葛文輝，趙敏敏,，高燕平，游媛，任琦，蔡靖波

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004

植物無尾果（Coluria longifoliaMaxim.）為薔薇科無尾果屬，產(chǎn)于我國西藏、青海、甘肅、云南、四川地區(qū)，是我國常用藏藥熱袞巴藥材原植物之一，具有止血止痛、清熱作用［1-2］。無尾果植物中含有黃酮類化合物、木脂素類化合物、三萜類化合物、植物甾醇類化合物等，可鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱，用于類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療［3-10］。目前，對無尾果的研究報道甚少，且無相關(guān)質(zhì)量標準。本文以槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷為指標成分,運用高效液相色譜法對其含量進行測定，建立可用于無尾果內(nèi)在質(zhì)量控制的有效方法。

1 材料

1.1 儀器

戴安Ultimate 3000 系列高效液相色譜儀（美國賽默飛公司），Sartorius BP211D 型電子天平（德國賽托利斯集團），ML-204T 電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 試藥

無尾果藥材（貴州，批號：20201027、1907139、1907157、20200805、20200806、2020、DY），槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷（批號：CFS202101，98%）對照品購自ChemFaces，乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（15∶85）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。色譜圖見圖1～3。

圖1 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對照品HPLC色譜圖

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖

圖3 甲醇空白HPLC色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的配制 稱適量槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻得到對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取無尾果粉末（批號：20201027，過四號篩）約0.25 g，精密稱定。取甲醇50 mL，放入錐形瓶內(nèi)一同稱重，在水浴鍋上加熱回流30 min，冷卻后再稱重，用相同試劑補重，搖勻后進行過濾，續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2.3 空白樣品溶液 取甲醇溶液作為空白樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 用十萬分之一天平精密稱取槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對照品8.66 mg，置10 mL的量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即為對照品溶液的母液。再將母液稀釋14 倍后制成稀釋液，按以上色譜條件分別吸取稀釋液1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，12 μL 進行峰面積的測定。以吸取量X（μg）為橫坐標，對應的峰面積Y 為縱坐標，繪制槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷標準曲線，得回歸方程式：Y=1 064.9X+1.545 5，r=0.999 7，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷在0.061 9～0.742 3 μg 之間線性關(guān)系良好。對照品標準曲線見圖4。

圖4 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷標準曲線

2.3.2 重復性試驗 批號相同的無尾果樣品取6 份，每份重約0.5 g，通過以上相同的制備方法和色譜條件得到6份無尾果供試品溶液并對其分別進行測定，計算無尾果中黃酮苷類成分槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量的RSD 為0.6%。說明無尾果樣品按此法進行試驗，有良好重復性。

2.3.3 耐用性試驗 將無尾果重復性試驗其中的2 份供試品溶液，用SVEA、YMC、資生堂三種不同品牌的C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱按以上色譜條件分別進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種品牌C18 色譜柱的測定結(jié)果并無明顯差異。

2.3.4 精密度試驗 根據(jù)以上色譜條件將無尾果藥材的供試品溶液持續(xù)6 次取樣，每次10 μL，對其峰面積進行測定，計算RSD 為0.43%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h不同時間內(nèi)，分別吸取同份無尾果藥材的供試品溶液10 μL，記錄槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的峰面積，得其峰面積的RSD=0.23%，表明24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.3.6 回收率試驗 取已知含量的無尾果藥材粉末（過四號篩）6 份，每份約0.125 g，精密稱定。加入槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對照品1.5 mg，按以上制備方法和色譜條件得無尾果供試品溶液并對其進行含量測定，計算槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的回收率。結(jié)果顯示其平均回收率（n=6）為101.5%，RSD 為2.0%，回收率試驗結(jié)果見表1。

表1 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷回收率試驗結(jié)果

2.4 樣品含量測定

按以上制備方法和色譜條件得到不同批次無尾果藥材的供試品溶液，并且分別進行峰面積測定，根據(jù)測定數(shù)據(jù)計算出無尾果中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量，測定結(jié)果見表2。

表2 無尾果中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量

3 討論

3.1 檢測波長的確定

取槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷對照品溶液，空白為甲醇溶液，紫外吸收波長在200～400 nm 范圍內(nèi)對槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷進行掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長為353 nm，參照文獻報道選擇360 nm，結(jié)合樣品360 nm 波長下雜峰對目標峰無干擾且穩(wěn)定，故以360 nm 作為檢測波長。

3.2 提取方法的考察

取樣品粉末（批號為：20201027）2 份，各約0.25 g，放入錐形瓶，用胖肚吸管量取50 mL 甲醇，置瓶中，將其進行稱重，分別用超聲（功率250 W，頻率25 kHz）和加熱回流2 種不同的提取方法，時間均為30 min，取出放冷后再次稱重，缺少的重量滴加甲醇補足，搖勻后進行過濾，供試品溶液為續(xù)濾液。采用以上色譜條件，發(fā)現(xiàn)加熱回流提取方法所得溶液的槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量較超聲提取方法高，故選擇加熱回流提取方法。

3.3 溶劑用量考察

取同一批樣品3 份，各約0.25 g，倒入錐形瓶，用胖肚吸管分別吸取25 mL、50 mL、75 mL 純甲醇至錐形瓶中，稱重，均加熱回流30 min，取出放冷后再次稱重，純甲醇補重，震蕩均勻后過濾，供試品溶液為續(xù)濾液，根據(jù)以上色譜條件測定。結(jié)果表明，加入甲醇50 mL 和75 mL 提取槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸無明顯差異，故選擇提取溶劑用量為50 mL。

3.4 提取溶劑的考察

取同一批樣品3 份，各約0.25 g，放入4 個錐形瓶內(nèi)，分別用胖肚吸管取乙醇、50%甲醇、70%甲醇和甲醇50 mL，加入到錐形瓶，稱重，回流提取30 min，取出放冷后再次稱重，分別用相對應濃度的試劑進行補重，震蕩后過濾，取其續(xù)濾液為供試品溶液。采用以上色譜條件，分別進行測定。發(fā)現(xiàn)使用70%甲醇的無尾果樣品提取率最高，故以70%甲醇為提取溶劑。

3.5 提取時間的考察

取同一批樣品4 份，各約0.25 g，放入4 個錐形瓶內(nèi)，用胖肚吸管取70%的甲醇50 mL，加入到錐形瓶一同稱重，分別加熱回流20 min、30 min、60 min、90 min，取出放冷后再次稱重，滴加70%甲醇，補重后震蕩，混勻后過濾，供試品溶液為續(xù)濾液，按以上色譜條件測定。結(jié)果表明：30 min 后隨著回流時間增加，含量基本不變，故選擇提取時間為30 min。

3.6 方法評價

根據(jù)7 批樣品含量測定結(jié)果的差異性可得，建立的無尾果中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量測定方法，具有簡便、準確可靠、穩(wěn)定性及重復性良好的優(yōu)點，能較好地控制其內(nèi)在質(zhì)量，為無尾果的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。