胡敏，於四軍

(1.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院 心內(nèi)科，廣東 深圳 518000；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心 心內(nèi)科，北京 100039)

擠壓綜合征是由于軀干或四肢等肌肉及血供豐富部位，經(jīng)過(guò)外界持續(xù)性擠壓損傷后出現(xiàn)與缺血再灌注損傷相關(guān)的一系列病理生理改變，以橫紋肌溶解、循環(huán)衰竭及急性腎損傷為特點(diǎn)的臨床危重癥疾病，多發(fā)生在戰(zhàn)爭(zhēng)災(zāi)害、恐怖襲擊、地震、山體滑坡等事件中[1]。目前擠壓綜合征以大量補(bǔ)液及腎臟替代療法為主要治療手段[2]。由于災(zāi)害現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境及醫(yī)療條件的限制，很多患者并不能在早期接受腎臟替代治療，因此，急性腎損傷的發(fā)生率并沒(méi)有得到有效的降低[3]。而擠壓綜合征最主要的特征是在缺血再灌注組織產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基引起缺血再灌注過(guò)程中氧化損傷、橫紋肌溶解。氧自由基是擠壓綜合征的主要病因[4]。因此，自由基清除劑的應(yīng)用為擠壓綜合征的藥物治療提供了新的思路。有研究表明，褪黑素在大鼠的心肌、肝臟等器官缺血再灌注中發(fā)揮清除自由基及抗氧化作用，對(duì)靶器官具有保護(hù)作用[5-6]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立擠壓綜合征動(dòng)物模型來(lái)觀察褪黑素對(duì)大鼠酸堿平衡紊亂、氧化應(yīng)激損傷、橫紋肌溶解及存活率等方面的影響，為擠壓綜合征的早期治療、減少擠壓綜合征并發(fā)癥的發(fā)生以及提高其生存率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 造模與分組

SPF 級(jí)健康雄性wistar 大鼠，體重300 ～350 g，由軍事科學(xué)院動(dòng)物中心供應(yīng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)編號(hào)為：SCXK-( 軍)2012-0004。

實(shí)驗(yàn)大鼠在SPF 級(jí)條件下飼養(yǎng)，自由采食與飲水，實(shí)驗(yàn)室室溫控制在23℃左右，室內(nèi)濕度在(55±15)%，日光燈明暗12 h 交替照射。將Isamu Murata 等擠壓綜合征造模方法加以利用改進(jìn)[7]，利用5% 戊巴比妥鈉溶液以50 mg/kg 劑量腹腔麻醉大鼠，利用卡式止血帶擠壓大鼠后肢根部，止血帶拉力等同于3 kg 重物的壓力，5 h后撤除止血夾恢復(fù)擠壓肢體血流灌注，其間大鼠能自由獲取食物與水。

觀察大鼠生存率的試驗(yàn)中，保證各組大鼠存活10 只的前提下，取大鼠分為Sham 組(n=10)、CS 組(n=30)、NS 組(n=25)、MEL 組(n=16)，觀察再灌注48 h 各組大鼠死亡的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行生存曲線分析。另取大鼠隨機(jī)分為四組：空白組(Sham 組，n=10，除麻醉5 h 外無(wú)任何處理)、對(duì)照組(CS 組，n=10，擠壓造模后無(wú)處理，再灌注6 h)、氯化鈉組(NS 組，n=10，解壓前給予10 mL/kg 氯化鈉擴(kuò)容，再灌注6 h) 及褪黑素組(MEL組，n=10，解壓前給予10 mL/kg 褪黑素溶液，再灌注6 h)。所有給藥均在解除壓迫前即刻通過(guò)鼠尾靜脈5 min內(nèi)推注。

1.2 試劑和儀器

褪黑素(Sigma 公司，美國(guó))；戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國(guó))；血?dú)馍瘻y(cè)試卡片G3+( 雅培公司，美國(guó))；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT) 和丙二醛(MDA) 測(cè)定試劑盒( 南京建成生物工程研究所)。

儀器：倒置顯微鏡(Olympus，日本)；雅培i-STAT300血?dú)夥治鰞x( 雅培公司，美國(guó))；RM6240 多道生理信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠)；酶標(biāo)儀(Beckman 公司，美國(guó))；日立7600 全自動(dòng)生化分析儀(日立高新技術(shù)有限公司)。

此外，4% 多聚甲醛、乙醇、二甲苯、固體石蠟、HE 染色等均由北京雪邦病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 標(biāo)本留取方法

再灌注6 h 時(shí)，利用5%戊巴比妥鈉溶液以50 mg/kg劑量腹腔麻醉大鼠，開(kāi)腹，游離降主動(dòng)脈及髂動(dòng)脈；在左右髂動(dòng)脈分叉處穿刺進(jìn)針，可穿刺取血，但穿刺前利用肝素鹽水濕潤(rùn)注射器以防止血液凝固，通過(guò)腹主動(dòng)脈穿刺取血約5 mL，滴取動(dòng)脈血數(shù)滴于血?dú)馍瘻y(cè)試卡片G3+ 采血孔內(nèi)，通過(guò)手持式i-STAT300 血?dú)夥治鰞x測(cè)量動(dòng)脈血?dú)猓⒂涗洈?shù)據(jù)；剩余血液以2 500 r/min，離心20 min，取上清液，測(cè)量各組血清中GSH-Px、SOD、CAT 的活性以及MDA 的含量，并利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)量各待測(cè)血清鉀離子、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH) 的含量。同時(shí)，解剖大鼠雙下肢腓腸肌，用冰生理鹽水沖洗干凈，置于4% 多聚甲醛固定24 h，用于制作石蠟切片。

