劉 俊，梁 霄，王淦誠(chéng)，何炳恩，龔湘君

(華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640)

根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Standardization Organization，ISO)定義，直徑<100 μm的氣泡稱(chēng)為微納氣泡[1]。微納氣泡可附著于表面或存在于溶液中。研究表明，微納氣泡是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系[2-3]，一般傾向于上浮至水面破裂或溶解于水中。研究表明，直徑在1 mm以上的大氣泡會(huì)快速上浮并破裂，而微納氣泡的上浮則相對(duì)緩慢，且隨著尺寸的繼續(xù)減小，這種上浮趨勢(shì)甚至?xí)?。譬如，水中直徑?0 μm的氣泡會(huì)以1 mm/s的速度上升[4]，有時(shí)伴隨著在水中的溶解消失，而納米氣泡在水中做布朗運(yùn)動(dòng)，幾乎不會(huì)上浮，其在水中甚至可穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)數(shù)天[5]，這不能用經(jīng)典的拉普拉斯方程解釋[6-7]。氣泡破裂時(shí)會(huì)在其周身產(chǎn)生顯著的水動(dòng)力，破裂能隨氣泡尺寸的減小而增大。微米尺度的氣泡在水中極少發(fā)生聚集[8]，但是，一旦受到外部能量(如超聲波)的干擾，匯聚現(xiàn)象就會(huì)發(fā)生，并釋放可觀(guān)的能量，足以殺死細(xì)菌[9-10]。一般而言，微納氣泡在pH值為2～12的溶液中帶負(fù)電荷，這是水分子中OH-吸附在氣泡界面的結(jié)果。但是，通過(guò)添加電解質(zhì)[11]或表面活性劑[12]，微納氣泡的表面電勢(shì)可以由負(fù)轉(zhuǎn)正。目前，研究者利用原子力顯微鏡發(fā)現(xiàn)，固體表面的納米氣泡具有超大的接觸角，可降低附加壓力并延長(zhǎng)其壽命[13]。然而，溶液中微納氣泡的產(chǎn)生及穩(wěn)定機(jī)理仍然不清楚。 因此，盡管微納氣泡已被廣泛應(yīng)用于礦物浮選[14]、污水處理[15]、采油[16]、土壤改良[17]等領(lǐng)域，但溶液中微納氣泡的基礎(chǔ)研究并不成熟，主要原因是缺乏合適的表征方法。表征微納氣泡，尤其是溶液中微納氣泡的難點(diǎn)有：(1)微納氣泡特別是納米氣泡，由于本身尺度小且極易受到擾動(dòng)，很難被觀(guān)測(cè)；(2)難以區(qū)分尺度相近的雜質(zhì)顆粒和微納氣泡；(3)微納氣泡的局部可能具有高濃度，并可發(fā)生諸如聚集、破裂等復(fù)雜、快速的動(dòng)態(tài)變化。

1 微納氣泡的表征方法

相對(duì)于其他的微粒，微納氣泡具有易受擾動(dòng)、形態(tài)多變、粒徑分布寬、折射率比水小等物理特性。當(dāng)前存在多種微納氣泡的表征方法(表1)，根據(jù)微納氣泡的物理特性，有測(cè)量微納氣泡粒徑及其分布的原子力顯微鏡法[18]、激光動(dòng)態(tài)光散射法[19]、多波長(zhǎng)消光法[20]、二維圖像法[21]，其中，原子力顯微鏡法、二維圖像法和衍射法[22]還可以得到樣品的形貌，多波長(zhǎng)消光法可以獲知樣品密度；有檢測(cè)高濃度微納氣泡樣品密度和成分的低場(chǎng)核磁法[23-24]。

