 30 mg?L-1，定量限（S/N=10）質(zhì)量濃度為 100 mg?L-1。

2.3 粒徑的測定

納米制劑為熱力學(xué)不穩(wěn)定的體系，粒徑和粒度分布可以從一定程度上反映一個(gè)體系的物理穩(wěn)定性。研究表明，粒徑較小且粒度分布均勻的制劑質(zhì)量更好，更容易跨膜吸收，發(fā)揮療效。利用馬爾文粒度儀基于動(dòng)態(tài)光散射對 SA-SLNs 的粒徑進(jìn)行測定，測定方法是將待測樣品用注射用水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，放入樣品池內(nèi)并調(diào)節(jié)光強(qiáng)，測定溫度樣品池內(nèi)不得有氣泡，測定三個(gè)循環(huán)，最后取平均值。

2.4 包封率的測定

包封率是評價(jià)納米制劑的重要指標(biāo)之一，包封率指被包載藥物在納米制劑混懸液中占藥物總量的百分量，包封率越高越好。本研究采用超濾膜過濾法測定 SA-SLNs 的包封率。具體方法如下：

總藥物含量的測定：精密移取 SA-SLNs 液體 2 mL 置于 10 mL 量瓶，加入甲醇超聲破乳，20 min 后，甲醇定容搖勻，取適量樣品于 10 000 rpm 下離心 10 min，取上清液，經(jīng) 0.22μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液按“2.2.1 色譜條件”進(jìn)行測定，并計(jì)算藥物含量。

游離藥物濃度的測定：移取適量 SA-SLNs 液體于超濾管中，在 4 000 rpm 下離心 10 min收集超濾液，精密移取 2 mL 超濾液至 10 mL 量瓶，甲醇稀釋定容后，經(jīng) 0.22μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液按第一章節(jié)“2.1.2 色譜條件”進(jìn)行測定并計(jì)算含量。

包封率計(jì)算公式：

式中：mtotal為總藥物含量；mfree為游離藥物含量。

2.5 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于 SA-SLNs 的優(yōu)化，將三種主要材料 GMS、EL 和 F68 的用量作為考察因素，各因素的高、中、低水平分別用 1、0、-1 表示，粒徑和包封率作為響應(yīng)值，建立優(yōu)化處方的數(shù)學(xué)模型。其中 GMS、EL、F68 分別用A、B、C表示（見表2），按表3 的處方設(shè)計(jì)來制備固體脂質(zhì)納米粒，測定每組的粒徑和包封率，并記錄。

Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design表2 BBD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平

Table 3 Results of Box-Behnken design test表3 BBD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.5.2 試驗(yàn)分析

采用 Design-Expert 8.0.7 軟件分別對粒徑和包封率進(jìn)行二次多元回歸分析，分析結(jié)果見表4。

Table 4 Results of Box-Behnken design test analysis表4 BBD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析結(jié)果

2.5.2.1 粒徑分析

粒徑是影響固體脂質(zhì)納米粒性質(zhì)的關(guān)鍵因素，粒徑小且粒徑分布窄的固體脂質(zhì)納米粒較好。因此，首先對粒徑進(jìn)行分析，擬合方程如下：gPS=134.38+46.63A-32.30B-6.88C-38.35AB+12.26AC+1.65BC+26.68A2-1.61B2+11.18C2。結(jié)果表明，二次模型顯著（表4），A、B、AB、A2的P值均小于 0.05，說明它們對固體脂質(zhì)納米粒的粒徑有顯著影響。總體而言，經(jīng)F值檢驗(yàn)顯示總模型方程顯著（P< 0.05，r2=0.939 0），回歸方程的代表性較好，能預(yù)測實(shí)際情況。其中 GMS（A）對粒徑的影響最顯著，EL（B）次之。

2.5.2.2 包封率分析

粒徑分析后，再對包封率進(jìn)行分析，得到擬合方程：wEE=73.74+1.83A+1.94B-2.54C+1.10AB-0.087AC+4.26BC-2.01A2+2.25B2+2.77C2。C和BC的P值均小于 0.05，這表明它們對固體脂質(zhì)納米粒的包封率具有顯著影響（表4）。F值檢驗(yàn)顯示總模型方程顯著（P< 0.05，r2=0.827 1）。F68（C）對包封率的影響最大，其次是 EL（B）。

