王愛芹，褚延樂，趙明軍，馮硯國，張瑞嶺*

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院 第二附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453002；2.鄭州大學第二附屬醫(yī)院 藥學部，鄭州450014

抑郁癥是一種臨床常見的以心境低落，并伴隨認知功能障礙、快感缺乏、精神運動延遲等為主要臨床特征的心理疾病，嚴重者會出現(xiàn)絕望、幻覺等癥狀和自殺傾向［1］。有研究［2］指出，Toll樣受體4（TLR4）作為重要的天然免疫系統(tǒng)信號通路，參與了抑郁癥腦損傷的病理生理變化。舍曲林是臨床廣泛應用于抗抑郁治療的一種5 羥色胺（5-HT）再攝取抑制劑（SSRIs），治療抑郁癥效果明確，但其具體的作用機制尚不明確。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：54 只健康成年雄性SD 清潔級大鼠，2～3月齡，體重200～250 g，均由我院醫(yī)學科研實驗動物中心提供（合格證號：201900700032）。實驗前先對大鼠進行曠場實驗，通過行為實驗對大鼠進行篩選分組，記錄5 min 內(nèi)的水平運動和垂直運動評分，納入得分接近的大鼠，排除其余大鼠。所有入選的實驗大鼠均在室溫25～28 ℃、相對濕度45%～55%的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)7 d，標準飲食，自由飲水，12／12 h 明／暗光照。所有實驗動物的處理均符合動物倫理委員會的動物倫理學要求。

1.2 藥物及試劑

鹽酸舍曲林片（輝瑞制藥有限公司，國藥準字H10980141，50 mg）。兔 抗 鼠Bcl-2、Bax、TLR4、MyD88 多克隆抗體（美國Santa 公司），兔抗鼠Caspase3、Caspase9 多克隆抗體（美國Abcam 公司）。HRP 標記的羊抗兔IgG 二抗（武漢博士德公司），RNA 提取試劑盒、PCR 試劑盒（寶生物工程有限公司），RIPA 組織細胞快速裂解液（上海基爾頓生物科技有限公司），BCA 總蛋白定量試劑盒（德國Thermo Scientific 公司），ECL 高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒（北京康為試劑生物科技有限公司），TRIZOL Reagent（Invitrogen）、M-MLV cDNA 合成試劑盒（賽蘭博生物有限公司）等。

1.3 儀器

HTT700T 透射電子顯微鏡（日本日立公司），CLIPSE 50i 型顯微鏡及攝像系統(tǒng)（日本Nikon 公司），MRl812 型臺式高速低溫離心機（法國JOUAN公司），全自動凝膠成像系統(tǒng)（Eppendorf 公司），MK3型酶標儀（芬蘭雷勃酶標儀公司），UV-2550 型紫外分光廣度儀（13 本島津公司），DYY-IIl27B 垂直電泳槽及穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠），5810R 型臺式高速冷凍離心機（Eppendorf），PCR System 擴增儀2700（Applied Biosystems 公司），熒光定量PCR儀ABI 7300（ABI 公司）等。

