嚴(yán)宏孟，徐楊林，伊力夏提·艾熱提，戴志偉，孔令明，周建中*

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

馬肉是一種相比于牛、羊肉較低脂肪及膽固醇，而蛋白質(zhì)含量以及不飽和脂肪酸含量相對(duì)較高的肉類[1-2]。食用馬肉能夠有效地促進(jìn)血液循環(huán)、提高人體免疫能力，并且防止產(chǎn)生貧血等癥狀，堪稱食補(bǔ)中的佳品[3]。因馬肉中含有1%的糖原使得其具有一種獨(dú)特風(fēng)味[4]。正是因?yàn)樯鲜鎏攸c(diǎn)，使得馬肉逐步受到了大眾消費(fèi)者的歡迎。發(fā)酵香腸是指由動(dòng)物瘦肉與脂肪經(jīng)絞肉機(jī)絞碎后加入香辛料腌制，隨后經(jīng)過自然或人工添加發(fā)酵劑的條件下進(jìn)行發(fā)酵，烘烤或煮至成熟[5-6]，具有特殊發(fā)酵風(fēng)味[7]，良好的耐貯藏性的一類肉制品[8]?；旌系陌l(fā)酵劑能夠起到互補(bǔ)作用，既能產(chǎn)酸[9]，又能提高發(fā)酵香腸產(chǎn)品品質(zhì)和安全性[10]?，F(xiàn)如今市面上大多是以牛肉、羊肉、豬肉為原料制作的發(fā)酵香腸，品種單一，對(duì)以馬肉為原料制作的發(fā)酵香腸研究甚少。

混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)[11-13]是將若干不同成分的元素重新組成新物品，是一種受特殊條件約束的回歸設(shè)計(jì)方法，只研究各個(gè)成分配制的比例，而與配制總量無關(guān)，相比于其他方法它能有效地減少試驗(yàn)次數(shù)，在數(shù)據(jù)處理計(jì)算以及分析過程中較為簡(jiǎn)易，同時(shí)具有快速得到最優(yōu)配比結(jié)果等優(yōu)勢(shì)[14]。這種方法廣泛應(yīng)用于食品、工業(yè)、醫(yī)藥等方面[15]。安定等[16]研究利用了混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵酸奶中復(fù)配穩(wěn)定劑的配方，得到了相對(duì)穩(wěn)定的產(chǎn)品。依據(jù)GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》來進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，但其中不免有評(píng)定者自身主觀因素，造成一定的非準(zhǔn)確性[17]，基于此現(xiàn)象運(yùn)用模糊數(shù)學(xué)法將一些模糊概念或難以量化的事物用數(shù)學(xué)的方式來進(jìn)行精密的計(jì)算，可填補(bǔ)傳統(tǒng)感官評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)非定量化的漏洞[18]，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多因素影響產(chǎn)品感官的綜合評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)采用混料設(shè)計(jì)法，將馬肉發(fā)酵香腸按照一定配比調(diào)料腌制，隨后根據(jù)混料設(shè)計(jì)列表接種不同配比的菌種來進(jìn)行混合發(fā)酵，試驗(yàn)以發(fā)酵產(chǎn)總酸含量以及用模糊數(shù)學(xué)法去評(píng)價(jià)馬肉發(fā)酵香腸產(chǎn)品得出的分?jǐn)?shù)作為指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行綜合的評(píng)估，通過軟件分析得出產(chǎn)品風(fēng)味最佳時(shí)菌種配比，為實(shí)現(xiàn)馬肉發(fā)酵產(chǎn)品的深加工以及規(guī)模化生產(chǎn)提供了一定的理論和創(chuàng)新性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬肉：新疆遠(yuǎn)航食品有限公司；食用鹽、味精、胡椒粉、孜然粉、白砂糖、十三香、味精、姜粉、料酒：市售；亞硝酸鈉（分析純）：康迪斯化工（湖北）有限公司。

漢遜德巴利酵母菌（Debaryomyces hansenii）1808、木糖葡萄球菌（Staphylococcusxylose）21445：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供；瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus）B25、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）E11、保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物試驗(yàn)室保存。