原子力顯微鏡法利用由連接精密壓電陶瓷的精細(xì)探針探測(cè)pN～nN級(jí)別的原子力，并利用激光將原子力與探針的空間位置一一對(duì)應(yīng)，可獲得納米尺度的三維形貌和精細(xì)的相互作用，并可得到測(cè)量對(duì)象的軟硬度。但是，該方法適合觀(guān)察表面附著的氣泡，不能獲得實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的數(shù)據(jù)，無(wú)法觀(guān)察溶液中的氣泡[18]。

激光光散射方法主要用于獲知?dú)馀莸某叽绶植糩19]，可分為動(dòng)態(tài)光散射光強(qiáng)相關(guān)法、衍射法等。光強(qiáng)相關(guān)法的大致原理：當(dāng)激光照射到遠(yuǎn)小于其波長(zhǎng)或接近其波長(zhǎng)的小顆粒上，光會(huì)發(fā)生瑞利散射或米氏散射。由于小顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)，散射光的強(qiáng)度隨時(shí)間波動(dòng)并與顆粒在溶液中的擴(kuò)散有關(guān)，通過(guò)測(cè)量散射光強(qiáng)的時(shí)間相關(guān)性獲知顆粒的擴(kuò)散特性，并對(duì)應(yīng)至顆粒的流體力學(xué)尺寸[25]。衍射法收集散射顆粒不同角度的散射光，得到其空間分布。根據(jù)米氏散射原理，從散射光強(qiáng)的空間分布中獲知其尺寸信息[22]。

二維圖像法[21]，根據(jù)觀(guān)測(cè)對(duì)象的尺寸搭建具有一定放大倍數(shù)的可見(jiàn)光成像光路，對(duì)獲得的微氣泡圖像進(jìn)行二值化、輪廓識(shí)別和計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，得到氣泡的粒徑分布。但是，所獲得的僅為二維信息，攝像機(jī)的景深導(dǎo)致圖像實(shí)際為沿光軸方向一定距離的氣泡在物平面的投影，從而導(dǎo)致各種計(jì)算偏差，在高濃度下由于三維軌跡的二維投影重疊，難以獲得實(shí)際軌跡，受限于衍射極限，該方法只能觀(guān)測(cè)微米尺寸的顆粒，且不能分辨顆粒的材質(zhì)。二維追蹤法是二維圖像法的另外一種應(yīng)用，利用類(lèi)似暗場(chǎng)照明的方法將溶液局部照亮，不斷拍照累積光路中散射顆粒的運(yùn)行軌跡，利用圖像分析對(duì)這些軌跡進(jìn)行二維追蹤，并計(jì)算均方末端距用于關(guān)聯(lián)顆粒的流體力學(xué)尺寸。

以上方法可準(zhǔn)確測(cè)量微納氣泡的尺寸及分布，但均需要積累一段觀(guān)測(cè)時(shí)間來(lái)獲取有統(tǒng)計(jì)意義的數(shù)據(jù)；同時(shí)，除去尺寸信息(衍射法基于靜態(tài)光散射，可獲知規(guī)則物體的形狀信息，譬如桿狀、球狀等)，很難得到氣泡局部的形貌特征和局域變化，亦無(wú)法分辨氣泡和其他雜質(zhì)。這些方法在高濃度應(yīng)用時(shí)亦存在問(wèn)題。

此外，還有一些獨(dú)特的表征方法，譬如多波長(zhǎng)消光法，計(jì)算顆粒的消光系數(shù)并結(jié)合Lambert-Beer定律，對(duì)消光譜進(jìn)行反演，得到具有統(tǒng)計(jì)意義的氣泡粒徑分布[20]，該方法光路簡(jiǎn)單，可進(jìn)行原位在線(xiàn)的測(cè)量；又如低場(chǎng)核磁法，利用氫原子的能級(jí)躍遷，可非接觸地獲得含氫流體的水分子遷移率等信息，可獲得高濃度下的納米氣泡濃度[23]，并可粗略判斷氣體化學(xué)組成[24]。但是，這些方法仍然無(wú)法獲知局部的動(dòng)態(tài)和物性信息。