1.4 方法

1.4.1 實驗大鼠分組及模型制備

54 只大鼠進行曠場實驗（OFT）后應用隨機數(shù)字表法隨機分為對照組、模型組和舍曲林組，各18只。對照組不給予任何處理，模型組和舍曲林組應用21 d 慢性不可預見性溫和刺激（CUMS）法建立抑郁癥大鼠模型，具體方法為：21 d 內(nèi)給予大鼠禁水24 h、禁食24 h、12 ℃冷水浴5 min、制動3 h、45 ℃環(huán)境5 min、30 V 電壓電擊足底（每次10 s，間隙1 min，共計20 次）、懸吊5 min、100 dB 電鈴聲5 min、大卵圓鉗夾尾近體側(cè)1／3 處1 min 等9 種不同刺激，1 種／d，使用2 次，隨機安排，注意不連續(xù)使用同種刺激。通過比較造模第21 天與基線OFT、糖水偏好實驗（SPT）和體質(zhì)量監(jiān)測結(jié)果驗證模型是否建造成功，若大鼠出現(xiàn)持續(xù)的快感消失、精神運動性抑制、情緒減退等常見的人類抑郁癥患者行為特征，說明建抑郁癥模型造模成功。本研究中以大鼠自發(fā)活動距離低于基線2 s、糖水偏好度降低超過2 s 且體質(zhì)量偏低超過2 s 3 個標準同時滿足則表示建模成功。舍曲林組大鼠從建模開始第2 天起每日8 時至9 時給予鹽酸舍曲林片腹腔注射，將人與大鼠按照體表面積換算后按照10 mg／kg 劑量給藥，連續(xù)注射3 周。對照組和模型組大鼠給予同等體積生理鹽水腹腔注射，連續(xù)注射3 周。

1.4.2 行為學評價

1）曠場實驗（OFT）。自制100 cm×100 cm×42 cm 大小敞口木箱，內(nèi)壁全部涂黑，將底部劃分為等面積25 格。將大鼠置于敞箱的中間格位置，觀察記錄大鼠5 min 內(nèi)的水平運動穿越格子數(shù)，記錄水平運動得分（1 格記1 分，大鼠至少3 爪進入方格才記分），同時記錄大鼠的直立次數(shù)，記垂直運動得分（大鼠兩前爪騰空或攀附箱壁至雙足放下記1 次，記1 分）。水平運動評分可反映大鼠活動度和興奮性，垂直運動評分可反映大鼠對陌生環(huán)境的探究能力和好奇心。

2）糖水偏好實驗（SPT）。實驗前先將1 瓶純水和1 瓶含1%蔗糖水放在籠中，12 h 后將兩瓶水位置調(diào)換，大鼠自由飲用24 h。不禁食但禁水24 h 后在每個籠中放置150 mL 純水和150 mL 1%蔗糖水，2 h 后調(diào)換兩瓶水，記錄4 h 內(nèi)大鼠純水和蔗糖水攝入量，計算糖水偏好度（糖水消耗量與總液體消耗量比率）。

3）鼠懸尾實驗（TST）。在大鼠尾端2 cm 處系懸掛裝置繩，將大鼠吊起懸空（距離地面約50 cm），用膠帶固定好，避免實驗過程中因掙扎而脫落。記錄大鼠適應1 min 后5 min 內(nèi)懸掛狀態(tài)下的不動時間。該實驗目的在于檢測在可變性行為狀態(tài)下時大鼠的絕望程度。

4）強迫游泳實驗（FST）。將大鼠置于高20 cm，邊長15 cm，裝有溫水的玻璃器皿中，視頻記錄大鼠6 min 內(nèi)的行為變化情況，適應2 min 后記錄大鼠4 min 內(nèi)身體懸浮的不動時間。

1.4.3 Nissl 染色

各組分別取9 只大鼠在建模前和建模后行為學指標檢測后進行取材和染色。大鼠腹腔注射40 mg／kg 劑量的質(zhì)量分數(shù)10%水合氯醛麻醉。開胸，心臟暴露，經(jīng)左心室主動脈插管，生理鹽水100 mL 進行快速灌注沖洗，之后滴注500 mL 質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛，先快后慢，時間約1 h。開顱取腦組織浸泡固定在質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛中，時間4～6 h，之后4 ℃下梯度蔗糖滲透沉底，切片，厚度約25 μm，取背側(cè)海馬最大部位10 張連續(xù)腦片，PBS 接片。在涂明膠的載玻片上貼上奶片，晾干后置于氯仿中，5 min 后將其置于體積分數(shù)100%丙酮中保留15 min。對載玻片采用梯度乙醇脫水，在焦油紫染液中染色20 min，蒸餾水洗滌，梯度乙醇處理，之后置于體積分數(shù)100%氯仿中5 min，應用分化劑處理2～3 min。在梯度乙醇中脫水，之后置于二甲苯中1 min，撥片封閉、晾干后在顯微鏡下觀察大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)學變化，并拍照記錄。