亞硝酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：東莞市喬科化學(xué)有限公司；MRS培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Binder KB系列生化培養(yǎng)箱：濟(jì)南鑫晟生物技術(shù)有限公司；AVC-4D1超凈工作臺(tái)：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；GF29DA高壓滅菌器：北京天賜科儀商貿(mào)有限公司；101-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：紹興市景邁儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬肉發(fā)酵香腸的工藝流程及操作要點(diǎn)

工藝流程：馬肉預(yù)處理→接種與腌制→灌腸→浸洗→靜置→發(fā)酵→烘烤→蒸煮→包裝

基本配方：原料肉100 g，料酒0.5 g，白糖5 g，食鹽2.2 g，孜然粉0.23 g，白胡椒粉0.1 g，五香粉0.2 g，十三香0.5 g，味精0.1 g，姜粉0.3 g，白胡椒粉0.1 g，孜然粉0.23 g，亞硝酸鹽100 mg/L，大豆分離蛋白2 g。

操作要點(diǎn)：將原料馬肉的瘦肉絞碎，脂肪切成1 cm3大小，按照肥瘦比2∶8進(jìn)行均勻混合，加入白糖、食鹽、香辛料腌制30 min，溫度設(shè)為4 ℃，隨后加入混合發(fā)酵劑與餡料充分接觸混合，再在無菌狀態(tài)下灌腸，肉與腸衣盡量貼緊，并用無菌水擦拭干凈腸衣表面油脂和雜質(zhì)，隨后用無菌針扎孔排出多余的氣體，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵20 h，制備的香腸在65 ℃烘烤條件下2 h后終止發(fā)酵，隨后在蒸煮鍋中水燒開的條件下蒸煮20 min，將產(chǎn)品包裝在真空壓縮袋中。

1.3.2 乳酸菌菌種選擇試驗(yàn)

將活化好的3株乳酸菌按照2%的接種量分別接種到未添加白糖、食鹽、香辛料的純馬肉肉糜中（模擬馬肉香腸發(fā)酵環(huán)境），在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h后加無菌蒸餾水稀釋肉糜并攪拌過濾，將樣品液體稀釋涂布于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定最終馬肉肉糜的活菌數(shù)和總酸含量，結(jié)合兩個(gè)指標(biāo)最終選出1株發(fā)酵性能較好的菌株。

1.3.3 菌種拮抗試驗(yàn)

用接種環(huán)挑取3株菌株的單菌落，兩兩依次交叉劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。試驗(yàn)的培養(yǎng)溫度設(shè)為37 ℃，時(shí)間設(shè)定為15 h，待長(zhǎng)出菌落后，觀察三種菌株劃線的交叉處是否生長(zhǎng)菌落，假如試驗(yàn)菌落不能在兩菌落交叉處生長(zhǎng)，說明菌間有拮抗作用；假如試驗(yàn)菌能在兩菌落交叉處生長(zhǎng)則說明菌間無拮抗，可用于馬肉香腸的發(fā)酵，為進(jìn)一步試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

1.3.4 菌種的耐鹽馴化試驗(yàn)

參考趙強(qiáng)等[19]的方法略作改動(dòng)，首先稱取10 g馬肉制備成無香辛料以及鹽類的馬肉香腸樣品浸提液（全過程均在無菌環(huán)境下進(jìn)行操作），將浸提液作為菌種生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基，內(nèi)部均加入質(zhì)量濃度為100 mg/L的亞硝酸鈉，隨之添加不同梯度濃度（0%、1%、3%、5%）的NaCl，滅菌冷卻備用。吸取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液以1%加入0%NaCl濃度的液體培養(yǎng)基中，在37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)24 h（酵母菌30 ℃、48 h）后進(jìn)行菌落測(cè)定，菌落總數(shù)在108CFU/mL以上時(shí)，即可斜面保存，再次活化進(jìn)行下一梯度的培養(yǎng)，并且培養(yǎng)直至總菌落數(shù)達(dá)到108CFU/mL為止，進(jìn)行儲(chǔ)存，為下一步試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.3.5 菌株混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)