綜上，常見(jiàn)的氣泡表征方法均有各自的優(yōu)勢(shì)，但仍存在多種共同的局限，即無(wú)法準(zhǔn)確、精細(xì)、全面地觀(guān)察局部變化和動(dòng)態(tài)過(guò)程，難以獲知微納氣泡的形貌，以及不能區(qū)分與氣泡同等尺寸的雜質(zhì)。因此，發(fā)展了一種針對(duì)微納氣泡的三維動(dòng)態(tài)成像技術(shù)——數(shù)字全息顯微術(shù)(digital holographic microscopy，DHM)[28-29]。它利用光的干涉，記錄多個(gè)微納尺度顆粒的實(shí)時(shí)全息圖像，并對(duì)其進(jìn)行三維重建，獲取其運(yùn)動(dòng)軌跡、形態(tài)及相位，具有通量高、景深大、高精度、無(wú)損、包含材質(zhì)信息等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)既可以觀(guān)測(cè)表面微納氣泡，亦可觀(guān)測(cè)體相微納氣泡。以下部分將詳細(xì)闡述如何利用DHM觀(guān)察微納氣泡，獲得多個(gè)氣泡的三維軌跡和相圖，并基于相圖中折射率的差異區(qū)分氣泡與其他固體微粒。

表1 氣泡的常見(jiàn)表征方法Tab.1 Common Characterization Methods for Bubbles

圖1 DHM光路圖 (a)共軸模式；(b)離軸模式Fig.1 Schematic of DHM (a) In-Line DHM; (b) Off-Axis DHM

2 數(shù)字全息顯微鏡

2.1 數(shù)字全息顯微鏡的原理

DHM源于傳統(tǒng)光學(xué)全息術(shù)[30]，以數(shù)字形式，對(duì)全息圖像(即物體散射光場(chǎng)和已知相位的參考光場(chǎng)發(fā)生干涉，從而形成明暗相間的干涉條紋)進(jìn)行記錄和處理，克服了傳統(tǒng)方法光學(xué)重建較為繁瑣且需用到化學(xué)記錄介質(zhì)的問(wèn)題[31]。自主搭建了基于共軸和離軸光路的兩套DHM(圖1)，分別以L(fǎng)ED(λ=455/505 nm)和半導(dǎo)體激光(λ=473 nm)作為照明光源產(chǎn)生平面波。全息圖經(jīng)過(guò)顯微物鏡放大后，由sCMOS相機(jī)進(jìn)行快速拍攝和記錄。結(jié)合高倍物鏡，數(shù)字全息顯微鏡的成像極限可以達(dá)到50 nm以下(金屬顆粒)，用于細(xì)菌和顆粒追蹤時(shí)，它的軸向定位精度均在單顆粒以下[28-29]。其中，對(duì)于200 nm的Latex顆粒，其軸向定位精度在58 nm[28]。

記錄的全息圖用算法進(jìn)行物體波前信息的重建，主要包括3個(gè)步驟：背景扣除、光場(chǎng)重建和局部尋峰。背景扣除是對(duì)一組連續(xù)拍攝的原始全息圖像[圖2(a)]進(jìn)行平均處理，生成背景全息圖，然后對(duì)每一張?jiān)既D進(jìn)行背景圖的扣減[圖2(b)]，這樣可以去除表面雜質(zhì)和光路缺陷所引入的干擾信號(hào)。光場(chǎng)重建使用的是瑞利-索末菲(Rayleigh-Sommerfeld，RS)反向傳播法[32](共軸DHM)及角譜法(離軸DHM)[33]。RS反向傳播法基于衍射的球面波理論，即重建像平面內(nèi)任一點(diǎn)的復(fù)光場(chǎng)E(x,y)，等于全息圖平面∑0內(nèi)每一個(gè)點(diǎn)(x0,y0)發(fā)出的球面波在傳播水平距離z后在點(diǎn)(x,y)處的疊加。

