胥 萍，林小靖，付紅偉

(1.浙江大學(xué)自貢創(chuàng)新中心，四川自貢 643000；2.浙江大學(xué)華南工業(yè)研究院，廣東廣州 510000；3.浙江大學(xué)，浙江杭州 310000)

血橙[CitrussinensisL.(Osbeck)]屬于蕓香科柑橘屬甜橙類[1]，果實(shí)含有豐富的活性物質(zhì)，如花色苷、類黃酮、羥基肉桂酸、抗壞血酸等[2-3]?；ㄉ盏暮勘徽J(rèn)為是血橙果實(shí)的重要品質(zhì)指標(biāo)，其抗氧化活性對(duì)人體健康也具有重要意義[4]。血橙中含有的花色苷對(duì)人體健康有益，可以抗癌、預(yù)防糖尿病和心臟病(動(dòng)脈硬化)、抗氧化及抗衰老等[5-6]。大孔樹脂是一類具有大孔結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物吸附劑，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)上的分離純化。大孔樹脂相比于其他的純化方式，具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和大比表面積、吸附速度快、選擇性好、可循環(huán)使用且再生處理經(jīng)濟(jì)環(huán)保、方便制劑成型等優(yōu)勢(shì)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)比較了四種大孔樹脂對(duì)血橙花色苷的吸附分離效果，對(duì)其吸附解吸性能進(jìn)行研究，旨在從中篩選出較為合適的血橙花色苷分離純化樹脂類型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

血橙果實(shí)采摘自四川省資中縣血橙基地。大孔樹脂D101、HPD-300、NKA-9：滄州寶恩化工公司；大孔樹脂AB-8：天津允開公司。檸檬酸、氯化鉀和鹽酸：廣州試劑廠。

紫外可見分光光度計(jì)：島津 UV-1800；搖床：江蘇太倉(cāng)TH2-C-1；pH計(jì)：賽多利斯PB-10。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血橙花色苷粗品制備

將新鮮血橙果實(shí)去皮后打成勻漿，將其置于離心機(jī)4 000 r·min-1離心15 min，取上清液備用，即得血橙花色苷粗品[9]。

1.2.2 pH差示法測(cè)定血橙花色苷含量

參考文獻(xiàn)[9]，采用pH差示法測(cè)定血橙花色苷含量。

準(zhǔn)確稱取1.00 g的各類型大孔吸附樹脂，置于具塞錐形瓶中，加入血橙花色苷粗品20 mL，在25 ℃恒溫條件下以120 r·min-1的轉(zhuǎn)速攪拌3 h。測(cè)定花色苷的含量，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)。吸附平衡后，先用去離子水洗滌2次后，再加入10 mL的50%乙醇到含有1.00 g吸附飽和樹脂的具塞錐形瓶中。在25 ℃恒溫條件下以120 r·min-1的速度震蕩1 h。測(cè)定解吸后的花色苷含量，計(jì)算不同型號(hào)樹脂的吸附率和解吸率。吸附率和解吸率計(jì)算公式如下：

吸附率=(C1-C2)/C1×100%

解吸率=C3/(C1-C2)×100%

上式中，C1為溶液在吸附前的花色苷含量，C2為吸附完全后的花色苷含量，C3為經(jīng)過吸附后解吸液的花色苷含量。

1.2.4 確定血橙花色苷大孔樹脂的最佳吸附時(shí)間

稱取上述試驗(yàn)篩選出的大孔吸附樹脂1.00 g，置于具塞錐形瓶中，加入血橙花色苷粗品20 mL，放于搖床中，震蕩轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，在不同時(shí)間測(cè)定吸附液中血橙花色苷的含量，直至達(dá)到平衡。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2.5 不同濃度乙醇對(duì)大孔吸附樹脂靜態(tài)解吸血橙花色苷影響

稱量1.00 g吸附飽和花色苷的大孔樹脂，分別加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%乙醇洗脫液10 mL，測(cè)定溶液中花色苷的含量。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2.5.2 攻毒。于14日齡將制備的IBDV懸液采用滴眼、刷肛法對(duì)Ⅰ～Ⅳ組試驗(yàn)雞進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為0.5 mL/只。攻毒后24～48 h試驗(yàn)雞均出現(xiàn)典型的IBD癥狀；攻毒后60～72 h出現(xiàn)死亡。通過對(duì)解剖死亡雞的觀察發(fā)現(xiàn)雞的胸肌、腿肌均有血斑，法氏囊和腎臟腫大，觸之堅(jiān)硬，腎臟有尿酸沉積[4]，表現(xiàn)為典型的IBD癥狀，攻毒有效率為100%。