選取3株發(fā)酵性能較好的菌株，使用馴化試驗(yàn)培養(yǎng)至濃度不低于1×108CFU/mL的菌種接種于已添加白糖、食鹽、香辛料的馬肉餡料中，接種量為2%，灌腸后在發(fā)酵溫度30 ℃條件下培養(yǎng)20 h，并以Design-Expert 12.0中Mixture的Simple centroid來進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以產(chǎn)品發(fā)酵產(chǎn)生的總酸含量和模糊數(shù)學(xué)法得到的感官評(píng)分作為響應(yīng)值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到最佳優(yōu)化發(fā)酵菌種的配比。

1.3.6 建立模糊數(shù)學(xué)模型

試驗(yàn)以產(chǎn)品的色澤、氣味、組織狀態(tài)、滋味為因素集U=（色澤U1、氣味U2、組織狀態(tài)U3、滋味U4），以優(yōu)、良、中、差為評(píng)語集V=（優(yōu)V1，良V2，中V3，差V4）[20-21]，得分設(shè)計(jì)80～100分為優(yōu)，60～80分為良，40～60分為中，20～40分為差。設(shè)置權(quán)重集為X={0.2，0.2，0.1，0.5}，其中分別代表顏色20分，氣味20分，組織狀態(tài)10分，滋味50分，合計(jì)100分。模糊關(guān)系評(píng)價(jià)集Y=XR（R為評(píng)價(jià)的次數(shù)除以k，k=10）。最后引入綜合評(píng)分矩陣T來對(duì)評(píng)價(jià)Y進(jìn)行處理，因感官評(píng)價(jià)具有一定差異性，所以取中間量，設(shè)置評(píng)價(jià)等級(jí)集K=｛k1=90，k2=70，k3=50，k4=30｝，最終得到馬肉發(fā)酵香腸的模糊綜合評(píng)價(jià)總分T=Y×K。

感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選擇10位食品專業(yè)研究生作為感官評(píng)分成員，按照GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行培訓(xùn)，小組成員要求對(duì)所有樣品進(jìn)行評(píng)分。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 發(fā)酵馬肉香腸感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of fermented horse meat sausage

續(xù)表

1.3.7 理化指標(biāo)檢測(cè)

活菌數(shù)測(cè)定：根據(jù)GB 4789.2—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[22]，利用稀釋涂布的菌落計(jì)數(shù)方法，將涂布后的培養(yǎng)皿置于37 ℃或30 ℃（依據(jù)不同菌種培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇），培養(yǎng)24 h。

總酸測(cè)定：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸測(cè)定》。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用IBM-SPSS 19和Design-Expert 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳酸菌菌種選擇

三種不同乳酸菌在馬肉香腸發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的總酸含量和總活菌數(shù)如表2所示。由表2所知，三種乳酸菌發(fā)酵的總活菌數(shù)均能夠達(dá)到108CFU/mL，總酸含量均＞6 g/kg。這是由于微生物在發(fā)酵過程中以馬肉香腸中還原糖為繁殖生長(zhǎng)的底物能夠產(chǎn)出酸性物質(zhì)。其中植物乳桿菌E11總活菌數(shù)以及總酸含量最高，分別為4.27×108CFU/mL、6.68 g/kg，均顯著高于其他兩種菌種（P＜0.05）。由于要選擇優(yōu)勢(shì)菌種，能夠充分的利用馬肉中糖類物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，得到優(yōu)質(zhì)的馬肉產(chǎn)品，所以最終本試驗(yàn)所用乳酸菌為植物乳桿菌E11。

表2 不同乳酸菌發(fā)酵馬肉香腸的總酸含量和總活菌數(shù)Table 2 Total acid content and total viable counts of fermented horse meat sausage with different lactic acid bacteria

2.2 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

圖1 菌種拮抗試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Experimental results of strain antagonism

