楊 帆，尚炳亮，劉 靜，姚田軍，周幸春，王 禾，張 波

(1.空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院唐都醫(yī)院泌尿外科，西安 710038；2.空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院，西安 710069)

自然殺傷(natural killer，NK)細胞是機體防御腫瘤的第一道防線，因其不需要致敏可直接殺傷腫瘤細胞同時分泌干擾素γ(interferonγ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)及白細胞介素8(Interleukin 8,IL-8)等細胞因子而成為繼T細胞之后最有潛力的腫瘤免疫治療新星[2]。然而，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤局部浸潤的NK細胞功能存在顯著異常并成為促進腫瘤惡性進展的重要因素之一[3]。因此，探索腫瘤逃避NK細胞殺傷的機制成為腫瘤免疫治療領域研究的熱點。

人類白細胞抗原-G(human leukocyte antigen G，HLA-G)屬于非經典HLA Ⅰ類抗原，其分子能夠與β2微球蛋白結合形成類似經典HLA Ⅰ類分子的結構。HLA-G能夠與免疫細胞表面的抑制性受體即免疫球蛋白樣轉錄子(immunoglobulin-like transcript，ILT)2、ILT4以及殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)2DL4等結合而有效抑制CD4+T細胞增殖、NK細胞及CD8+T細胞的殺傷。正常組織中HLA-G僅表達于母胎界面的絨毛外滋養(yǎng)層細胞和胸腺上皮發(fā)揮局部免疫抑制作用。在腫瘤組織中，HLA-G表達顯著升高。在腎癌、肝癌、卵巢癌以及膠質瘤細胞中過表達HLA-G可抑制NK細胞的殺傷，HLA-G中和性抗體可恢復NK細胞對腫瘤細胞的殺傷[10]。研究顯示腫瘤微環(huán)境中的缺氧和白細胞介素1β(Inter-leukin 1β，IL-1β)、干擾素α(interferon α，IFNα)、IFN-γ、白細胞介素6(inter-leukin 6，IL-6)等細胞因子水平增高是導致腫瘤細胞HLA-G表達上調主要主要因素[10]。

線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)是一種由核基因編碼的線粒體轉錄因子，其在線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的復制、轉錄及擬核結構的維持方面發(fā)揮著重要的作用[11-12]。TFAM表達減少會導致mtDNA應激的發(fā)生，主要表現(xiàn)為：線粒體功能異常，mtDNA擬核結構松散同時mtDNA從線粒體內溢出至細胞質被胞質模式識別受體TOLL樣受體9(Toll-like receptor 9,TLR9),環(huán)GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)及炎癥小體NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)等所識別激活免疫相關信號通路導致腫瘤細胞分泌IL-10、IL-1β以及干擾素等細胞因子[13-14]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中TFAM的表達水平存在顯著異常且與腫瘤的惡性進展密切相關，然而其在膀胱癌組織的表達及其是否參與膀胱癌的惡性進展尚不清楚。

本研究首次在膀胱癌組織及癌旁組織中分析了TFAM的表達及其與膀胱癌預后的關系，并進一步分析了TFAM降低通過促進HLA-G分子的表達促進膀胱癌細胞逃避NK細胞攻擊的作用及機制，闡明了膀胱癌細胞免疫逃逸的新機制，有望為膀胱癌免疫治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料膀胱癌組織芯片(KX-BL192a)購自北京龍邁達斯科技開發(fā)有限公司；即用型免疫組化EliVisionTMplus檢測試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；Gibco胎牛血清購自生工生物工程有限公司；UM-UC-3、T24膀胱癌細胞系及NK細胞系購自賽百慷(上海)生物技術股份有限公司；實時熒光定量PCR試劑和試劑盒購自賽默飛世爾科技公司；兔抗人TFAM單克隆抗體(ab176558)、鼠抗人HLA-G單克隆抗體(ab7759)及鼠抗人單克隆抗體(ab8226)均購Abcamb公司；Alexa Fluor?488 Mouse IgG2a抗人HLA-G(400237)及鼠抗人HLA-G中和抗體(335902)均購自Biolegend公司,LDH試劑盒購自江萊生物科技有限公司；熒光共聚焦顯微鏡FV1000和倒置顯微鏡YM310購自Olympus公司；NovoCyte流式細胞儀購自艾森生物有限公司。