1.2.6 洗脫液pH對(duì)大孔吸附樹脂靜態(tài)解吸血橙花色苷的影響

稱取吸附飽和花色苷的大孔樹脂1.00 g于10 mL pH值分別為1.0、2.0、3.0、4.0和5.0的60%乙醇解吸液中，測(cè)定解吸后的花色苷含量。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2.7 樹脂吸附血橙花色苷泄露曲線的繪制

取10 mL預(yù)處理后的大孔樹脂，濕填料于柱中，然后流速為2 mL·min-1上樣。流出液每10 mL收集1次流份，并測(cè)定每個(gè)流份的吸光值，當(dāng)流出液的花色苷含量達(dá)到上樣液花色苷含量的1/10時(shí)，認(rèn)為已經(jīng)有花色苷泄露，據(jù)此繪制泄露曲線[10]。

1.2.8 大孔樹脂動(dòng)態(tài)解吸體積測(cè)定

量取10 mL預(yù)處理后的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，血橙花色苷粗品上樣于樹脂柱達(dá)到吸附飽和后先用去離子水洗滌，再用60%乙醇洗脫，洗脫流速為2 mL·min-1，每10 mL收集1次流份，并測(cè)定每個(gè)流份的吸光值，據(jù)此繪制洗脫曲線。

1.2.9 血橙花色苷色價(jià)測(cè)定

參照《中國(guó)人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB6718-86》方法測(cè)定血橙花色苷色價(jià)。

1.2.10 血橙花色苷清除DPPH自由基能力測(cè)定

配制 0.06 mmol·L-1DPPH溶液，取5 mL DPPH溶液加入1 mL的待測(cè)溶液，搖勻，避光反應(yīng)30 min。每個(gè)樣品做三個(gè)平行。以去離子水為參比，在518 nm處測(cè)各待測(cè)液的吸光值，然后計(jì)算清除率。

1.2.11 血橙花色苷清除ABTS自由基能力測(cè)定

配制7 mmol·L-1ABTS溶液，加入0.88 mL(14 mmol·L-1)過硫酸鉀溶液，室溫避光靜置過夜，用無(wú)水乙醇稀釋此液至734 nm處測(cè)得的吸光度為 0.70±0.02，即得ABTS工作液。取7.8 mL ABTS工作液加入200 μL的待測(cè)液，搖勻，避光反應(yīng)10 min。每個(gè)樣品做三個(gè)平行。以去離子水為參比，在734 nm處測(cè)各待測(cè)液的吸光值，然后計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種大孔樹脂對(duì)血橙花色苷的靜態(tài)吸附與解吸作用

由表1可以看出，四種大孔樹脂對(duì)血橙花色苷均有一定的吸附作用，樹脂的吸附和解吸性能與樹脂的性質(zhì)和溶質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。其中樹脂D101、HPD-300略高于其余2種樹脂，表明在靜態(tài)吸附階段，D101、HPD-300可以更好地吸附和保護(hù)花色苷，避免花色苷的損失。D101、AB-8大孔樹脂的解吸率較高，分別為65%、64%，說明在該解吸條件下D-101和AB-8相比于另外2種大孔樹脂能釋放更多的花色苷。通過以上分析可見，D101大孔樹脂對(duì)血橙花色苷的吸附和分離效果較好，于是對(duì)D101大孔樹脂進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 血橙花色苷在不同大孔樹脂上的吸附率和解吸率

2.2 大孔樹脂吸附花色苷的時(shí)間

由圖1可見，D101對(duì)血橙花色苷的吸附率在前0.5 h快速增加，1 h后緩慢增加，在2 h左右達(dá)到平衡，說明血橙花色苷在D101大孔樹脂上吸附2 h已經(jīng)達(dá)到了平衡。