如圖1所示，漢遜德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445、植物乳桿菌E11兩兩劃線交叉點(diǎn)處菌落生長(zhǎng)繁殖狀況良好，菌落間沒有出現(xiàn)抑制兩者周圍菌落生長(zhǎng)的情況，不存在拮抗作用。表明三種菌種彼此之間可在發(fā)酵過程中進(jìn)行正常發(fā)酵，并發(fā)揮菌種自身優(yōu)勢(shì)，可發(fā)酵出品質(zhì)更加優(yōu)越的產(chǎn)品。

2.3 菌種的耐鹽馴化試驗(yàn)結(jié)果

植物乳桿菌E11、漢遜德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445馴化結(jié)果見表3～表5。

表3 植物乳桿菌E11耐鹽馴化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Domestication of Lactobacillus plantarum E11 salt tolerance

表4 木糖葡萄球菌21445耐鹽馴化試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Domestication of Staphylococcus xylose 21445 salt tolerance

表5 漢遜德巴利酵母菌1808耐鹽馴化試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Domestication of Debaryomyces hansenii 1808 salt tolerance

2.4 混料設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

本試驗(yàn)將A（漢遜德巴利酵母菌1808）、B（木糖葡萄球菌21445）和C（植物乳桿菌E11）3個(gè)因素設(shè)為自變量，以2%接種量接種至馬肉肉餡中，灌腸發(fā)酵，30 ℃恒溫培養(yǎng)條下發(fā)酵20h，將發(fā)酵后的總酸含量和感官評(píng)分作為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 12.0軟件中的Mixture的Simple centroid進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果見表6，通過10名感官評(píng)價(jià)人員在相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)16組馬肉發(fā)酵香腸樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出的模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)結(jié)果見表7。

表6 不同菌種配比發(fā)酵馬肉香腸優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of different strain ratio optimization tests for fermented horse meat sausage

表7 不同菌種配比發(fā)酵馬肉香腸的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 7 Sensory evaluation results of fermented horse meat sausage with different strain ratios

2.5 總酸含量和感官評(píng)分模型的建立及方差分析

此試驗(yàn)結(jié)果的二次多項(xiàng)回歸擬合是通過Design-Expert 12軟件得到的，對(duì)總酸含量（Y1）和感官評(píng)分（Y2）分別進(jìn)行回歸模型的建立，回歸模型方程分別如下：

Y1=-0.844 9A+9.40B+5.95C+8.72AB+26.77AC+11.73BC

Y2=77.72A+52.52B+97.32C+54.45AB-15.95AC+43.25BC

總酸含量方差分析結(jié)果見表8。由表8可知，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂酗@著性（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)呈顯著（P=0.000 5）。預(yù)測(cè)的R2值為0.937 5，這與調(diào)整后的R2值0.944 1大體上基本保持一致，能夠說明此模型具有較好的擬合發(fā)酵馬肉香腸總酸含量和菌種配比之間的關(guān)系。通過F值和P值可知，3個(gè)因素之間具有顯著交互作用，對(duì)于總酸含量作用大小順序依次為AC＞BC＞AB，代表A（漢遜德巴利酵母菌1808）、C（植物乳桿菌E11）兩者交互作用對(duì)香腸的發(fā)酵產(chǎn)酸具有較大影響。其他兩組組合之間交互作用次之。

表8 以總酸含量為響應(yīng)值的方差分析結(jié)果Table 8 Results of variance analysis using total acid content as response value

感官評(píng)分方差分析結(jié)果見表9。由表9可知，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵餐瑯泳哂酗@著性（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)顯著（P=0.002 7）。預(yù)測(cè)的R2值為0.961 4，這與調(diào)整后的R2值0.972 3基本保持一致，能夠很好的說明此模型有較好擬合發(fā)酵馬肉香腸感官評(píng)分和菌種配比間的關(guān)系。通過表格F值和P值可知，3個(gè)因素之間具有顯著交互作用，對(duì)于感官評(píng)分?jǐn)?shù)值影響大小的順序依次為AB＞BC＞AC，代表A（1808漢遜德巴利酵母菌）、B（21445木糖葡萄球菌）兩者交互作用對(duì)香腸的感官評(píng)分具有較大影響。其他兩組組合之間交互作用次之。