1.2 免疫組織化學法檢測膀胱癌組織TFAM蛋白的表達及免疫組化結果評分膀胱癌石蠟組織芯片經二甲苯及由高至低濃度梯度乙醇脫臘；PBS清洗3 min×3次；檸檬酸鈉高壓修復90 s冷卻至室溫；PBS清洗3 min×3次；30 g/L雙氧水室溫孵育15 min祛除內源性過氧化物酶；PBS清洗3 min×3次；山羊血清室溫封閉30 min；一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；甩去一抗PBS清洗5 min×3次；加即用型生物素標記的二抗室溫孵育20 min； PBS清洗5 min×3次；加辣根光氧化物酶標記標記的二抗室溫孵育2 h,DAB顯色；自來水沖洗后加蘇木素孵育5 min,自來水沖洗；5 g/L的鹽酸乙醇分化；淡氨水反藍；由低至高梯度乙醇二甲苯脫水；中性樹膠封片。免疫組化結果由2名病理學專家進行判讀：高倍鏡下(×200)陽性細胞數(shù)除以視野面積為每個視野的平均染色強度，取3個視野的細胞染色強度平均值為每個樣本的平均染色染色強度。

1.3 構建TFAM穩(wěn)定干涉或過表達的膀胱癌細胞系6孔板以5×105個/孔的密度接種膀胱癌細胞；24 h后，將由上海吉瑪公司訂購的TFAM穩(wěn)定干涉及過表達的慢病毒載體按照說明書上的MOI值加入細胞上清中感染膀胱癌細胞；6 h后棄去上清換液成含嘌呤霉素的培養(yǎng)上清，以含嘌呤霉素的培養(yǎng)上清持續(xù)培養(yǎng)1周直至未感染細胞完全死去，繼續(xù)用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)并收集蛋白做Western-blot檢測干涉及過表達的效果。

1.4 qPCR檢測膀胱癌細胞TFAM及HLA-G基因的表達按照商品化試劑盒提取TFAM穩(wěn)定干涉及過表達細胞的總mRNA并按照逆轉錄試劑盒操作逆轉錄生成cDNA；以逆轉錄cDNA為模板以上海吉瑪公司合成的TFAM引物：F-5’-GGCAAGUUGUC CAAAGAAACC-3’R-5’UUUCUUUGGACAACUU GCCAA-3’；HLA-G引物：F-5’CCATGTGGTATTT CAGCGCC-3及R-5’TGTTCCGTGTCTCCTCTTCC-3’。人β肌動蛋白(β-actin)為內參其引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’及5’-GGCT GTTGTCATACTTCTCATGG-3’。按照qPCR商品化試劑盒SYBR Green PCR Kit的說明書操作步驟進行操作。β-actin作為內參基因，采用2-△△Ct法計算目的基因mRNA的含量，每個樣品重復3個孔，實驗重復3次。

1.5 Western-blot檢測膀胱癌細胞TFAM及HLA-G表達取對數(shù)生長期的TFAM穩(wěn)定干涉或過表達的膀胱癌細胞，棄上清PBS洗3遍；濾紙吸干PBS后用RIPA裂解液裂解細胞提取細胞總蛋白；BSA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；加上樣緩沖液煮沸；經SDS凝膠電泳分離蛋白條帶；將蛋白轉移至PDVC膜上；TBST清洗3遍；加封閉液室溫封閉1 h；加一抗(TFAM 1∶1 000，HLA-G 1∶500)4 ℃過夜；TBST清洗5 min×3次；加辣根過氧化物酶標記羊抗鼠兔的二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h；TBST洗5 min×3次；加化學發(fā)光液發(fā)光并使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。每組實驗重復3次以減少實驗誤差。