1.4 主要指標(biāo)測(cè)定方法

依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)GSH-Px、SOD、CAT 及MDA。利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組大鼠血清鉀離子、CK 及LDH 含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示。首先驗(yàn)證四組數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布及方差齊性；正態(tài)分布、方差齊的數(shù)據(jù)多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法，方差不齊時(shí)采用Dunnett's 法；不服從正態(tài)分布資料的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 褪黑素提高擠壓綜合征大鼠生存率

CS 組大鼠的生存率為20%，NS 組大鼠的生存率29.2%，MEL 組大鼠的生存率為56.3%，MEL 組大鼠生存率明顯高于CS 組與NS 組，log-rank 檢 驗(yàn)χ2為23.07，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組生存曲線見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠生存曲線

2.2 褪黑素改善酸堿平衡紊亂

與Sham 組比較，CS 組血液中pH 值、HCO3-和剩余堿含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與CS 組比較，NS 組血液中pH 值、HCO3-和剩余含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與CS 組比較，MEL 組血液中pH 值、HCO3-和剩余含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)獗容^(± s)

表1 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)獗容^(± s)

注：與Sham 組比較，①P ＜0.05；與CS 組比較，②P ＜0.05。

組別 n pH HCO3-/(mmol·L-1) BE/(mmol·L-1)Sham 組 10 7.44±0.01 29.5±0.8 3.4±0.8 CS 組 30 7.30±0.02① 18.2±0.9① -8.5±1.0①NS 組 25 7.32±0.02 21.0±1.2 -6.8±0.9 MEL 組 16 7.41±0.03② 26.8±1.1② 1.5±1.1②

2.3 褪黑素減輕橫紋肌溶解

CS 組血清中鉀、CK、LDH 含量明顯高于Sham組(P＜0.05)；與CS 組相比，MEL 組血清中鉀、CK、LDH 顯著降低(P＜0.05)；而NS 組與CS 組比較，血清中鉀、CK、LDH 含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清橫紋肌溶解標(biāo)志物含量比較(± s)

表2 各組大鼠血清橫紋肌溶解標(biāo)志物含量比較(± s)

注：與Sham 組比較，①P ＜0.05；與CS 組比較，②P ＜0.05。

組別 n 鉀/(mmol·L-1) CK/(U·L-1) LDH/(U·L-1)Sham 組 10 4.11±0.36 353±58 150±39 CS 組 30 7.59±0.48① 27 336±685 1① 2 780±360①NS 組 25 7.30±0.48 25 021±524 2 2 622±249 MEL 組 16 6.01±0.45② 13 270±362 4② 1 488±312②

2.4 褪黑素緩解氧化應(yīng)激

CS 組血清中GSH-Px、SOD、CAT的活性低于Sham 組，MDA 的含量高于Sham 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；MEL 組血清中GSH-Px、SOD、CAT 的活性高于Sham 組，MDA 的含量低于Sham 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而NS 組中GSH-Px、SOD、CAT、MDA 水平與CS 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中GSH-Px、SOD、CAT、MDA 水平比較(± s)

表3 各組大鼠血清中GSH-Px、SOD、CAT、MDA 水平比較(± s)

注：與Sham 組比較，①P ＜0.05；與CS 組比較，②P ＜0.05。

SH-Px/(U·mL-1) SOD/(U·mL-1) CAT/(U·mL-1) 77.6±7.23 319.90±25.20 42.1±1.78 組別 n GMDA/(μmol·L-1)Sham 組 10 2.65±0.39 CS 組 30 48.8±5.31① 179.20±18.42① 25.1±2.65① 6.89±0.39①NS 組 25 52.7±3.48 183.64±15.49 25.7±3.77 6.56±0.84 MEL 組 16 64.7±4.32② 255.86±26.00② 32.3±2.82② 4.54±0.61②

2.5 腓腸肌光鏡下HE 染色結(jié)果

Sham 組腓腸肌纖維間未見(jiàn)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肌肉纖維正常分布；CS 組、NS 組腓腸肌纖維間質(zhì)水腫明顯，肌纖維結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，骨骼肌橫紋紊亂；MEL 組肌肉纖維間可見(jiàn)輕度水腫，纖維組織稍紊亂，其形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯好于CS 組與NS 組。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腓腸肌光鏡下HE 染色表現(xiàn)(×200)

