丁芮涵，侯麗偉，劉慶珍，毛 赫，于海媛，張曉光，李立梅

(吉林省林業(yè)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130033)

藍(lán)莓，又名越橘，是杜鵑花科(Ericaceae)多年生灌木果樹，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，素有“水果之王”的美譽(yù)，食用后可增加機(jī)體免疫力，具有醫(yī)療保健作用[1]。

迄今國(guó)內(nèi)已有27個(gè)省(市)有藍(lán)莓種植地，分為四大產(chǎn)區(qū)：膠東半島產(chǎn)區(qū)、長(zhǎng)白山產(chǎn)區(qū)、云貴高原產(chǎn)區(qū)和長(zhǎng)江中下游產(chǎn)區(qū)。截至2017年，我國(guó)藍(lán)莓種植面積已經(jīng)從2001年24 hm2增長(zhǎng)到2 049 hm2。

隨著藍(lán)莓種植面積的加大，藍(lán)莓病害日趨嚴(yán)重，給藍(lán)莓生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失慘重[2]。藍(lán)莓病害中危害性最強(qiáng)、最難防控的屬藍(lán)莓潰瘍病，其病原菌為葡萄座腔孢菌(Botryosphaeriadothidea)。目前，研究多集中在藍(lán)莓潰瘍病的病原學(xué)鑒定方面[3]?？岛ｆ玫热藢?duì)抗藍(lán)莓潰瘍病的藍(lán)莓品種進(jìn)行了篩選研究[4]。針對(duì)該病害的防治多集中于化學(xué)防治，而針對(duì)藍(lán)莓潰瘍病抗生素的報(bào)道較少。

本研究獲得的拮抗菌株CX3具有殺真菌活性組分，分析認(rèn)為，是由于拮抗菌CX3在發(fā)酵過程中的次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)揮作用[5]。在菌種發(fā)酵的進(jìn)程里，想要菌種發(fā)酵的效果好，需要準(zhǔn)確摸索出其發(fā)酵的最佳條件和培養(yǎng)基配方[6]。

本研究篩選獲得1株對(duì)藍(lán)莓潰瘍病菌有很好抑制效果的菌株(CX3)，其發(fā)酵液對(duì)藍(lán)莓潰瘍病菌有極強(qiáng)的抑制作用，經(jīng)測(cè)定，其對(duì)多種農(nóng)林重要病害、病原菌有較好的抑制作用，廣譜性好，開發(fā)潛力極大[7]。為了更好地發(fā)揮CX3的抑菌效果，作者對(duì)CX3的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為藍(lán)莓潰瘍病的生物防治奠定理論基礎(chǔ)并提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)材料

供試菌株：菌株CX3(Streptomycessp.)：由吉林省林業(yè)科學(xué)研究院分離保存并鑒定。靶標(biāo)菌為藍(lán)莓潰瘍病菌(Botryosphaeriadothidea)，由延安大學(xué)徐成楠副教授饋贈(zèng)。

原始發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉70 g、花生餅粉33 g、(NH4)2SO44 g、NaCl 4 g、CaCO34 g、蒸餾水1 000 mL、pH7.0。

1.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.1.1 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件優(yōu)化

供試碳源：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉，對(duì)照組不添加碳源。

供試氮源：玉米粉、大豆粉、牛肉膏、麥麩、尿素、花生餅粉，對(duì)照組不添加氮源。

供試無(wú)機(jī)氮源：以KNO3、NaNO3、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4，對(duì)照組不添加無(wú)機(jī)氮源。

原始發(fā)酵條件為：種子液與培養(yǎng)基體積比為3 %，pH7.0，28 ℃，150 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)5 d。發(fā)酵完成后收集發(fā)酵液，6 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，收集上清液，采用杯碟法測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性。每組處理3次重復(fù)。

1.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

根據(jù)以下方案制成培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)(表1)。使用正交優(yōu)化法對(duì)培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化，選擇抑菌直徑最大的組分作為培養(yǎng)基配方，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 營(yíng)養(yǎng)成分體積分?jǐn)?shù)水平

1.1.3發(fā)酵條件優(yōu)化

采用單因素分析法。在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別改變發(fā)酵時(shí)間、pH、種齡、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速和種子液與培養(yǎng)基體積比(表2)。發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液置10 000 r·min-1、4 ℃離心處理10 min后取上清液，采用杯碟法測(cè)定發(fā)酵液抑菌活性，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

表2 發(fā)酵條件水平

1.2 發(fā)酵液理化性質(zhì)測(cè)定

選用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方與發(fā)酵條件，進(jìn)行發(fā)酵。收集離心后的發(fā)酵上清液，對(duì)發(fā)酵液的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性、耐貯性進(jìn)行測(cè)定。