1.4.4 Western blot 檢測大鼠海馬細胞凋亡信號通路相關(guān)蛋白含量

取海馬組織加入RIPA 裂解液，用勻漿器在冰上研磨，4 ℃下12 000 r／min 離心15 min，離心半徑10 cm，分離血清。用Bradford 法測定蛋白濃度，定蛋白濃度為2 μg／μL，95 ℃下水浴5 min。取蛋白樣品15 μg，每孔上樣20 μL，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離、轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白封閉60 min。分別加入特異性 一 抗（Bcl-2、Bax、TLR4、MyD88、Caspase3、Caspase9），4 ℃下孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入相應的二抗，室溫下孵育60 min，洗膜3次，每次5 min。加入ECL 發(fā)光液曝光顯影。用Image J進行圖像分析，蛋白水平用目的蛋白與內(nèi)參β-actin 灰度比值表示。

1.4.5 qRT-PCR 法檢測大鼠海馬細胞凋亡信號通路相關(guān)蛋白mRNA 表達水平

取各組大鼠海馬組織100 mg，用Trizol 法進行總RNA 提取。瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA 完整性，紫外分光光度計測定RNA 濃度，A280／A260 比值在1.8～2.0 范圍內(nèi)為合格。取5 μgRNA 為模板，按照M-MLV cDNA 合成試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應42 ℃5 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應95 ℃2 min，4 ℃終止反應。引物來自上海生工工程有限公司。PCR反應體積為：10 μL SYBR Green，7 μL DECP水，0.5 μL PrimerF，0.5 μL Primer R，2 μL模板，共計20 μL。每樣本做3 個復孔，PCR 反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃60 s，58 ℃25 s，72 ℃30 s，循環(huán)次數(shù)45 s，各基因表達水平應用相對定量2-ΔΔCt表示。

1.5 統(tǒng)計學分析

本研究數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計學分析和處理均應用SPSS 23.0 軟件包進行。用表示計量資料，比較應用單因素方差分析t檢驗。P＜0.05表示差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學指標評價結(jié)果比較

對照組、模型組和舍曲林組建模前大鼠SPT 偏好度、OFT 水平得分和垂直得分、TST 時間、FST 時間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。建模后模型組SPT 偏好度顯著降低，OBT 水平運動得分和垂直運動得分均顯著減小，TST 和FST 時間均顯著延長，與建模前比較差異均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組上述行為學變化指標與建模前比較均無明顯變化（P＞0.05）；建模后舍曲林組SPT 偏好度、OBT 水平運動得分和垂直運動得分及TST 和FST 不動時間與模型組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 3 組大鼠行為學指標評價結(jié)果比較（）

表1 3 組大鼠行為學指標評價結(jié)果比較（）

注：與建模前比較，*P＜0.05；與對照組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，ΔP＜0.05

2.2 大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學變化

對照組海馬CA1 區(qū)錐體細胞神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)規(guī)則，胞體為錐狀，胞漿中清晰可見尼氏質(zhì)；模型組海馬CA1 區(qū)錐體細胞神經(jīng)元細胞腫脹，排列稀疏，數(shù)量減少，細胞間隙增大，很多細胞胞漿中尼氏小體深染，數(shù)目減少，清晰度降低，出現(xiàn)大量核固縮、空泡、壞死等現(xiàn)象；舍曲林組海馬CA1 區(qū)錐體細胞形態(tài)學較模型組有不同程度改善，神經(jīng)元數(shù)量增加，細胞排列較為整齊，尼氏小體數(shù)量較模型組增加，固縮、空泡、壞死等現(xiàn)象都明顯減少。

