郭 清，王 龍，黃 猛，李 允

高州市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 高州525200

流感病毒感染后會激活免疫反應(yīng)，適度的炎癥反應(yīng)被激活可能有利于病毒清除［1］，然而，過度激活的炎癥反應(yīng)可能對宿主造成有害影響，如造成重癥肺炎（severe pneumonia，SP）［2］。研究顯示，感染流感病毒后，具有促炎作用的T輔助細(xì)胞17（T helper cells 17，Th17）會增加，而具有抗炎作用的調(diào)節(jié)T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）則會減少，并且隨著病情的加重，Th17/Treg的水平也會升高［3］。而Th17和Treg的分化受到核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的調(diào)控，會激活NF-κB通路，從而使Th17/Treg平衡向Th17偏移，引起促炎因子白細(xì)胞介素17（interleukin 17，IL-17）等的分泌，導(dǎo)致肺組織損傷［4-5］。近年來，中藥在治療流感和SP中取得了良好的臨床療效。復(fù)方芩蘭口服液具有清熱解毒的作用。最新研究［6］證實，其對感染性肺損傷具有較好的治療作用，但是藥物的調(diào)控機制尚不清楚。本研究通過動物實驗，主要基于NF-κB通路探討復(fù)方芩蘭口服液對流感病毒感染致SP小鼠炎性因子及免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 毒株與動物H1N1毒株（PR8）（美國典型培養(yǎng)物保藏中心，批號：HCoV-229E）；BALB/c小鼠，雌性，共60只，8～12周齡，由上海斯萊克實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（京）2018-002。飼養(yǎng)條件：ABSL-2生物安全實驗室，溫度22～26℃，日溫差≤4℃，濕度40%～70%，喂食小鼠維持飼料，自由飲水、攝食。

1.2 試藥及儀器復(fù)方芩蘭口服液（黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20026049，規(guī)格：10 mL/支）；HE試劑盒（碧云天公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：257403）；逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒（瑞士Roche公司，批號：04897030001）；RIPA裂解緩沖液（Beyotime，批號：P0013K）；BCA試劑盒（武漢博斯特生物技術(shù)有限公司，批號：266117）；anti-NF-κB和anti-RelB（Abcam公 司，批 號：HK5704）；PVDF膜（Bio-Rad公司，批號：AMM05633 G）；ELISA試劑盒（碧云天公司，批號：S0026B）；小鼠Treg/Th17表型抗體試劑（Becton Dickinson公司，批號：AM00401）。顯微鏡（Olympus公司）；流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson公司）；免疫磁珠（Invitrogen公司）；勻 漿 機（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 動物處理將60只小鼠分為對照組、模型組和觀察組，每組20只。模型組和觀察組根據(jù)參考文獻［7］構(gòu)建流感病毒感染的SP模型。使用80 μg/kg的氯胺酮和10 μg/kg的甲苯噻嗪麻醉小鼠，通過氣管內(nèi)遞送50 μL的H1N1，H1N1滴度為100 LD50。對照組小鼠滴入等量的溶劑。在滴入H1N1第二天觀察組使用復(fù)方芩蘭口服液灌胃［8］，根據(jù)人體口服復(fù)方芩蘭口服液的劑量，利用人和小鼠體質(zhì)量換算方法，計算得到復(fù)方芩蘭口服液的干預(yù)劑量為22 mL/kg，每日1次，連續(xù)7天。其他兩組小鼠使用等量的生理鹽水灌胃。干預(yù)后模型組共有2只小鼠死亡，而對照組和觀察組隨機在20只小鼠中選擇18只采集樣本進行后續(xù)研究。通過眼眶取血獲得血液樣本，小鼠經(jīng)過頸脫臼處死。本次研究的動物實驗經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 肺指數(shù)及HE染色檢測肺組織損傷小鼠處死前稱質(zhì)量，處死后取出肺組織，擦干表面組織液后稱質(zhì)量。首先計算肺指數(shù)（全肺質(zhì)量與體質(zhì)量之比×100%）。在室溫下用4%多聚甲醛中固定過夜，然后室溫下通過梯度濃度的乙醇（80%持續(xù)2 h，90%持續(xù)2 h，95%過夜，100%分別持續(xù)0.5、0.5、1.0 h處理后包埋在石蠟中。然后將石蠟包埋的樣品切成4 μm的切片，用Mayer′s蘇木室溫下精染色10 min，洗去染色液后加入0.5%曙紅水溶液室溫下染色3 min。細(xì)胞核和其他酸性結(jié)構(gòu)被染成藍(lán)色，而細(xì)胞質(zhì)被染成紅色。使用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4.2 ELISA檢測炎性因子水平將血液樣本以離心半徑：15 cm，2000 r/min離心20 min收集上層清液，根據(jù)試劑盒說明書分別加入抗體和顯色劑，然后通過酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算白細(xì)胞介素1β（interlenkin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interlenkin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的濃度。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17/Treg將脾臟中細(xì)胞經(jīng)過密度梯度離心分離淋巴細(xì)胞，將淋巴細(xì)胞懸浮液重懸，加入20 μL預(yù)冷的1×BD Mouse Foxp3緩沖液在黑暗、4℃的條件下固定30 min。洗去固定液離心并收集細(xì)胞。在細(xì)胞中加入200 μL通透緩沖液，并將細(xì)胞在37℃下避光孵育30 min。洗滌后加入20 μL的小鼠Treg/Th17表型抗體試劑或?qū)φ湛贵w在室溫下孵育30 min。然后將抗體清洗干凈后，將細(xì)胞重懸并通過FACS Calibur流式細(xì)胞儀進行分析Th17和Treg的百分比。