圖2 (a) 微納氣泡的全息圖；(b) 扣減背景后的全息圖；(c) 重建過(guò)程Fig.2 (a) Hologram of Microbubbles; (b) Hologram with Background Subtracted; (c) 3D Reconstruction

(1)

式(1)寫(xiě)成卷積形式為式(2)。

E(x,y)=E0(x0,y0)?h(x,y)

(2)

由卷積定理，式(2)可以進(jìn)一步表示成式(3)～式(5)。

E(x,y)=F-1{F{E0(x0,y0)}·F{h(x,y)}}

(3)

k=kx2+ky2+kz2

(4)

(5)

其中：E(x,y)——光場(chǎng)分布；

k——波數(shù)，m-1；

l——光傳播距離，m；

h(x,y)——Rayleigh-Sommerfeld 傳播函數(shù)；

F-1和F——傅里葉逆變換和傅里葉變換。

重建的三維光場(chǎng)由豎直方向上的一疊一定間隔的二維圖層組成[圖2(c)]，并從式(3)中求得光強(qiáng)的三維分布。為獲得目標(biāo)物的三維位置和形態(tài)，先設(shè)定一個(gè)閾值，過(guò)濾掉光場(chǎng)中和樣品無(wú)關(guān)的低值噪音；然后，再用一個(gè)邊長(zhǎng)為w的正方體對(duì)重構(gòu)空間進(jìn)行分割和逐點(diǎn)搜尋，找到局部光強(qiáng)最大值點(diǎn)，并標(biāo)記為樣品顆粒的可能位置，w值的選取與樣品本身尺寸和密度有關(guān)；之后，基于這些可能的位置，進(jìn)一步利用空時(shí)一致性進(jìn)行位置的連接，得到被追蹤物體的實(shí)時(shí)三維軌跡?；跇悠返能壽E，可以進(jìn)一步提取物體在其三維位置上的聚焦面形態(tài)[圖2(c)]，并分析近界面處微粒的密度分布、三維速度、運(yùn)動(dòng)取向，以及與表面的碰撞概率等動(dòng)態(tài)信息[28,34]。為獲得目標(biāo)物的形態(tài)，根據(jù)樣品的三維坐標(biāo)，提取該位置的光場(chǎng)截面圖像。

離軸全息(off-axis DHM)由于沒(méi)有孿生相的干擾，可用于精確復(fù)原目標(biāo)物體的位相。基于角譜法[式(6)]恢復(fù)離軸全息圖的位相。角譜法的理論基礎(chǔ)是衍射的平面波理論，衍射的平面波理論認(rèn)為，重建面的光場(chǎng)分布是沿不同方向傳播的多束平面光波矢量疊加的結(jié)果，遵循的赫姆霍茲方程可在頻率域下準(zhǔn)確描述光波的衍射過(guò)程。頻率域和空間域的轉(zhuǎn)換可以通過(guò)二維離散傅里葉變換和傅里葉逆變換來(lái)實(shí)現(xiàn)[33]。氣泡的折射率比水小，而一般雜質(zhì)的折射率比水大，因此，前者與背景介質(zhì)的位相差為負(fù)值，后者則為正值，可用于作為區(qū)分氣泡和其他雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)[35]。

(6)

其中：A0——全息面的角譜。

對(duì)樣品的復(fù)振幅分布E(x,y)求反正切，即可獲得其相位分布φ(x,y)，即光程差，其對(duì)應(yīng)目標(biāo)顆粒物的形態(tài)分布，如式(7)。

(7)