1.6 流式細胞術檢測膀胱癌細胞膜型HLA-G的表達收集對數(shù)生長期的TFAM穩(wěn)定干涉及過表達的膀胱癌細胞，調整細胞數(shù)為2×106；加PBS洗滌5 min×3次；加多聚甲醛固定；加PBS洗滌5 min×3次；按照空白對照組(不加抗體)，同型對照組(加同型無關抗體)及待測抗體組(抗HLA-G)分別加相關抗體室溫孵育40 min；加PBS洗滌5 min×3次；加熒光標記的二抗室溫孵育30 min；加PBS洗滌5 min×3次；流式檢測。每個樣本3個重復，平均值為其最終檢測值。

1.7 ELISA檢測NK細胞活化相關細胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-8的表達TFAM穩(wěn)定干涉及過表達的膀胱癌細胞與NK細胞共培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)上清,或者在TFAM穩(wěn)定干涉的膀胱癌細胞與在共培養(yǎng)體系中加入IgG及抗HLA-G中和抗體與NK細胞共培養(yǎng)48 h后收集上清，T24 EV及T24 TFAM細胞分別加入PBS及重組HLA-G后與NK細胞共培養(yǎng)48 h后收集細胞培養(yǎng)上清。將以上細胞培養(yǎng)上清加入到包被抗HLA-G的商品化ELISA試劑盒中，按照試劑盒說明書完成ELISA檢測，每個樣本3個復孔其A值的平均值為樣本最終檢測值。

1.8 LDH釋放實驗檢測NK細胞的殺傷將TFAM穩(wěn)定干涉或者過表達的膀胱癌細胞以1×105的密度種至圓底96孔板中；24 h后加入NK細胞，按照效靶比1∶1、5∶1、10∶1以及20∶1的比例共培養(yǎng)，同時設置靶細胞自然釋放組和最大釋放組，每個樣本3個復孔；37 ℃孵育；2 h后取出培養(yǎng)物，吸取各孔上清0.1 mL加于另一培養(yǎng)板孔中，每孔加入新鮮配制的LDH底物溶液0.1 mL，室溫避光反應10～15 min；每孔加入1 mol/L檸檬酸終止液30 μL，以終止酶促反應；用酶聯(lián)檢測儀在570 nm波長下讀取各孔A值，并計算NK細胞活性。

1.9 Picogreen及Mitotracker檢測膀胱癌細胞雙鏈DNA及線粒體的定位將TFAM穩(wěn)定干涉及過表達的膀胱癌細胞接種至6孔板；24 h后棄去培養(yǎng)上清用無血清培養(yǎng)基洗3遍；加1∶1 000稀釋的Picogreen及Mitotracker Red CMXRos 37 ℃孵箱共培養(yǎng)30 min；無血清培養(yǎng)基洗3遍；在激光共聚焦顯微鏡下觀察mtDNA及線粒體的共定位。

2 結 果

2.1 線粒體轉錄因子A在膀胱癌組織中的表達較癌旁組織顯著降低且與膀胱癌患者的預后顯著相關免疫組化檢測膀胱癌及癌旁組織中TFAM的表達，結果顯示：與癌旁組織相比，膀胱癌組織中TFAM表達顯著降低(圖1A)。免疫組化評分結果顯示：膀胱癌組織中TFAM免疫組化評分值為5.589±2.346，顯著低于癌旁組織中TFAM的免疫組化評分值7.321±1.453(圖1B)。根據(jù)膀胱癌組織中TFAM表達水平(免疫組化評分中位數(shù))將膀胱癌患者分為TFAM高表達組和TFAM低表達組。Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示：TFAM低表達越低的膀胱癌患者其總生存期越短，復發(fā)率越高，TFAM表達越高的膀胱癌患者其預后越好，復發(fā)率越低(圖1C、D)。