1.4.4 qPCR檢測mRNA小鼠處死后收集脾組織，通過qPCR檢測Th17轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA和Treg轉(zhuǎn)錄因子FOXP3 mRNA的水平，以及NF-κB通路中關(guān)鍵基因NF-κB、RelB mRNA的水平。通過TRIzol獲得總mRNA，分別通過PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄（37℃/15 min，85℃/5s）和qPCR（95℃/5 min，95℃/30 s/40個循環(huán)，65℃/45 s）。GAPDH作為內(nèi)源參照。通過qPCR分析mRNA的相對表達(dá)水平。

1.4.5 Western blot檢測蛋白根據(jù)文獻［9］將脾組織裂解為單個細(xì)胞，中細(xì)胞通過密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞，使用免疫磁珠分離淋巴細(xì)胞。將淋巴細(xì)胞勻漿后萃取總蛋白，蛋白濃度通過BCA試劑盒測量。分別取總量為30 μg的總蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳（80～120 V，90 min）。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進行濕轉(zhuǎn)移。在5%牛血清白蛋白中于室溫孵育1 h。加入anti-NF-κB和anti-RelB添加到分離的蛋白質(zhì)中，并在4℃下孵育過夜，洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h，然后加入化學(xué)發(fā)光試劑進行顯影，GAPDH作內(nèi)部參考，用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件，計量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較進行單因素方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺指數(shù)肺指數(shù)模型組為（16.95±1.47）mg/g，觀察組為（11.20±1.45）mg/g，均高于對照組（7.02±0.94）mg/g；模型組、觀察組均高于對照組（P＜0.05），模型組高于觀察組（P＜0.05）。

2.2 小鼠肺組織損傷程度對照組肺組織一切正常。模型組肺組織出現(xiàn)廣泛的肺部損傷，包括毛細(xì)支氣管上皮細(xì)胞脫落，并有明顯的出血和炎性浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)基本喪失。與模型組比較，觀察組炎性反應(yīng)等情況明顯緩解，可觀察到基本的肺泡結(jié)構(gòu)。見圖1。

圖1 各組小鼠肺損傷組織程度病理表現(xiàn)（HE×200）

2.3 小鼠Th17/Treg水平模型組Th17和Th17/Treg顯著高于對照組（P＜0.05），而Treg顯著低于對照組（P＜0.05）；觀察組Th17和Th17/Treg顯著低于模型組（P＜0.05），而Treg顯著高于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠Th17/Treg水平比較（）

表1 各組小鼠Th17/Treg水平比較（）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示模型組比較，P＜0.05

Th17/Treg 0.67±0.75*#0.29±0.35 1.63±0.21*組別觀察組對照組模型組鼠數(shù)18 18 18 Th17（%）5.23±0.75*#2.80±0.38 7.14±0.94*Treg（%）7.79±1.01*#9.52±0.92 4.38±0.64*

2.4 小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平IL-1β、IL-6、TNF-α水平模型組、觀察組顯著高于對照組（P＜0.05），觀察組顯著低于模型組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠炎性因子水平比較（） pg/mL

表2 各組小鼠炎性因子水平比較（） pg/mL

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示模型組比較，P＜0.05

TNF-α 83.31±10.42*#61.58±4.23 124.66±11.39*組別觀察組對照組模型組鼠數(shù)18 18 18 IL-1β 55.03±6.72*#43.62±4.29 75.48±8.35*IL-6 60.24±8.45*#40.82±4.56 84.56±9.57*

2.5 小鼠RORγt、FOXP3 mRNA，NF-κB、RelB mRNA及蛋白表達(dá)與對照組比較，模型組、觀察組RORγt mRNA，NF-κB、RelB mRNA及蛋白水平均高于對照組（P＜0.05），F(xiàn)OXP3 mRNA水平低于對照組（P＜0.05）；觀察組RORγt、NF-κB、RelB mRNA及蛋白水平顯著低于模型組（P＜0.05），F(xiàn)OXP3 mRNA水平高于模型組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠脾組織中RORγt、FOXP3 mRNA及NF-κB、RelB mRNA和蛋白水平比較（）