圖1 D101大孔樹脂對(duì)花色苷的靜態(tài)吸附作用

2.3 不同解吸液乙醇濃度對(duì)血橙花色苷靜態(tài)解吸的影響

為了選擇合適的解吸溶液，采用不同濃度的乙醇水溶液進(jìn)行了解吸試驗(yàn)。由表2結(jié)果可知，解吸率隨乙醇濃度的增加而增大，在60%濃度時(shí)達(dá)到峰值，然后隨乙醇濃度的增加而減小。因此，選擇60%乙醇水溶液作為花色苷的合適解吸溶液，用于花色苷的動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)。

表2 不同的解吸液乙醇濃度對(duì)血橙花色苷靜態(tài)解吸的影響

2.4 不同解吸液pH對(duì)血橙花色苷靜態(tài)解吸的影響

不同解吸液pH對(duì)血橙花色苷解吸的影響表現(xiàn)為隨著pH值的升高，D101大孔樹脂對(duì)血橙花色苷的吸附率逐漸降低(見表3)，這與較高pH值條件下花色苷的穩(wěn)定性較差有關(guān)。但pH值為1.0、2.0時(shí)的花色苷吸附率相差不多，由于較低的pH值容易使花色苷的糖基發(fā)生水解現(xiàn)象，影響花色苷分子的穩(wěn)定性，吸附率下降，因此選擇pH值2.0最適合。

表3 解吸液pH值對(duì)解吸效果的影響

2.5 上樣體積對(duì)大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附血橙花色苷的影響

D101大孔樹脂對(duì)血橙花色苷的吸附泄漏曲線(見圖2)顯示，D101對(duì)血橙花色苷吸附量隨著上樣溶液體積的增大而增大，流出液體積由1 BV到10 BV的過程中，其吸光值的增加幅度較緩，而當(dāng)流出液體積由10 BV上升到11 BV時(shí)吸光值的增加幅度明顯加大，出現(xiàn)了明顯差異。當(dāng)流出液體積為11 BV時(shí)其吸光值已達(dá)到上樣溶液含量的1/10，即出現(xiàn)泄漏。

圖2 D101大孔樹脂對(duì)血橙花色苷的吸附泄漏曲線

2.6 大孔樹脂動(dòng)態(tài)解吸體積測(cè)定

由圖3可以看出，酸化60%乙醇可洗脫D101大孔樹脂吸附的大部分花色苷，在前1 BV時(shí)即有檢測(cè)到花色苷流出，當(dāng)洗脫體積達(dá)到8 BV時(shí)已洗脫出上樣花色苷總量的96%。

圖3 D101大孔樹脂動(dòng)態(tài)解吸曲線

2.7 純化后花色苷產(chǎn)品色價(jià)測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)D101大孔樹脂純化后，血橙花色苷色價(jià)為48.4，呈現(xiàn)為紅色膏狀物；而未純化的血橙花色苷色價(jià)為0.8，呈現(xiàn)深紅色。

2.8 血橙花色苷清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是穩(wěn)定的紫色自由基，可以用來衡量抗脂質(zhì)氧化能力[11]。由圖4可見，血橙花色苷在濃度為(0.15～1.50 mg·mL-1)的范圍內(nèi)，隨添加濃度的增大，對(duì)DPPH自由基的清除率隨之增大，清除率最高可達(dá)92.7%，IC50為0.437 mg·mL-1。

圖4 血橙花色苷清除DPPH自由基的能力

2.9 血橙花色苷清除ABTS自由基的能力

ABTS為一穩(wěn)定的有機(jī)自由基，對(duì)其清除的能力直接反映出樣品抗氧化能力的大小[11]。由圖5可見，血橙花色苷在濃度為(0.22～1.63 mg·mL-1)的范圍內(nèi)，隨添加濃度的增大，對(duì)ABTS自由基的清除率隨之增大，清除率最高可達(dá)89.2%，IC50為0.680 mg·mL-1。

圖5 血橙花色苷清除ABTS自由基的能力

3 結(jié)論

D101大孔樹脂對(duì)血橙中花色苷具有良好的吸附和解吸能力。吸附和解吸的最佳條件：上樣體積為10 BV，在2 h靜附后，大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附達(dá)到飽和，洗脫溶劑用pH值為2的60%乙醇，洗脫體積為8 BV。純化后的血橙花色苷為深紅色粉末。血橙花色苷具有較好的抗氧化性能，在一定的濃度范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基有一定的清除作用，其作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。