A：膀胱癌及癌旁組織中TFAM蛋白的表達；B：TFAM表達的免疫組化評分;C：總生存率；D復發(fā)率。圖1 免疫組化檢測TFAM在膀胱癌及癌旁組織的表達水平及其對膀胱癌患者預后的影響

2.2 TFAM下調促進膀胱癌細胞抑制NK細胞的殺傷利用腺病毒載體感染TFAM高表達的膀胱癌細胞株UM-UC-3和TFAM低表達的膀胱癌細胞株T24，成功構建了TFAM穩(wěn)定干涉的膀胱癌細胞株UM-UC-3 shCtrl、UM-UC-3 shTFAM-1、UM-UC-3 shTFAM-2及TFAM穩(wěn)定過表達的膀胱癌細胞株T24 EV及T24 TFAM(圖2A、B)。將TFAM穩(wěn)定干涉及過表達的膀胱癌細胞株與NK細胞共培養(yǎng)48 h后，ELISA檢測培養(yǎng)上清中NK細胞活化相關細胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-8的表達，LDH釋放實驗檢測NK細胞對腫瘤細胞的殺傷。結果顯示與UM-UC-3 shCtrl細胞相比，UM-UC-3 shTFAM-1及UM-UC-3 shTFAM-2細胞與NK細胞共培養(yǎng)后其培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α及IL-8的分泌顯著減少同時NK細胞的殺傷能力顯著降低(圖2C,D左側)。反之，T24 TFAM細胞與NK共培養(yǎng)后，培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α及IL-8等NK細胞因子的分泌水平及NK細胞的殺傷能力較T24 EV組均顯著升高，提示膀胱癌細胞TFAM表達降低能夠抑制NK細胞對其殺傷(圖2C、D右側)。

A：TFAM mRNA的表達；B：TFAM蛋白的表達；C：NK細胞活化相關細胞因子的表達；D：NK細胞殺傷能力。圖2 TFAM表達水平對膀胱癌細胞逃避NK細胞殺傷的影響

2.3 下調TFAM可誘導膀胱癌細胞表達HLA-GqPCR檢測TFAM對HLA-G基因表達的影響，結果顯示：與UM-UC-3 shCtrl相比，UM-UC-3 shTFAM-1及UM-UC-3 shTFAM-2細胞中HLA-G mRNA的表達水平顯著升高；反之，在T24 TFAM細胞中HLA-G mRNA表達水平較對照組T24 EV細胞顯著降低(圖3A)。Western-blot結果在蛋白水平確認：UM-UC-3 shTFAM-1及UM-UC-3 shTFAM-2細胞中HLA-G蛋白的表達較對照組UM-UC-3 shCtrl顯著增高，T24 TFAM細胞中TFAM蛋白表達較T24 EV組顯著減少(圖3B)。流式細胞術進一步檢測模型HLA-G的表達，結果確認：在UM-UC-3 shTFAM-1及UM-UC-3 shTFAM-2細胞中，膜HLA-G表達隨著TFAM表達的敲低而升高，在T24細胞中隨著TFAM的過表達，膜HLA-G的表達減少(圖3C、D)。以上實驗結果提示TFAM表達下調能夠促進HLA-G的表達。