2.3 大鼠海馬凋亡信號通路相關(guān)蛋白含量比較

建模后模型組腦組織TLR4、MyD88 及Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 蛋白含量較建模前均明顯升高，Bcl-2 顯著降低。而舍曲林組與模型組比較TLR4、MyD88 及Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA 表達水平明顯降低，Bcl-2 則顯著升高（P＜0.05），見表2。

表2 3 組大鼠海馬凋亡信號通路相關(guān)蛋白含量比較（，相對表達量／β-actin）

表2 3 組大鼠海馬凋亡信號通路相關(guān)蛋白含量比較（，相對表達量／β-actin）

注：與建模前比較，*P＜0.05；與對照組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，ΔP＜0.05

2.4 3 組大鼠海馬凋亡信號通路相關(guān)蛋白mRNA表達水平比較

建模后模型組腦組織TLR4、MyD88 及Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9mRNA 表達水平較建模前均明顯升高，Bcl-2 顯著降低（P＜0.05），而舍曲林組與模型組比較TLR4、MyD88 及Bax、Caspase-3、Caspase-9 蛋白含量明顯降低，Bcl-2 則顯著升高（P＜0.05），見表3。

表3 3 組大鼠海馬凋亡信號通路相關(guān)mRNA 表達比較（，2-ΔΔCt）

表3 3 組大鼠海馬凋亡信號通路相關(guān)mRNA 表達比較（，2-ΔΔCt）

注：與建模前比較，*P＜0.05；與對照組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，ΔP＜0.05

3 討論

CUMS 法模型是應用不可預見的輕度應激因子長時間對大鼠產(chǎn)生持續(xù)性刺激而引發(fā)大鼠抑郁癥狀，與人類抑郁癥的發(fā)生發(fā)展機理很接近［3］。本實驗中，我們對模型組和舍曲林組大鼠應用CUMS 法檢測抑郁癥模型，行為學試驗證實大鼠處于抑郁狀態(tài)，表現(xiàn)出快感缺乏、興趣減低等與臨床抑郁癥相似的癥狀，模型建立成功。SPT 偏好度是指1%糖水偏嗜度，其可反應動物活動度；OFT 實驗是評價大鼠在新環(huán)境中緊張度、探究行為、自主行為的一種行為學評價方法，水平運動能反映動物活動度，垂直運動能反映大鼠對新環(huán)境的好奇程度；TST 實驗目的在于檢測在可變性行為狀態(tài)下時大鼠的絕望程度；FST又稱絕望實驗，能反映出大鼠在不可逃避的應激下的抑郁反應［4-5］。本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠建模前后上述行為學檢測指標均無明顯變化。模型組SPT 偏好度顯著降低，OBT 水平運動得分和垂直運動得分均顯著減小，TST 和FST 時間均顯著延長。舍曲林組大鼠經(jīng)治療后上述指標較模型組均有明顯改善，提示模型組和舍曲林大鼠均出現(xiàn)不同程度的精神活動下降、快感缺乏、興奮降低及一系列絕望行為等抑郁癥狀。而經(jīng)過舍曲林抗抑郁治療后這些癥狀有顯著改善，即舍曲林對CUMS 模型大鼠的抑郁癥狀有改善作用，與既往研究結(jié)論一致［6］。

目前，抑郁癥的發(fā)生機制尚不完全明確，研究［7］顯示，抑郁癥動物模型海馬神經(jīng)元存在明顯的萎縮、凋亡、胞體腫脹和神經(jīng)營養(yǎng)低下等特點。海馬是大腦中樞系統(tǒng)中重要的與學習、情緒和記憶等行為功能有密切關(guān)系的區(qū)域，也是慢性應激刺激最易損傷的靶區(qū)域。本研究Nissl 染色結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬CA1 區(qū)域神經(jīng)元表現(xiàn)出數(shù)量減小、排列紊亂、細胞腫脹、間隙增加、尼氏小體數(shù)量減少或消失等病理改變，對照組神經(jīng)元密集、排列整齊、胞漿中尼式小體清晰可見，而舍曲林組CA1 區(qū)神經(jīng)元的海馬結(jié)構(gòu)異常處于模型組和對照組之間，相比模型組明顯減輕。由此可見，抑郁癥大鼠海馬萎縮，神經(jīng)元大量減少且形態(tài)學改變明顯，同時經(jīng)舍曲林治療后大鼠海馬神經(jīng)元損傷的病理變化有顯著緩解，與以往研究結(jié)果一致［8］。