其中：φ(x,y)——相位分布；

Im——函數(shù)虛部；

Re——函數(shù)實(shí)部。

離軸全息適用于表面微納氣泡的觀(guān)測(cè)，它的橫向和縱向分辨率分別為100 nm和10 nm。

2.2 數(shù)字全息顯微鏡的應(yīng)用

基于景深大、通量高、無(wú)須標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，數(shù)字全息顯微鏡(DHM)被廣泛應(yīng)用于粒子追蹤和三維成像領(lǐng)域。不同于非生命顆粒，生物細(xì)胞通常會(huì)對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生主動(dòng)響應(yīng)，并隨之改變運(yùn)動(dòng)行為，這些對(duì)常規(guī)檢測(cè)手段來(lái)說(shuō)不易捕捉的信息往往蘊(yùn)涵著重要的價(jià)值，可以被DHM輕松記錄和再現(xiàn)。使用DHM追蹤生物實(shí)體最大的優(yōu)勢(shì)在于它自帶標(biāo)記屬性，有利于保持樣品顆粒最原始的生理狀態(tài)。Heydt等[36]使用同軸全息研究了石莼游動(dòng)孢子在3種不同化學(xué)修飾表面的著陸行為并對(duì)其運(yùn)動(dòng)模式進(jìn)行了區(qū)分。經(jīng)過(guò)定量化分析，發(fā)現(xiàn)孢子的運(yùn)動(dòng)模式和表面化學(xué)性質(zhì)息息相關(guān)，同時(shí)認(rèn)為附著孢子在表面的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)是其探索和選擇定植表面位點(diǎn)時(shí)所采取的感應(yīng)策略。Maleschlijski等[37]利用全息獲取了數(shù)百條不同化學(xué)表面上藤壺幼蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)軌跡，并將其歸類(lèi)為5種運(yùn)動(dòng)模式，包括螺旋運(yùn)動(dòng)(spiralling)、游動(dòng)(swimming)、下沉(sinking)、旋轉(zhuǎn)(rotating)、行走(walking)。這一工作有助于理解藤壺幼蟲(chóng)游動(dòng)行為和表面選擇的關(guān)聯(lián)性，可助力研發(fā)和設(shè)計(jì)新的防污涂層。Sheng等[38]運(yùn)用DHM探究了2種尺寸相當(dāng)?shù)蝿?dòng)特征和營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型不同的鞭毛藻對(duì)獵物的響應(yīng)行為。結(jié)果顯示，混亂分布的2種鞭毛藻在引入獵物后都會(huì)發(fā)生簇?fù)憩F(xiàn)象，并表現(xiàn)出復(fù)雜多變的泳動(dòng)行為。游速慢混養(yǎng)型的K.veneficum面對(duì)獵物時(shí)速度、螺旋半徑和螺距會(huì)減小，但角速度會(huì)增大；而游速快異養(yǎng)型的P.piscicida采取的捕食策略是增大游速、螺旋半徑和角速度，略減小螺距。Choi等[39]利用DHM技術(shù)測(cè)量了圓形微管中流動(dòng)人體血紅細(xì)胞的3D體積速度場(chǎng)。細(xì)胞的形態(tài)特征是其生理狀態(tài)的反映，運(yùn)用離軸全息可以重建細(xì)胞的三維輪廓，從而定量評(píng)估細(xì)胞形態(tài)參量與其生理狀態(tài)的聯(lián)系。Rappaz等[40]借助離軸DHM測(cè)量了單個(gè)紅細(xì)胞的折光率，并定量計(jì)算了正常紅細(xì)胞和乙醇固定紅細(xì)胞整個(gè)表面的細(xì)胞膜波動(dòng)幅度，分別為(35.9±8.9)nm和(4.7±0.5)nm。該方法為紅細(xì)胞動(dòng)力學(xué)提供了新的見(jiàn)解，有望進(jìn)一步用于探究生理和藥理效應(yīng)物對(duì)紅細(xì)胞的作用。Nygate等[41]運(yùn)用離軸DHM和深度學(xué)習(xí)的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)精子細(xì)胞的虛擬染色和形貌分析。該方法可以節(jié)省寶貴的樣品處理時(shí)間，規(guī)避化學(xué)染料可能帶來(lái)的毒副作用，同時(shí)對(duì)多種類(lèi)型的細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分著色，在臨床醫(yī)療研究中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。Wilson[42]以孤立鞭毛的P.berghei雄配子為研究模型，使用高速DHM首次揭示了此類(lèi)微生物的三維鞭毛波形，推翻了鞭毛動(dòng)力學(xué)與其分子結(jié)構(gòu)(手性)存在關(guān)聯(lián)的錯(cuò)誤認(rèn)知，得出了微生物的附屬動(dòng)力結(jié)構(gòu)對(duì)鞭毛節(jié)拍有著不可忽視影響的推論。PHI[43]、IPRASENSE[44]、Ovizio[45]等公司先后開(kāi)發(fā)了無(wú)透鏡緊湊型的DHM系統(tǒng)，其體積小巧，可放置于培養(yǎng)環(huán)境下用于進(jìn)行細(xì)胞的形態(tài)觀(guān)測(cè)。Lyncee Tec[46]公司開(kāi)發(fā)的離軸型DHM被用于觀(guān)察光學(xué)元件缺陷和表面精細(xì)結(jié)構(gòu)及應(yīng)力變化。然而，截至目前，DHM尚無(wú)商業(yè)化的儀器應(yīng)用于做顆粒和氣泡的三維觀(guān)測(cè)和追蹤。