A:HLA-G mRNA的表達；B：HLA-G蛋白的表達；C：細胞膜HLA-G的表達。圖3 TFAM表達水平對HLA-G表達的影響

2.4 TFAM下調通過誘導HLA-G表達促進膀胱癌細胞逃避NK細胞的殺傷腫瘤細胞膜HLA-G表達升高能夠抑制NK細胞的殺傷[10]，因此我們進一步檢測膀胱癌細胞TFAM敲低能否通過促進HLA-G表達抑制NK細胞的殺傷。為驗證此假說我們將TFAM穩(wěn)定干涉的膀胱癌細胞系UM-UC-3 shTFAM-1或UM-UC-3 shTFAM-2與NK細胞共培養(yǎng)，同時在共培養(yǎng)細胞培養(yǎng)上清中加入HLA-G的中和抗體87G以阻斷HLA-G的功能，結果顯示：87G可顯著恢復TFAM干涉導致的NK細胞活化相關細胞因子IFN-γ、TNF-α及IL-8等分泌減少及NK細胞殺傷抑制(圖4A、C)。相反，在TFAM過表達的T24 TFAM細胞與NK細胞共培養(yǎng)基中加入重組可溶性HLA-G(rHLA-G)蛋白后，可顯著抑制TFAM過表達介導的NK細胞殺傷及IFN-γ、TNF-α和IL-8等細胞因子的釋放(圖4B、D)。這些結果均提示TFAM下調可通過上調HLA-G表達介導的膀胱癌細胞逃避NK細胞的殺傷。

A、B：NK細胞活化相關細胞因子的分泌；C、D：NK細胞的殺傷能力檢測。圖4 TFAM通過促進HLA-G表達抑制NK細胞的活化與殺傷

2.5 TFAM表達下調通過誘導線粒體DNA應激促進HLA-G的表達TFAM是維護mtDNA穩(wěn)態(tài)的重要分子，TFAM表達降低能夠誘導mtDNA應激發(fā)生[13]。我們采用雙鏈DNA染料Picogreen和線粒體特異性染料Mitotracker共染膀胱癌細胞中的mtDNA及線粒體結果發(fā)現(xiàn)與UM-UC-3 shCtrl細胞相比，UM-UC-3 shTFAM-1和UM-UC-3 shTFAM-2細胞內線粒體DNA擬核結構顯著變大且松散，同時發(fā)現(xiàn)mtDNA由線粒體外溢至胞質(圖5A)。相反，在T24細胞中過表達TFAM可導致線粒體擬核結構變得緊致，線粒體外溢至胞質減少(圖5B)。分離胞質mtDNA并利用qPCR檢測其拷貝數(shù)結果進一步證實，UM-UC-3 shTFAM-1和UM-UC-3 shTFAM-2細胞胞質mtDNA拷貝數(shù)較UM-UC-3 shCtrl顯著升高；T24 TFAM較T24 EV胞質mtDNA拷貝數(shù)顯著降低(圖5C)。這些結果表明在膀胱癌細胞內干涉TFAM表達可導致mtDNA應激的發(fā)生。將脂質體包裹DNA酶Ⅰ轉染至TFAM 穩(wěn)定干涉的UM-UC-3細胞中以降解TFAM干涉導致的mtDNA應激導致的外溢至胞質中的線粒體DNA(圖5C)，qPCR結果顯示：DNA酶Ⅰ能夠顯著抑制TFAM干涉所誘導HLA-G mRNA表達，Western-blot及流式細胞術進一步在蛋白水平證實，DNA酶Ⅰ可顯著抑制TFAM干涉所導致的HLA-G蛋白的表達增高(圖5D、E)。反之,在TFAM過表達的T24細胞中加入阻斷線粒體呼吸功能的魚藤酮可顯著回復TFAM過表達所導致的細胞質mtDNA拷貝數(shù)減少(圖5C)以及HLA-G mRNA及蛋白的表達減少(圖5D、F)。這些結果均顯示TFAM表達降低是通過誘導線粒體DNA應激來促進HLA-G的表達的。

A、B：線粒體DNA擬核結構以及細胞質線粒DNA；C：細胞胞質線粒體DNA的數(shù)目；D：HLA-G蛋白的表達。E、F：細胞膜HLA-G的表達。圖5 TFAM表達通過誘導線粒體DNA應激促進HLA-G的表達