表3 各組小鼠脾組織中RORγt、FOXP3 mRNA及NF-κB、RelB mRNA和蛋白水平比較（）

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示模型組比較，P＜0.05

組別觀察組對照組模型組RelB 1.52±0.15*#0.82±0.08 3.04±0.27*鼠數(shù)18 18 18 RORγt mRNA 4.02±0.41*#2.34±0.21 6.85±0.65*FOXP3 mRNA 3.35±0.35#3.46±0.31 1.23±0.13*NF-κB mRNA 2.79±0.30*#1.38±0.14 5.24±0.51*RelB mRNA 3.02±0.31*#1.22±0.12 5.16±0.49*NF-κB 1.20±0.13*#0.76±0.08 2.98±0.27*

3 討論

由H1N1等病毒感染引發(fā)的流感是世界范圍內(nèi)的衛(wèi)生問題，會引起大流行性急性呼吸道疾病。一些嚴(yán)重的患者可能會發(fā)展為急性肺損傷，甚至出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征，這是感染了H1N1的患者最常見的死亡原因［10］。研究表明，許多傳統(tǒng)中藥具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒和抗氧化活性。臨床試驗也評估了中醫(yī)中藥在治療H1N1引起的SP中的潛在益處。使用中藥治療H1N1引起的SP是一種有前景的治療方法。

復(fù)方芩蘭口服液，具有辛涼解表之功效，研究已經(jīng)證實其對冠狀病毒肺炎有治療作用［11］。本研究通過H1N1感染構(gòu)建SP小鼠模型，并通過HE染色驗證了建模結(jié)果，建模后使用復(fù)方芩蘭口服液灌胃小鼠，結(jié)果顯示干預(yù)后小鼠的肺指數(shù)和肺損傷程度得到了顯著的緩解，并且可以明顯地抑制血清炎性細(xì)胞因子的水平。

復(fù)方芩蘭口服液由金銀花、黃芩、連翹、板藍(lán)根等藥物組成，研究顯示金銀花不但具有抗病毒的作用［12］，還可以直接抑制氧化應(yīng)激引起的炎性反應(yīng)［13］。以黃芩、連翹為主要成分的中藥均可以明顯地緩解感染造成的肺損傷［14］?，F(xiàn)代中藥藥理學(xué)分析表明，連翹和板藍(lán)根在呼吸道病毒感染的治療中具有重要作用［15］。這提示對于H1N1感染引起的SP小鼠，復(fù)方芩蘭口服液可以顯著地緩解炎性反應(yīng)，并保護肺組織。

在病毒感染的早期通常不給予抗病毒藥物，而宿主免疫反應(yīng)是治療流感的重要手段，病毒會激活機體的細(xì)胞免疫，輕微的炎性反應(yīng)有助于宿主對病毒的吞噬和清除。若發(fā)生大量病毒感染，則會引起過度的炎性反應(yīng)，激活并引起“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，這不但會直接引起肺組織的損傷，引起炎性浸潤［16］。Th17/Treg的失衡在過度炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究顯示，病毒感染會直接激活NF-κB通路，而NF-κB通路的激活會促進淋巴細(xì)胞向Th17分化并抑制向Treg分化，誘導(dǎo)Th17分泌大量的促炎因子加劇肺損傷［10］。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)方芩蘭口服液可以顯著抑制Th17水平并促進Treg的分化，使Th17/Treg向Treg偏移。此外，復(fù)方芩蘭口服液也會明顯抑制淋巴細(xì)胞中NF-κB通路中NF-κB和RelB mRNA和蛋白的表達(dá)水平。有研究［17］顯示，金銀花提取物具有抗氧化和抗炎活性，從而保護胃黏膜。研究表明，復(fù)方芩蘭口服液中活性物質(zhì)具有調(diào)控NF-κB信號的作用；金銀花提取物可以通過抑制BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-κB信號傳導(dǎo)，從而抑制脂多糖刺激的炎癥反應(yīng)［18］。而黃芩活性物質(zhì)不但可以抑制肺泡上皮細(xì)胞中的NF-κB通路，緩解LPS誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)［19-20］，還可以調(diào)控過敏性哮喘小鼠Th17/Treg的平衡，緩解肺部癥狀［21］。這提示復(fù)方芩蘭口服液中的活性物質(zhì)可以通過抑制NF-κB通路并調(diào)節(jié)RORγt和FOXP3的轉(zhuǎn)錄水平，進而調(diào)控淋巴細(xì)胞分化，使Th17/Treg平衡向Treg偏移，進而抑制免疫炎性反應(yīng)，緩解肺損傷。

綜上所述，復(fù)方芩蘭口服液可以通過抑制NF-кB通路誘導(dǎo)Treg而抑制Th17，從而調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)，緩解由流感病毒引起的SP。關(guān)于復(fù)方芩蘭口服液治療流感病毒引起的SP仍需要臨床實驗證實，其中的有效化合物和作用機制值得深入探究。