本課題組利用自主搭建的DHM，立足于解釋微生物的動(dòng)態(tài)黏附機(jī)理和優(yōu)化DHM定位追蹤算法，開(kāi)展了一系列研究工作。首先，細(xì)菌在界面附近的三維運(yùn)動(dòng)和黏附是一個(gè)連續(xù)、統(tǒng)一的過(guò)程，對(duì)細(xì)菌黏附于不同性質(zhì)表面之前的近界面三維運(yùn)動(dòng)行為進(jìn)行追蹤和還原可為細(xì)菌的界面黏附機(jī)制提供更多的線(xiàn)索和詮釋角度。Qi等[28]觀(guān)測(cè)了不同電荷性質(zhì)和親疏水性的聚合物表面上大腸桿菌的三維動(dòng)態(tài)行為，發(fā)現(xiàn)疏水表面會(huì)降低細(xì)菌的游速，這是細(xì)菌鞭毛碰撞到表面即尾部碰撞的結(jié)果，且細(xì)菌與疏水表面發(fā)生尾部碰撞時(shí)持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，細(xì)菌自身的推進(jìn)力是影響其黏附的重要因素。結(jié)合碰撞模型，定量估算細(xì)菌通過(guò)鞭毛與表面發(fā)生尾部碰撞，進(jìn)而產(chǎn)生黏附的臨界吸引力值，為0.008 nN/μm；對(duì)于具有不同降解速率的聚己內(nèi)酯均聚物、共聚物形成的“動(dòng)態(tài)表面”，認(rèn)為細(xì)菌黏附的不同主要取決于兩方面的因素：一是細(xì)菌與“動(dòng)態(tài)表面”基底的黏附力更弱，二是細(xì)菌對(duì)小分子降解產(chǎn)物具有趨化排斥反應(yīng)，傾向于逃離表面[34]。Peng等[47]指出，大腸桿菌和海洋菌銅綠對(duì)不同軟硬度的聚二甲基硅氧烷表面具有主動(dòng)響應(yīng)性，細(xì)菌在較軟的表面上出現(xiàn)更多的tumble(翻滾)和flick(輕敲)等特征運(yùn)動(dòng)，RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。Huang等[48]研究了微米尺度的表面形貌對(duì)人體精子運(yùn)動(dòng)行為的影響，結(jié)果表明，流體力學(xué)作用力是調(diào)控細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的主要因素。粗糙度的增大不利于精子的遷移，具體表現(xiàn)為精子的軸向振蕩增強(qiáng)，運(yùn)動(dòng)速度出現(xiàn)衰減，運(yùn)動(dòng)朝向角分布更寬，運(yùn)動(dòng)模式中的helical、hyperactivated 和hyperhelical 所占比例下降。有趣的是，當(dāng)表面特征形貌與精子尾部尺度一致時(shí)，精子可以通過(guò)尾部的擺動(dòng)來(lái)抵抗表面形貌對(duì)它的調(diào)控。