3 討 論

逃避NK細胞免疫監(jiān)視是腫瘤惡性進展的重要因素之一，但其機制尚不完全清楚。本研究首次發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中線粒體重要轉錄因子TFAM表達較癌旁組織顯著降低且TFAM表達水平與膀胱癌患者的預后顯著相關。干涉膀胱癌細胞中TFAM表達通過上調HLA-G抑制NK細胞殺傷，進一步揭示了TFAM下調通過介導mtDNA應激促進HLA-G表達的機制。

TFAM在腫瘤組織中的表達存在顯著異常且與腫瘤細胞的惡性進展密切相關[15-18]。例如：在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結直腸組織中TFAM基因發(fā)生截斷體突變導致TFAM蛋白水平顯著減少，使得直腸癌細胞變得的凋亡抵抗[19]。在腎癌細胞中干涉TFAM表達可促進腎癌細胞對阿霉素的耐藥[20]?？谇击[狀細胞癌組織中TFAM表達減少導致可導致mtDNA拷貝數(shù)減少引起癌細胞對順鉑耐藥[21]。我們的研究首次利用免疫組化的方法在40對膀胱癌及癌旁組織中檢測了TFAM的表達并進行了統(tǒng)計學分析，結果顯示：膀胱癌組織中TFAM的表達較癌旁組織顯著降低，且TFAM表達越低的膀胱癌患者其預后越差，提示膀胱癌組織中TFAM表達降低參與了膀胱癌的惡性進展。

TFAM是調控mtDNA轉錄復制維護mtDNA拷貝數(shù)及穩(wěn)定的重要調蛋白，干涉TFAM表達可導線粒體功能異常腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)，口腔癌細胞lon蛋白酶通過降解TFAM誘導mtDNA外溢至細胞質促進PD-L1及吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(IDO-1)的表達[22-25]。我們發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細胞中干涉TFAM表達能夠促進HLA-G的表達，HLA-G能夠與NK細胞膜的抑制性受體LIR-2、ILT-4及KIR2DL4結合抑制NK細胞的殺傷功能。此外HLA-G還能夠通過促進HLA-E表達的方式抑制NK細胞的活化。我們首次在膀胱癌細胞中揭示了TFAM表達降低通過促進HLA-G的表達促進膀胱癌細胞抑制NK細胞的殺傷。

HLA-G屬于重要的免疫抑制分子，目前已在黑色素瘤、乳腺癌、非小細胞肺癌、結直腸癌、胃癌、膀胱癌以及膀胱癌等多種腫瘤組織中檢測到HLA-G高表達[9]。腫瘤組織中HLA-G的表達受到表觀遺傳學、缺氧、應激、以及IL-10、干擾素以及IL-1β等細胞因子的調控[10]。TFAM表達下調介導mtDNA應激的發(fā)生其最主要特征為可激活免疫相關信號通路促進INFα及INFβ等Ⅰ型干擾素及IL-1β等細胞因子的分泌[26]。有研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織mtDNA顯著減少，且伴隨IL-1β的顯著升高[25]。我們發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細胞內干涉TFAM表達能夠通過誘導mtDNA應激促進HLA-G的表達。然而本研究中我們僅證實了TFAM誘導線粒體DNA應激通過促進胞質mtDNA來誘導了HLA-G的釋放，具體是通過哪一種炎癥信號通路來激活的需要做進一步的驗證。

綜上，TFAM在前膀胱癌組織中的表達顯著減少，且TFAM表達越低的膀胱癌患者其預后越差，提示TFAM可以作為判斷膀胱癌預后的重要標記物。在膀胱癌細胞中敲低TFAM表達可誘導mtDNA應激上調HLA-G表達來逃避NK細胞的殺傷。本研究以線粒體為視角，揭示了膀胱癌細胞免疫逃逸的新機制為膀胱癌的免疫治療提供了新的潛在靶點。