3 討 論

擠壓綜合征是由于四肢或軀干等肌肉豐富部位遭受長(zhǎng)時(shí)間擠壓，在解除壓迫后出現(xiàn)的缺血再灌注損傷，多發(fā)生在戰(zhàn)爭(zhēng)災(zāi)害、恐怖襲擊、地震、山體滑坡等災(zāi)害性事件中，主要表現(xiàn)出肢體腫脹、橫紋肌溶解、酸中毒、高鉀血癥、急性腎損傷等主要臨床特征。Isamu Murata等[7]通過(guò)止血帶擠壓大鼠雙下肢的方法建立了擠壓綜合征動(dòng)物模型，評(píng)估造模大鼠的的臨床特征，證實(shí)該模型具有較好的穩(wěn)定性。近些年來(lái)，褪黑素在缺血再灌注損傷實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，特別是在腎臟、肝臟及心肌等組織缺血再灌注損傷過(guò)程中具有顯著療效[8-10]。本實(shí)驗(yàn)研究中CS 組與MEL 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，褪黑素能顯著改善減輕下肢缺血再灌注損傷，主要表現(xiàn)在缺血再灌注損傷過(guò)程中酸堿平衡紊亂、橫紋肌溶解及氧化損傷程度得到顯著改善，外源性褪黑素干預(yù)也同時(shí)提高了造模大鼠48 h生存率。

缺血再灌注損傷與自由基的形成密切相關(guān)，自由基主要由再灌注過(guò)程中大量產(chǎn)生的活性氧(ROS) 轉(zhuǎn)化而來(lái)。ROS 主要在線粒體中產(chǎn)生[11]，線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物的氧化還原狀態(tài)快速變化，造成再灌注時(shí)大量的電子加速傳遞給氧，線粒體中ROS 形成大大提高。ROS 誘導(dǎo)胞漿中酶發(fā)生變性，通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程使細(xì)胞膜完整性遭到破壞。ROS 介導(dǎo)的漿網(wǎng)功能障礙也導(dǎo)致大量細(xì)胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死。褪黑素為非極性結(jié)構(gòu)，可以穿透細(xì)胞膜，在線粒體中濃度最高[12]。有研究表明，褪黑素能抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，減輕缺血再灌注損傷[13]。本研究檢測(cè)血清中橫紋肌溶解標(biāo)志物—血清鉀、CK 及LDH 的釋放并觀察腓腸肌病理改變來(lái)反映缺血再灌注損傷后橫紋肌溶解程度，結(jié)果表明褪黑素對(duì)擠壓綜合癥模型受傷的肌肉細(xì)胞具有保護(hù)作用。

機(jī)體氧化與抗氧化過(guò)程處于相互協(xié)調(diào)及的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。這種動(dòng)態(tài)平衡一旦被打破，主要表現(xiàn)為缺血再灌注損傷，大量氧自由基形成、中粒細(xì)胞激活、線粒體膜電位改變、細(xì)胞膜穩(wěn)定性改變、細(xì)胞內(nèi)皮功能失調(diào)等一系列病理生理變化[14]。褪黑素一直以來(lái)被認(rèn)為是一種有效的自由基清除劑[12,15]，同時(shí)褪黑激素能促進(jìn)抗氧化酶如GSH-Px、SOD 和CAT 的活性，從而使其間接發(fā)揮抗氧化劑的功能[16-17]。褪黑素的這些特征有效地減輕了氧自由基引起的組織損傷[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MEL 組中GSH-Px、SOD、CAT 的抗氧化活性顯著高于CS 組，證實(shí)了褪黑素通過(guò)直接清除氧自由基、增加內(nèi)源性抗氧化酶系統(tǒng)的活力而增加對(duì)擠壓綜合征大鼠缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

擠壓綜合征缺血再灌注損傷引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[19]。脂質(zhì)膜上不飽和脂肪酸引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，生成有毒性代謝終產(chǎn)物MDA，其含量能有效地反映脂質(zhì)膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度[20]。

褪黑素由人體松果體分泌，正常人體內(nèi)含有少量的褪黑素，人體內(nèi)含有一定濃度的褪黑素能起到抗氧化作用。其具有較小的毒副作用，目前，沒(méi)有相關(guān)資料顯示使用褪黑素會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用。一項(xiàng)關(guān)于40 名[21]晚期腫瘤患者使用大劑量褪黑素(700 mg/d) 的研究發(fā)現(xiàn)，6 位患者惡性腫塊出現(xiàn)短暫的減小。De La Lastra等[22]利用褪黑素治療動(dòng)物胃部缺血在灌注損傷發(fā)現(xiàn)，20 mg/kg 的褪黑素劑量能起到最有效的抗氧化作用。此外，我們需要進(jìn)一步思考的是褪黑素能否應(yīng)用于災(zāi)害現(xiàn)場(chǎng)擠壓綜合征的治療？因此需進(jìn)一步研究褪黑素的藥效動(dòng)力學(xué)及藥物的毒副作用，來(lái)指導(dǎo)給藥劑量及給藥方式。本研究證實(shí)，褪黑素對(duì)擠壓綜合征骨骼肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，能提高擠壓綜合征模型大鼠的生存率，但褪黑素溶液最佳給藥劑量及給藥途徑仍需我們進(jìn)一步探究。