表9 以模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)分為響應(yīng)值的方差分析結(jié)果Table 9 Results of variance analysis using fuzzy mathematics sensory score as response value

2.6 總酸含量和活菌數(shù)模型交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖分析

圖2 漢遜德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445、植物乳桿菌E11交互作用對(duì)產(chǎn)品總酸含量（A）、模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)分（B）影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between Debaryomyces hansenii 1808, Staphylococcus xylose 21445 and Lactobacillus plantarum E11 on total content (A) and fuzzy mathematics sensory score (B) of products

混料試驗(yàn)中，三元的等高線和響應(yīng)面曲線圖能夠較為直觀的體現(xiàn)出各因素在一定條件下的變化趨勢(shì)和兩兩因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值總酸含量、感官評(píng)分的影響。3個(gè)因素交互作用對(duì)總酸含量、模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)分的影響見圖2，響應(yīng)面呈曲面圖說明三株菌落之間具有交互作用，其中C（植物乳桿菌E11）對(duì)于總酸含量變化影響最大，當(dāng)其水平為0.75時(shí)，總酸量達(dá)到最大10.66 g/kg，而A（漢遜德巴利酵母菌1808）、B（木糖葡萄球菌21445）對(duì)總酸量也有較為顯著的影響。C（植物乳桿菌E11）同樣對(duì)感官評(píng)分影響作用也最大，當(dāng)數(shù)值達(dá)到0.5時(shí)，感官評(píng)分值為最高（88分），說明該水平酸味程度是可以被接受的，同時(shí)香腸整體綜合評(píng)價(jià)也較高，其他兩種菌對(duì)其影響程度較弱。

2.7 發(fā)酵劑配比優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

運(yùn)用軟件最優(yōu)化功能來進(jìn)行菌種配比優(yōu)化試驗(yàn)以及驗(yàn)證試驗(yàn)，并設(shè)定所需最高響應(yīng)值，運(yùn)行軟件后，在給定因素范圍內(nèi)隨機(jī)組合若干組菌種配比并預(yù)測(cè)數(shù)值，最終不斷趨近于理想響應(yīng)值，如表10所示，根據(jù)試驗(yàn)實(shí)際情況以及是否易于操作等因素選出漢遜德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445與植物乳桿菌E11以0.75∶0.75∶0.50配比組合，該試驗(yàn)條件下，總酸含量、感官評(píng)分分別為10.57 g/kg、88.039分，為證明軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的可行性，此組合進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，平均總酸含量為10 g/kg，平均感官評(píng)分為88.05分，二者良好的擬合性說明了模型預(yù)測(cè)可行性，結(jié)果并無明顯差異，說明此軟件進(jìn)行的菌種配比優(yōu)化具有現(xiàn)實(shí)性意義。

表10 各菌種最佳組合及預(yù)測(cè)結(jié)果Table 10 Optimal combinations of various strains and prediction results

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以總活菌數(shù)和總酸量為指標(biāo)，通過菌種選擇試驗(yàn)確定了發(fā)酵乳酸菌菌種為植物乳桿菌E11，并將其與漢遜德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445交叉劃線，三種菌種間無拮抗作用，運(yùn)用模糊數(shù)學(xué)法得到不同配比菌種發(fā)酵香腸的感官評(píng)分，利用軟件混料設(shè)計(jì)優(yōu)化菌種配比，最終選擇菌種最優(yōu)配比為漢遜德巴利酵母菌1808∶木糖葡萄球菌21445∶植物乳桿菌E11=0.75∶0.75∶0.50（V/V）。馬肉產(chǎn)品在此菌種配比水平時(shí)平均總酸含量為10 g/kg，平均感官評(píng)分為88.05分。腸體表面呈明亮棗紅色，具有純正濃郁的發(fā)酵氣味及酸味，切面肉餡緊實(shí)，界面清晰，能夠適宜廣大消費(fèi)者口味，具有普遍接受性，混合發(fā)酵劑的應(yīng)用也為馬肉發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)提供新的理論支撐。