2.5.3 試驗(yàn)預(yù)測與驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)曲面試驗(yàn)原理，三維交互作用曲面圖彎曲度越大，表明兩因素之間的差異越顯著。利用 Design Expert 8.0.7 軟件對 SA-SLNs 的最佳處方用量進(jìn)行了分析和預(yù)測。分析結(jié)果是，制備 20 mL 的 SA-SLNs 需要 204 mg GMS、500 mg EL 和 600 mg F68，而預(yù)測得到的固體脂質(zhì)納米粒粒徑為 107.3 nm，包封率為 82.54%。最后，制備三批樣品進(jìn)行驗(yàn)證（表5）。

Table 5 The verification test results of Box-Behnken design表5 BBD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)驗(yàn)證結(jié)果

制備得到的固體脂質(zhì)納米粒平均粒徑為（109.8 ± 0.14）nm，包封率為 84.06%。結(jié)果表明，實(shí)際值與預(yù)測值的粒徑和包封率的偏差均小于 5%，因此該處方適用于制備 SA-SLNs。

2.6 Zeta 電位分析

同樣利用馬爾文粒度儀對 SA-SLNs 的 Zeta 電位進(jìn)行測定，將待測樣品用注射用水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測定三個(gè)循環(huán)，最后取平均值。平均 Zeta 電位為（-31.5 ± 0.02）mV，電位絕對值較大，膠體系統(tǒng)較穩(wěn)定。結(jié)果見圖2。

Fig.2 Zeta potential distribution of SA-SLNs圖2 SA-SLNs 的 Zeta 電位分布圖

2.7 透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）分析

將制備得到的固體脂質(zhì)納米粒經(jīng)磷鎢酸負(fù)染色法處理后，采用透射電子顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)。固體脂質(zhì)納米粒用超純水稀釋 50 倍，取適量滴在銅網(wǎng)上，放置幾分鐘。然后加入染色液，染色 1～2 min，濾紙吸干后用透射電鏡觀察，結(jié)果如圖3 所示。粒子呈球形，粒度分布均勻，粒徑在 100 nm左右，與馬爾文粒徑測定結(jié)果相吻合。

Fig.3 TEM image of SA-SLNs圖3 SA-SLNs 的透射電鏡圖

2.8 體外釋放研究

按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版），采用透析袋法評價(jià) SA-SLNs 的體外釋放研究，由于 SA 在中性及堿性條件下溶解度較好[17]，所以選擇 pH 值 7.4 的磷酸鹽緩沖液為釋放介質(zhì)。試驗(yàn)中取 5 mL 的 SA-SLNs 混懸液（相當(dāng)于 SA 質(zhì)量濃度為 15 g?L-1）置透析袋中，扎緊兩端，置燒杯中，釋放介質(zhì)為 pH 值 7.4 的磷酸鹽緩沖液，釋放體積為 50 mL，轉(zhuǎn)速為 100 rpm，于恒溫磁力攪拌器中加熱并維持在（37 ± 0.5）°C 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)取樣 1.0 mL，同時(shí)補(bǔ)充等體積同溫的新鮮釋放介質(zhì)，根據(jù)“2.2.1 色譜條件”進(jìn)行測定，并計(jì)算各時(shí)間點(diǎn) SA 的釋放量。同時(shí)準(zhǔn)確稱量 75 mg SA，溶解于 5 mL 蒸餾水中，配制成質(zhì)量濃度為 15 g?L-1的 SA 水溶液，以上述方法考察 SA 水溶液在 pH 值 7.4 釋放介質(zhì)中的釋放情況。所有試驗(yàn)均平行操作三次。以累積釋放百分率為縱坐標(biāo)，取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制釋放曲線，并將釋放結(jié)果擬合成動(dòng)力學(xué)模型，進(jìn)一步分析。