細胞凋亡是各種基因調(diào)控下機體為維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的受胞內(nèi)和胞外途徑作用的程序化細胞死亡過程。國內(nèi)外研究［9］顯示，抑郁癥引起的海馬損傷與細胞死亡信號通路的異?；罨嘘P(guān)，引起通路中凋亡相關(guān)蛋白的異常表達。線粒體通透性改變是細胞凋亡發(fā)生的先導。Bcl-2 家族是目前公認的與細胞凋亡密切相關(guān)的基因，其控制著線粒體內(nèi)外膜通透性，主要包括促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2，二者比例能引起線粒體通透性改變，決定細胞是否發(fā)生凋亡［10］。Caspase 家族在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其參與了凋亡啟動和整個過程的調(diào)控。Caspase-3 是死亡蛋白酶，是凋亡的主要執(zhí)行者，可激活各種凋亡刺激因子，在caspase 級聯(lián)反應中處于核心位置；caspase-9 是凋亡啟動因子［11］。此外，抗凋亡基因Bcl-2 能通過與凋亡啟動因子直接結(jié)合來抑制caspase-3 激活，Caspase-3 激活的抑制也會反饋性抑制促凋亡蛋白Bax 激活，從而能抑制細胞凋亡的發(fā)生［12］。Toll 樣受體（TLR）是公認的與天然免疫系統(tǒng)密切相關(guān)的信號通路，其最突出的生物學功能是促進細胞因子合成分泌，促進抗原提呈細胞成熟，引發(fā)炎癥反應。TLR4 在信號轉(zhuǎn)導中主要存在兩條途徑：髓樣分因子88（MyD88）依賴信號途徑和β 干擾素結(jié)構(gòu)域銜接蛋白依賴性途徑。在前一途徑中，TLR 可通過C 端TIR 結(jié)構(gòu)域與接頭分子MyD88 結(jié)合來激活下游白介素1 受體相關(guān)激酶家族，最終使核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）激活?；罨腘F-κB 與海馬神經(jīng)細胞凋亡密切相關(guān)，其會進入細胞核內(nèi)啟動腫瘤壞死因子α 等炎癥介質(zhì)，對細胞凋亡產(chǎn)生促進性作用，導致腦損傷發(fā)生［13-14］。本研究結(jié)果顯示，建模后模型組腦組織TLR4、MyD88 及Bax、Caspase-3、Caspase-9 蛋白含量和mRNA 表達水平較建模前均明顯升高，Bcl-2 顯著降低，而舍曲林組與模型組比較TLR4、MyD88 及Bax、Caspase-3、Caspase-9 蛋白含量和mRNA 表達水平明顯降低，Bcl-2 則顯著升高（P＜0.05）。提示抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元凋亡可能與Bax、Bcl-2、Caspase9、Caspase3 和TLR4、MyD88 等凋亡信號通路相關(guān)蛋白異常表達有關(guān)，與郭郁等［13］的研究一致，而舍曲林的抗抑郁作用可能與其對這些蛋白表達的調(diào)控有關(guān)，有關(guān)其具體的作用機制仍需進一步探討。

綜上所述，舍曲林能明顯改善慢性應激抑郁癥大鼠抑郁樣行為，減輕大鼠神經(jīng)元損傷和凋亡。其作用機制可能與其對凋亡信號通路Bax、Caspase-3、Caspase-9 蛋白異常表達的調(diào)節(jié)和對TLR4／MyD88通路活化的抑制作用有關(guān)。