1.2.1 pH穩(wěn)定性測(cè)定

將收集到的發(fā)酵上清液分成14組，分別用濃度為1 mol·L-1鹽酸和1 mol·L-1氫氧化鈉溶液將發(fā)酵液的pH調(diào)節(jié)為1～14，室溫放置24 h，然后將所有處理pH調(diào)至7。以杯碟法測(cè)定抑菌活性，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 熱穩(wěn)定性測(cè)定

分別設(shè)置兩組試驗(yàn)進(jìn)行熱穩(wěn)定性測(cè)定。

第一組：將發(fā)酵液置于不同溫度的水浴鍋內(nèi)，30 min后取出，待冷卻至室溫后檢測(cè)抑菌活性。溫度設(shè)置：30 ℃、50 ℃、70 ℃、90 ℃、121 ℃。

第二組：將發(fā)酵液置于100 ℃水浴鍋內(nèi)加熱不同時(shí)間后取出，待冷卻至室溫后檢測(cè)抑菌活性。時(shí)間設(shè)置：10 min、30 min、60 min、120 min。

以上試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3光穩(wěn)定性測(cè)定

取發(fā)酵上清液，于紫外光和自然光下照射不同時(shí)間后，以未經(jīng)光照處理的發(fā)酵液為對(duì)照，分別測(cè)定抑菌活性。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 耐貯性測(cè)定

取適量發(fā)酵液分別置于-20 ℃、4 ℃、室溫放置15 d，對(duì)照組為未經(jīng)擱置的新鮮發(fā)酵液，分別測(cè)定抑菌活性。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件優(yōu)化

拮抗菌CX3發(fā)酵的最佳營(yíng)養(yǎng)條件結(jié)果顯示如下(圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12)。

圖1 不同碳源對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

圖2 不同碳源發(fā)酵液的抑菌圈

圖3 不同有機(jī)氮源對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

圖4 不同有機(jī)氮源發(fā)酵液的抑菌圈

圖5 不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

圖6 不同無(wú)機(jī)氮源發(fā)酵液的抑菌圈

圖7 不同碳源體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

圖8 不同體積分?jǐn)?shù)碳源發(fā)酵液的抑菌圈

圖9 不同有機(jī)氮源體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

圖10 不同體積分?jǐn)?shù)有機(jī)氮源發(fā)酵液的抑菌圈

圖11 不同無(wú)機(jī)氮源體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株發(fā)酵液抑菌效果的影響

圖12 不同體積分?jǐn)?shù)無(wú)機(jī)氮源發(fā)酵液的抑菌圈

所有供試碳源均能被菌株CX3所利用。其中，葡萄糖的發(fā)酵液抑菌效果最好，抑菌直徑達(dá)22.3 mm。

供試有機(jī)氮源中尿素不能被菌株CX3所利用，花生餅粉作為有機(jī)氮源的發(fā)酵液抑菌效果最佳，抑菌直徑達(dá)20.79 mm。

所有供試無(wú)機(jī)氮源均能被菌株CX3所利用，其中硝酸鉀的發(fā)酵液抑菌效果最好，抑菌直徑達(dá)28.7 mm。

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

確定了最佳碳源、有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源的成分和最適體積分?jǐn)?shù)范圍后，對(duì)最佳碳氮比進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3。優(yōu)化前后對(duì)比見圖13。

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)水平因素

數(shù)據(jù)經(jīng)聚類分析正交軟件處理結(jié)果如表4所示，可知A(葡萄糖)、B(花生餅粉)、C(硝酸鉀)三個(gè)因素中，對(duì)發(fā)酵液抑菌效果影響的主次順序?yàn)椋築>C>A。

由此可以得到發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳氮配比為：葡萄糖6 %，花生餅粉4 %，硝酸鉀0.4 %。優(yōu)化前的抑菌直徑是15.93 mm，優(yōu)化后是24.88 mm，抑菌效果有明顯提升。

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

圖13 優(yōu)化前后對(duì)比

2.1.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如圖14所示，初始pH的不同會(huì)對(duì)菌種的發(fā)酵有較大影響。pH為3時(shí)，發(fā)酵液的抑菌效果較弱，與其他處理組差異顯著；發(fā)酵時(shí)間3～6 d內(nèi)，發(fā)酵液抑菌活性隨時(shí)間的增加而增強(qiáng)，發(fā)酵6 d后抑菌活性不再增強(qiáng)；選取種齡6 d、7 d的種子液發(fā)酵后，抑菌效果最好?？紤]節(jié)約時(shí)間與成本，選取種齡為6 d的種子液，種子液與培養(yǎng)基體積比為5 %時(shí)的發(fā)酵液抑菌效果最好，故最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度28 ℃，pH 7.0，發(fā)酵時(shí)間6 d，搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1，種齡6 d，種子液與培養(yǎng)基體積比5 %。