DHM雖適用于各種材質(zhì)和形狀的樣品，但不同種類(lèi)的樣品，如納米顆粒、細(xì)胞和細(xì)菌，由于運(yùn)動(dòng)特性的不同，對(duì)DHM三維定位精度的要求也各不相同。同時(shí)，高濃度下的粒子追蹤一直以來(lái)是一大難題。因此，為了推廣DHM的微觀(guān)應(yīng)用場(chǎng)景，進(jìn)行了定位追蹤算法的改進(jìn)和優(yōu)化。Huang等[29]將基于數(shù)值重建的高斯軸向擬合算法引入DHM中，提高了不同記錄條件下算法的軸向定位精度。數(shù)據(jù)表明，算法定位精度受到物鏡放大倍數(shù)、入射光強(qiáng)度和光照均勻度的影響，優(yōu)化后的軸向定位精度對(duì)大腸桿菌和PLPs(0.2 μm)分別可以達(dá)到318 nm和58 nm；之后，又利用基于圖像光強(qiáng)的軸向定位算法實(shí)現(xiàn)了近界面高精度定位。Wang等[49]開(kāi)發(fā)了一種高濃度下基于成本函數(shù)和圖像識(shí)別的連接軌跡片段的算法，用以研究細(xì)菌在游走過(guò)程中感應(yīng)到鄰近同伴后的運(yùn)動(dòng)行為變化。該算法在細(xì)菌濃度低于3×107mL-1時(shí)準(zhǔn)確率高于96%，對(duì)樣品形狀無(wú)特殊要求，可進(jìn)一步應(yīng)用于顆粒、氣泡等體系。

DHM盡管有著數(shù)十年的發(fā)展歷史，目前用于科學(xué)研究居多，商業(yè)化的產(chǎn)品則較為少見(jiàn)。為了進(jìn)一步發(fā)揮DHM的商業(yè)價(jià)值，在未來(lái)，它將朝著小尺寸、無(wú)透鏡、大視野、可快速重建等研究方向發(fā)展。

3 微納氣泡的三維表征與結(jié)果討論

Tian等[50]利用激光同軸全息可得到1 cm見(jiàn)方范圍內(nèi)大量微米氣泡的尺寸和三維分布。Shao等[51]提出了一種混合氣泡全息圖處理方法，用于在1 cm見(jiàn)方的大范圍內(nèi)測(cè)量微米、亞毫米和毫米氣泡的尺寸和三維分布。Hall等[52]利用同軸全息觀(guān)察了水面濺起的小液滴。然而，尚無(wú)一種方法將大量氣泡的三維定位與追蹤觀(guān)察相結(jié)合，并同時(shí)得到氣泡的尺寸、形態(tài)、三維位置和相圖(材質(zhì))的信息?；诖耍米越ǖ腄HM，觀(guān)察了表面活性劑穩(wěn)定的微納氣泡的三維動(dòng)態(tài)行為。

微氣泡由攪拌槳攪拌加入0.008%表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉的超純水產(chǎn)生，表面活性劑用以降低氣泡所受的附加壓力，從而使氣泡穩(wěn)定[53]，包含微納氣泡的該液體經(jīng)內(nèi)徑為0.6 mm的軟細(xì)管由蠕動(dòng)泵注入并導(dǎo)出至干凈的玻璃觀(guān)察皿。該觀(guān)察皿使用食人魚(yú)洗液(70%濃硫酸與30%過(guò)氧化氫溶液的混合液)進(jìn)行預(yù)處理，增強(qiáng)表面的親水性。在觀(guān)察皿中制造厚度約2 mm的水層進(jìn)行觀(guān)察。利用被攝物散射單色光產(chǎn)生的干涉現(xiàn)象，得到包含被攝物三維位置信息的全息圖，計(jì)算得扣減背景的全息圖，由Rayleigh-Sommerfeld算法進(jìn)行三維重建，并得到氣泡的三維位置和尺寸大小，如圖3(a)所示。