Fig.4 In vitro release profiles of SA from SA-Sol and SA-SLNs圖4 SA 水溶液和 SA-SLNs 的體外釋放曲線圖

體外釋放結(jié)果表明，8 h 后 SA 水溶液的累積釋放量可達(dá) 95.00% 以上，而 SA-SLNs 在 8 h時(shí)累積釋放量為 78.00%，表明 SA 水溶液和 SA-SLNs 的釋放曲線存在顯著差異（圖4）。SASLNs 繼續(xù)釋放，12 h 時(shí)累積釋放量為 86.74%，24 h 后的累積釋放量僅為 88.16%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與12 h 相比，24 h 后的釋放量沒有明顯增加，由此可知 12 h 后藥物釋放呈緩慢趨勢。2015 版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定一個(gè)緩釋制劑的釋放度為 1 h：10%～30%；4 h：40%～60%；8 h：85%以上。所以制備的 SA-SLNs 釋藥速率緩慢，且釋藥效果較好。

SA-SLNs 的釋放曲線被擬合到不同的動(dòng)力學(xué)模型中，結(jié)果可知采用 Higuchi 模型[18]擬合較好，相關(guān)系數(shù)最高（r=0.944 6）（表6），表明 SA 在模擬腸道釋放介質(zhì)中 24 h 內(nèi)的累積釋放行為符合 Higuchi 動(dòng)力學(xué)方程，模型藥物 SA 以擴(kuò)散驅(qū)動(dòng)的方式從納米粒中釋放出來[19-20]。

Table 6 The simulated model for the release profiles of SA-SLNs表6 SA-SLNs 釋放曲線的模型擬合

3 結(jié)論與討論

a.根據(jù) SA 的理化性質(zhì)，作者采用熔融乳化超聲法制備了 SA-SLNs，工藝簡單、操作條件易得。以粒徑和包封率作為評價(jià)指標(biāo)，通過 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化處方，對制備 SA-SLNs的影響因素：GMS 的用量、EL 的用量和 F68 的用量進(jìn)行了篩選，并通過驗(yàn)證試驗(yàn)得到粒徑較小且包封率較高的固體脂質(zhì)納米粒。通過本實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法成功優(yōu)化了SA-SLNs 的處方，且將 SA 包裹在 W/O/W 型復(fù)乳液的內(nèi)水相中，提高了固體脂質(zhì)納米粒的包封率，減少了藥物的損失。

b.Zeta 電位分析測定 SA-SLNs 的電位值為（-31.5 ± 0.019）mV。一般認(rèn)為，當(dāng)電位值的絕對值大于 30 mV 時(shí)，靜電斥力使納米粒子的存在相對穩(wěn)定，不會(huì)出現(xiàn)粒子聚集且大顆粒沉淀的現(xiàn)象[21]。因此，從電位分析來看，SA-SLNs 穩(wěn)定性較好。

c.制備得到的 SA-SLNs，使用 pH 計(jì)測定其 pH 值為 6.87。作為口服制劑，其 pH 值滿足4～9 的生理耐受范圍，符合要求。同時(shí)也為體外釋放研究提供了參考。選擇與制劑 pH 值相近的緩沖液作為體外釋放介質(zhì)，即 pH 值 7.4 的磷酸鹽緩沖液，來模擬體液研究 SA 的釋藥情況。研究結(jié)果表明，將 SA 包裹在復(fù)乳液型的固體脂質(zhì)納米粒中，釋藥行為符合 Higuchi 動(dòng)力學(xué)方程，釋藥速率合適，且效果較好。而關(guān)于藥物療效需進(jìn)一步通過體內(nèi)試驗(yàn)來考察。

d.作者成功制備了 SA-SLNs，處方簡單、設(shè)計(jì)新穎、包封率較高。在后續(xù)研究中，將根據(jù)《中藥、天然藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，通過影響因素試驗(yàn)、加速試驗(yàn)等試驗(yàn)進(jìn)一步考察SA-SLNs 的穩(wěn)定性，并進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)的藥效學(xué)研究，為 SA-SLNs 的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。