圖14 不同發(fā)酵條件對(duì)菌株CX3抑菌效果的影響

2.2 發(fā)酵液理化性質(zhì)測(cè)定

CX3發(fā)酵液的理化性質(zhì)測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果如圖15所示。發(fā)酵液對(duì)酸性環(huán)境敏感，對(duì)堿性環(huán)境耐受性好，在pH3～14之間均表現(xiàn)出很好的抑菌效果。熱穩(wěn)定較好，發(fā)酵液在經(jīng)過100 ℃處理后，隨著處理時(shí)間的增加，抑菌效果逐漸減弱；隨著處理溫度的增加，發(fā)酵液抑菌效果逐漸減弱，121 ℃處理時(shí)喪失抑菌活性。耐貯性試驗(yàn)表明，CX3發(fā)酵液耐貯性極強(qiáng)，常溫下也可長(zhǎng)效保持抑菌活性。光穩(wěn)定性極強(qiáng)，在自然光和紫外光照下均表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑菌效果。

注：A為pH穩(wěn)定性；B為熱穩(wěn)定性，100 ℃處理不同時(shí)間；C為熱穩(wěn)定性，不同溫度處理30 min；D為耐貯性；E為自然光照穩(wěn)定性；F為紫外光照穩(wěn)定性。

3 討論

3.1 發(fā)酵環(huán)境條件優(yōu)化

研究表明，菌株CX3的發(fā)酵與其自身屬性、培養(yǎng)基的配方和發(fā)酵時(shí)的環(huán)境密切相關(guān)，只有應(yīng)用條件在發(fā)酵條件都達(dá)到合適的程度才能有效提高發(fā)酵產(chǎn)出次級(jí)代謝產(chǎn)物的效率。在大型發(fā)酵設(shè)備的生產(chǎn)工藝研究中，發(fā)酵條件還需嚴(yán)格把控通氣量等因素。

3.2 培養(yǎng)基正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

碳源和氮源作為培養(yǎng)基中重要組成成分，可為菌體的生長(zhǎng)發(fā)育提供必要的營(yíng)養(yǎng)和能量，并且在菌體代謝過程中起到重要作用[8]，在發(fā)酵過程中，碳源和氮源的含量會(huì)直接影響發(fā)酵效果。碳氮源不足時(shí)，會(huì)不利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成；碳源過多的培養(yǎng)基會(huì)使菌種發(fā)生自溶；氮源過多會(huì)造成菌體生長(zhǎng)過量而次級(jí)代謝產(chǎn)物積累較少。因此，合理的配比對(duì)菌體的發(fā)酵至關(guān)重要。

3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

適宜的pH能夠使菌體的代謝更加順暢，同理，不利的pH會(huì)使菌體代謝發(fā)生受阻[9]。同時(shí)，在發(fā)酵過程中還需要摸索好菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[10]，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液作為種子液，以更好的促進(jìn)菌種發(fā)酵，從而達(dá)到次級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)的目的[11]。

4 結(jié)論

菌株CX3的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后的最佳配方為：葡萄糖60 g，花生餅粉40 g，硝酸鉀4 g，氯化鈉4 g，碳酸鈣4 g，水1 000 mL，pH 7.0。最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1，初始pH7，發(fā)酵時(shí)間6 d、菌株種齡6 d、種子液與培養(yǎng)基體積比5 %。優(yōu)化前的抑菌直徑是15.93 mm，優(yōu)化后是24.88 mm。發(fā)酵液理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果：發(fā)酵液耐堿不耐酸；對(duì)溫度的耐受性好，但長(zhǎng)時(shí)間暴露于高溫下會(huì)使發(fā)酵液失活；耐貯性好，常溫保存的發(fā)酵液也可保持抑菌活性。

CX3的發(fā)酵與其自身屬性、培養(yǎng)基的配方和發(fā)酵時(shí)的環(huán)境關(guān)系密切，因此，找尋出CX3發(fā)酵液的最佳營(yíng)養(yǎng)條件和發(fā)酵條件，從而獲得高產(chǎn)的次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究十分有意義。本研究從多個(gè)方面對(duì)鏈霉菌CX3的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，CX3極具開發(fā)潛力，有望投入到大規(guī)模發(fā)酵設(shè)備中量化生產(chǎn)，其發(fā)酵獲得的次級(jí)代謝產(chǎn)物能夠作為生防菌劑防治藍(lán)莓潰瘍病，為漿果病害防治提供新的方法。