在獲得了一段時(shí)間視場(chǎng)內(nèi)多張全息圖的基礎(chǔ)上，通過(guò)局部尋峰算法，結(jié)合氣泡運(yùn)動(dòng)的空時(shí)一致性，獲得一定時(shí)間段內(nèi)源源不斷進(jìn)入視場(chǎng)中的大量微氣泡的三維位置和尺寸(圖3)。圖3(a)為一個(gè)瞬間視野體積內(nèi)所有氣泡的尺寸和位置分布。由圖3(a)和圖3(b)可知，80%以上的微納氣泡集中在6 μm以下，越小的氣泡數(shù)量越多。對(duì)30 s內(nèi)通過(guò)視場(chǎng)的部分氣泡進(jìn)行軌跡追蹤，結(jié)果如圖3(c)所示，可見(jiàn)氣泡的流向一致，水流速度漸慢導(dǎo)致后進(jìn)入視場(chǎng)的氣泡速度下降。全體軌跡在z方向的平均上浮速度為7.56 μm/s，但由于人造水平流場(chǎng)，出現(xiàn)了部分氣泡在z方向下沉的結(jié)果。

圖3 (a)微納氣泡的三維分布；(b)尺寸分布；(c) 三維運(yùn)動(dòng)軌跡Fig.3 (a) 3D Distribution of Microbubbles with Distinct Sizes; (b) Size Distribution; (c) 3D Trajectories

進(jìn)一步將氣泡發(fā)生裝置置于離軸DHM光路中，以獲得水體中微氣泡的相位信息。對(duì)獲得的微氣泡全息圖[圖4(a)]，使用角譜法進(jìn)行圖像的三維重建，得到水中氣泡的相位差圖[圖4(b)]，相移恰是由于空氣與水折射率不同產(chǎn)生的光程差。相對(duì)于水相為負(fù)的相移表明通過(guò)該物質(zhì)使光程減小，故該物質(zhì)的折射率小于水，與空氣折射率小于水的實(shí)際情況一致[35]。

圖4 (a)一個(gè)微納氣泡的離軸數(shù)字全息圖；(b) 相差圖；(c) 氣泡存在導(dǎo)致相差為負(fù)的原理圖Fig.4 (a) Hologram of a Microbubble by Off-Axis DHM; (b) Phase Difference Map;(c) Schematic for Negative Phase Deviation Caused by a Bubble

4 結(jié)論

針對(duì)現(xiàn)有微納氣泡表征手段存在的問(wèn)題，發(fā)展了基于數(shù)字全息顯微鏡的無(wú)損、高通量的微納氣泡三維表征技術(shù)，獲取了多個(gè)氣泡的實(shí)時(shí)三維軌跡和相圖，為進(jìn)一步分析氣泡的尺寸和密度分布、局部動(dòng)態(tài)變化過(guò)程以及區(qū)分相近尺度的氣泡和雜質(zhì)顆粒奠定了基礎(chǔ)。在未來(lái)，將進(jìn)一步提升數(shù)字全息顯微鏡的定位和位相解析精度，并設(shè)計(jì)針對(duì)高濃度多重散射干擾的三維重建算法，同時(shí)基于機(jī)器學(xué)習(xí)等算法，提高計(jì)算重構(gòu)的速度。該技術(shù)將有望從新的角度揭示微納氣泡在溶液中的動(dòng)態(tài)行為和物理化學(xué)特性，從而更好地指導(dǎo)微納氣泡的實(shí)際應(yīng)用。